Autorzy nie mają żadnych informacji do ujawnienia.

wypreparowanie tarczek imaginalnych z larw drosophila w trzecim stadium rozwojowym

Dissection of Imaginal Discs from 3rd Instar Drosophila Larvae

Niniejszy protokół przedstawia technikę sekcji stosowaną do izolacji tarcz imaginalnych z larw Drosophila w trzecim stadium rozwojowym. Metody utrwalania tkanki po wycięciu i usunięciu tarcz skrzydłowych, odnóży oraz oka są zaprezentowane bezpośrednio na szkiełku przedmiotowym w celu ich późniejszej wizualizacji.

Wypreparowanie tarczek imaginalnych z larw Drosophila w trzecim stadium rozwojowym

Dzisiaj pokażę Państwu, jak przeprowadzić dysekcję tarczek imaginalnych z larw Drosophila w trzecim stadium rozwojowym. Tarczki larwalne w trzecim stadium mogą być wykorzystywane do badania wielu procesów rozwojowych. W naszym laboratorium analizujemy je w celu obserwacji procesu apoptozy, jednak można w nich ekspresować różne białka i w ten sposób badać różnorodne procesy rozwojowe zachodzące w tarczkach w odpowiedniej kolejności.W tym celu będę używać kilku bardzo ważnych narzędzi. Pierwszym z nich jest patyczek do przenoszenia, za pomocą którego wyjmiemy larwy z szalek. Następnie, co jest niezwykle istotne, posłużą nam pęsety sekcyjne, które muszą być bardzo ostre, aby możliwe było przeprowadzenie sekcji.Następnie użyjemy skalpela z ostrzem nr 11, aby usunąć krążki z głowy. Potem umieścimy krążki na szkiełku przedmiotowym, wykorzystując Vector Shield jako medium montażowe. Pierwszym krokiem będzie zatem zebranie larw trzeciego stopnia *Sturnus vulgaris*.Używam teraz mojego patyczka do zbierania, aby w pewien sposób odseparować je od ścianki fiolki. Czasami pomaga, gdy patyczek jest lekko wilgotny, a następnie umieszczamy je w kropli PBS. Dobrze, mamy teraz naszą trzecią larwę gwiazdy.Ponieważ jestem praworęczny, obrócę jego głowę w prawą stronę i wykorzystamy kilka punktów orientacyjnych, aby określić miejsce chwytu. Pierwszym z nich jest główna część tchawicy tutaj i tutaj. Następnie, w górę w stronę głowy, znajduje się niewielki przekrój poprzeczny.Najpierw delikatnie chwycę larwę w około dwóch trzecich długości ciała, licząc od głowy. Następnie prawą ręką chwycę ją kilka milimetrów za element poprzeczny, starając się objąć około połowy szerokości larwy. To jest odpowiedni chwyt.Jak widać, jestem w połowie procesu. Teraz delikatnie pociągnę prawą ręką do przodu i widzimy, jak wysuwają się wszystkie jelita. Dobrze. Główna część ciała może zostać teraz odrzucona.A tutaj mamy głowę, która obejmuje prążki imaginalne przytwierdzone do części gębowych. Chwycę go zatem za części gębowe, aby nie zmiażdżyć żadnego z prążków, i przeniosę go na świeżą kroplę PBS. W ten sposób otrzymaliśmy utrwaloną głowę larwy.Usuniemy teraz całą nadmiarową tkankę, a następnie chwycimy larwę za aparaty gębowe, tak jak wcześniej, lub przyciśniemy ją pęsetą do płytki sekcyjnej. Aparaty gębowe znajdują się teraz po lewej stronie. Dobrze, tutaj mamy jelito, którego nie potrzebujemy, a obok znajduje się gruczoł ślinowy.Widoczna jest tkanka tłuszczowa lub ciała tłuszczowe. Należy je sukcesywnie usuwać, szczególnie tłuszcz, który może zakłócać niektóre testy i barwienia oraz wszelkie niepożądane elementy. W ten sposób otrzymujemy oczyszczoną głowę larwy.W tym momencie mamy głowy larw, które zostały odseparowane od ciała podczas sekcji, utrwalone i wypłukane, a zbędne tkanki usunięte; zostały one również poddane niezbędnym zabiegom, takim jak barwienie przeciwciałami w C2 tunnel lub inne barwienie funkcjonalne. Następnie umieściliśmy je na szkiełku i jesteśmy gotowi do odseparowania właściwych tarcz od głowy, czyli usunięcia części gębowych.Zatem tym razem części gębowe znajdują się tutaj, po lewej stronie. Użyję pęsety, aby docisnąć je do szkiełka podstawowego. W prawej ręce trzymam ostrze skalpela nr 11, które jest nieco precyzyjniejszym narzędziem do przeprowadzania sekcji.Najpierw usunę OUN oraz płaty optyczne. Widzą Państwo OUN, dwa płaty optyczne oraz przymocowane do nich tarczki oka i anteny. Usuwam OUN, wsuwając ostrze między płaty optyczne a tarczki oka i powoli ciągnąc, tak że tarczki oka lekko się rozciągają.Zatem mamy tutaj OUN oraz płaty optyczne. Obecnie dysponujemy dwoma tarczkami ocznymi, które zostały oddzielone od OUN. Teraz oddzielę je od części gębowