Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Obrazowanie bioluminescencyjne nadekspresji hejmoooksygenazy-1 podczas procedury Gua Sha

13.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/1385

⸱

28 sierpnia 2009

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Radiology, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, 2Athinoula A. Martinos Center for Biomedical Imaging, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, 3Gastrointestinal Unit, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, 4Department of Medicine, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, 5Center for biotechnology and Informatics, The Methodist Hospital Research Institute, 6Department of Radiology, The Methodist Hospital, Weill Cornell Medical College, 7Bejing University of Chinese Medicine, 8Department of Health Technology and Informatics, The Hong Kong Polytechnic University, 9Department of Radiology, Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School

W tym artykule

Podsumowanie

Gua Sha, tradycyjne chińskie terapeutyczne skrobanie skóry, powoduje podskórne wynaczynienie krwi z mikrokrążenia. Przedstawiamy protokół obrazowania bioluminescencyjnego transgenicznych myszy HO-1-luciferase, aby wykazać, że Gua Sha zwiększa ekspresję hemooksygenazy-1 (HO-1) w wielu narządach.

Streszczenie

Gua Sha to tradycyjna chińska terapia ludowa, w której stosuje się skrobanie skóry w celu wywołania podskórnego pozanaczyniowego wylewu krwi i siniaków. Protokół obrazowania optycznego bioluminescencyjnego HO-1-lucyferaza myszy transgeniczne opisane w niniejszym manuskrypcie zapewniają szybkiin vivoanaliza zwiększenia ekspresji genu syntazy tlenku hemu-1 (HO-1) w odpowiedzi na procedurę Gua Sha. Od dawna wiadomo, że HO-1 zapewnia cytoprotekcję przed stresem oksydacyjnym. Przyjmuje się, że zwiększenie ekspresji HO-1, oceniane na podstawie emisji bioluminescencji, reprezentuje odpowiedź przeciwutleniającą na krążące produkty hemoglobiny uwalniane podczas Gua Sha. Procedurę Gua Sha przeprowadzano poprzez powtarzalne pociągnięcia gładką krawędzią łyżki po nasmarowanej skórze pleców lub innej docelowej części ciała myszy transgenicznej, aż do zaobserwowania wybroczyn (krwotoków punktowych) lub sińców wskazujących na wynaczynienie krwi z naczyń włosowatych skóry. Po wykonaniu Gua Sha, sesje obrazowania bioluminescencyjnego przeprowadzano codziennie przez kilka dni, aby śledzić dynamikę ekspresji HO-1 w wielu narządach wewnętrznych.

Protokół

  1. Samicze HO-1-lucyferaza myszy transgeniczne (w wieku od 4 do 6 tygodni) można nabyć z firmy Taconic Farms, Inc. Po dostarczeniu, Myszy umieszcza się w pomieszczeniu zoologicznym na co najmniej 4 dni w celu aklimatyzacji.
  2. Przygotowanie do obrazowania bioluminescencyjnego:
    1. Zważ każdą mysz HO-1. Masa ciała zwierzęcia jest niezbędna do obliczenia dawki lucyferyny.
    2. Usuwanie owłosienia: Za pomocą patyczka higienicznego nanieś depilator Nair® na brzuch i/lub grzbiet zwierzęcia. Odczekaj od 5 do 10 sekund. Użyj czystego patyczka higienicznego, aby usunąć włosy. Namocz kawałek chusteczki w wodzie destylowanej i przemyj skórę, aby usunąć pozostałe włosy.
    3. Umieść niefluorescencyjny czarny papier (papier Strathmore Artagain® black paper) na platformie obrazowania stacji IVIS 100, aby zredukować szum tła.
    4. Przygotować roztwór lucyferyny (firmy Xenogen Corporation) o stężeniu 7,5 mg/ml (rozpuszczonej w sterylnym H2O). Dawka lucyferyny wynosi 65,5 mg/kg masy ciała. Zatem mysz o masie 20 gramów wymaga wewnątrzbrzusznego wstrzyknięcia 0,175 ml roztworu lucyferyny. W tym celu pojedynczą objętość roztworu lucyferyny (0,175 ml) pobiera się do strzykawki z igłą o rozmiarze 26G.
  3. Procedura Gua Sha: Procedurę Gua Sha stosuje się tylko raz przed przeprowadzeniem protokołu obrazowania bioluminescencyjnego. Ponieważ Gua Sha nie wywołuje bólu, mysz wymaga jedynie krótkiego znieczulenia izofluranem w celu zapewnienia spokoju. Procedura Gua Sha obejmuje następujące kroki:
    1. Nanieś kilka razy w ciągu procedury Gua Sha olej do smażenia lub wodę destylowaną w celu nawilżenia obszarów skóry poddawanych zabiegowi.
    2. Wielokrotnie zdrapuj obszar bez włosów na grzbiecie myszy, wywierając delikatny, lecz stanowczy nacisk za pomocą ceramicznej łyżki do zupy lub łyżki plastikowej.
    3. Skrobanie kontynuuje się do momentu, aż skóra grzbietu stanie się czerwona, co świadczy o podskórnym wynaczynianiu krwi; zazwyczaj osiąga się to w ciągu 2 do 3 minut.
  4. Obrazowanie bioluminescencyjne można rozpocząć natychmiast lub kilka godzin po zabiegu Gua Sha, ponieważ zwiększenie ekspresji HO-1 narasta powoli w ciągu kilku godzin. Procedura obrazowania bioluminescencyjnego przebiega następująco:
    1. Zanurz mysz w narkozie w komorze indukcyjnej wypełnionej mieszaniną izofluranu (1,5%) i powietrza medycznego.
    2. Po znieczuleniu myszy należy przenieść ją do komory obrazowej stacji obrazowania optycznego IVIS 100. Umieścić mysz w pozycji złotej (brzuchem do góry). Komora obrazowa jest stale nasycana 1,5% izofluranem. Platforma obrazująca jest podgrzewana do 37°C aby utrzymać mysz w cieple.
    3. Ustaw akwizycję obrazowania na „medium binning” (średnie binowanie) i ustaw czas ekspozycji na 30 sekund. Rozpocznij akwizycję obrazów. Ustaw urządzenie tak, aby powtarzało akwizycję obrazowania co trzy minuty, ręcznie lub automatycznie. Po uzyskaniu pierwszego obrazu należy wyznaczyć obszar zainteresowania (ROI), obejmujący obszary brzucha, klatki piersiowej i głowy. Następnie ten ROI jest kopiowany i wklejany do kolejnych obrazów przy użyciu oprogramowania Living Image®, dołączonego do stacji IVIS 100.
    4. Intensywność sygnału jest mierzona w fotonach na sekundę. Należy odnotować czas, w którym intensywność sygnału osiągnie wartość maksymalną, a następnie kontynuować obrazowanie myszy przez około 5 do 10 minut po tym czasie.
    5. Po zakończeniu akwizycji obrazów w pozycji wygrzbietowej, odwróć mysz i połóż ją w pozycji brzusznej (grzbietem do góry). Kontynuuj obrazowanie zwierzęcia przez 5 do 10 minut, wyznaczając w oprogramowaniu „Living Image®” obszar ROI tak, aby obejmował on plecy i okolice głowy. Wybór kolejności obrazowania w pozycji brzusznej po pozycji wygrzbietowej jest dowolny. W zależności od głównych organów będących przedmiotem zainteresowania, można zdecydować się na rozpoczęcie od pozycji brzusznej. Inną opcją jest obrazowanie w pozycji wygrzbietowej i brzusznej podczas osobnych eksperymentów.
    6. Po zakończeniu akwizycji obrazów w pozycji brzusznej należy wyłączyć izofluran i przenieść mysz z komory obrazowania do komory indukcyjnej w celu wybudzenia. Komora indukcyjna jest w tym czasie przepływana wyłącznie powietrzem medycznym, a mysz zazwyczaj budzi się w czasie krótszym niż jedna minuta.
    7. Zapisz dane obrazowania do późniejszego przetwarzania.
    8. Po wstępnym badaniu obrazowym, przez kilka dni po zabiegu Gua Sha przeprowadzane są dodatkowe akwizycje obrazów. Przykładowy harmonogram obejmuje powtórne obrazowanie w 12.th godzina, 24th godzina, 36th godzina, 48th godzina, 72nd godzina i 120th godzinę, jednak dokładny harmonogram obrazowania jest elastyczny. Można dodać dodatkowe sesje obrazowania, jeśli wymagana jest dłuższa obserwacja. Przed obrazowaniem należy powtórzyć procedurę usuwania włosów, jeśli odrosły one ponownie.
  5. W przypadku grupy kontrolnej należy powtórzyć całą procedurę, z pominięciem etapu Gua Sha (krok 3). Jeśli ta sama grupa myszy jest wykorzystywana zarówno do grupy kontrolnej, jak i do grupy Gua Sha, eksperyment kontrolny powinien zostać przeprowadzony najlepiej przed procedurą Gua Sha lub co najmniej miesiąc po niej.

Reprezentatywne wyniki:

Obrazy bioluminescencyjne na rysunku 1 pokazują zwiększenie ekspresji in vivo HO-1 w odpowiedzi na Gua Sha. Wykres na rysunku 2 przedstawia ilościową zmianę czasową w ciągu 120 godzin strumienia optycznego (fotony/sek) z całego ciała tej samej myszy w związku z Gua Sha...

Obrazowanie bioluminescencyjne, wyniki eksperymentalne, modele mysie, kwantyfikacja fluorescencji, skala kolorystyczna.
Rycina 1. Od lewej do prawej: reprezentatywne obrazy widoku przedniego (grzbietowego) tej samej myszy odpowiednio przed zabiegiem Gua Sha oraz 18, 36 i 120 godzin po zabiegu Gua Sha. Po zabiegu Gua Sha obserwuje się postępujący i znaczny wzrost intensywności sygnału w wielu organach, obejmujący obszary przewodu pokarmowego, dróg rodnych, wątroby, nerek (widok z tyłu, niewykazany) i innych. Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję ryciny 1.

Wykres szybkości emisji fotonów w czasie; analiza danych badania fotonicznego; zaznaczone punkty czasowe.
Rycina 2. Ilościowa zmiana strumienia (fotony/sek) z całego ciała monitorowana przez 120 godzin po zabiegu Gua Sha u tej samej myszy, co na rycinie 1. Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję ryciny 2.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Transkrypcja HO-1, indukowalnej formy hejmoooksygenazy, jest zwiększana przez wiele czynników, w tym hem, nadtlenek wodoru, promieniowanie UV, hipoksję oraz stresy fizyczne. Obrazowanie całego organizmu, takie jak opisany protokół bioluminescencji HO-1, pozwala na szybki wgląd w systemową ekspresję HO-1 w wielu narządach. U małych zwierząt obrazowanie bioluminescencyjne umożliwia wysokoczułą, ilościową, podłużną ocenę optyczną zmian w systemowej ekspresji genów w czasie rzeczywistym in-vivo, jak pokazano. Molekularne obr...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie zgłaszają żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

K. Wong oraz S.T.C. Wong otrzymali wsparcie finansowe z Functional and Molecular Imaging Center w Brigham and Women's Hospital
K. Wong oraz S.T.C. Wong otrzymali wsparcie z Center for Biotechnology and Informatics w The Methodist Hospital Research Institute, Weill Cornell Medical College.
K.K. Kwong, I. Chen oraz J-Q Ren otrzymali wsparcie finansowe z Athinoula A. Martinos Center for Biomedical Imaging w Massachusetts General Hospital.
Lenuta Kloetzer oraz Braden Kuo otrzymali wsparcie finansowe z Neuroenteric Research Center w Massachusetts General Hospital
Autorzy dziękują dr. Q. Zeng oraz dr. X. Xu z Optical Imaging Lab w Brigham and Women’s Hospital za pomoc techniczną.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
LucyferynaCaliper Life SciencesP/N 122796Wcześniej Xenogen
IVIS 100Caliper Life SciencesWcześniej Xenogen

Bibliografia

  1. Zhang, W. Selection of potential therapeutics based on in vivo spatiotemporal transcription patterns of heme oxygenase-1. J Mol Med. 80, 655-6564 (2002).
  2. Zhang, W. Rapid in vivo functional analysis of transgenes in mice using whole body imaging of luciferase expression. Transgenic Res. 10, 423-434 (2001).
  3. Contag, C. H., Stevenson, D. K. In vivo patterns of heme oxygenase-1 transcription. J Perinatol. 21, Suppl 1. 119-1124 (2001).
  4. Nielsen, A., Knoblauch, N. T., Dobos, G. J., Michalsen, A., Kaptchuk, T. J. The effect of Gua Sha treatment on the microcirculation of surface tissue: a pilot study in healthy subjects. Explore (NY). 3, 456-466 (2007).
  5. Schwickert, M. E., Saha, F. J., Braun, M., Dobos, G. J. Gua Sha for migraine in inpatient withdrawal therapy of headache due to medication overuse. Forsch Komplementmed. 14, 297-300 (2007).
  6. Tsai, P. S., Lee, P. H., Wang, M. Y. Demographics, training, and practice patterns of practitioners of folk medicine in Taiwan: a survey of the Taipei metropolitan area. J Altern Complement Med. 14, 1243-1248 (2008).
  7. Nielsen, A. Gua sha research and the language of integrative medicine. J Bodyw Mov Ther. 13, 63-72 (2009).
  8. Contag, C. H. Visualizing gene expression in living mammals using a bioluminescent reporter. Photochem Photobiol. 66, 523-531 (1997).
  9. Cui, K., Xu, X., Zhao, H., Wong, S. T. A quantitative study of factors affecting in vivo bioluminescence imaging. Luminescence. 23, 292-295 (2008).
  10. Shibahara, S., Yoshida, T., Kikuchi, G. Mechanism of increase of heme oxygenase activity induced by hemin in cultured pig alveolar macrophages. Arch Biochem Biophys. 197, 607-617 (1979).
  11. Lee, P. J. Hypoxia-inducible factor-1 mediates transcriptional activation of the heme oxygenase-1 gene in response to hypoxia. J Biol Chem. 272, 5375-5381 (1997).
  12. Maines, M. D. The heme oxygenase system: a regulator of second messenger gases. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 37, 517-554 (1997).
  13. Wunder, C., Potter, R. F. The heme oxygenase system: its role in liver inflammation. Curr Drug Targets Cardiovasc Haematol Disord. 3, 199-208 (2003).
  14. Hoekstra, K. A., Godin, D. V., Cheng, K. M. Protective role of heme oxygenase in the blood vessel wall during atherogenesis. Biochem Cell Biol. 82, 351-359 (2004).
  15. Yang, N. C., Lu, L. H., Kao, Y. H., Chau, L. Y. Heme oxygenase-1 attenuates interleukin-1beta-induced nitric oxide synthase expression in vascular smooth muscle cells. J Biomed Sci. 11, 799-809 (2004).
  16. Morse, D., Choi, A. M. Heme oxygenase-1: from bench to bedside. Am J Respir Crit Care Med. 172, 660-670 (2005).
  17. Ryter, S. W. Protective functions of heme oxygenase-1 and carbon monoxide in the respiratory system. Antioxid Redox Signal. 9, 2157-2173 (2007).
  18. Wilson, K., Yu, J., Lee, A., Wu, J. C. In vitro and in vivo bioluminescence reporter gene imaging of human embryonic stem cells. J Vis Exp. , (2008).
  19. Calabrese, V. Vitagenes, dietary antioxidants and neuroprotection in neurodegenerative diseases. Front Biosci. 14, 376-397 (2009).
  20. Contag, P. R., Olomu, I. N., Stevenson, D. K., Contag, C. H. Bioluminescent indicators in living mammals. Nat Med. 4, 245-247 (1998).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Myszy z lucyferazą HO-1badanie in vivostacja obrazowania optycznegowstrzyknięcie roztworu lucyferynypomiar intensywności sygnałuprocedura usuwania sierścidynamika ekspresji czasowej
Obrazowanie bioluminescencyjne nadekspresji hejmoooksygenazy-1 podczas procedury Gua Sha
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.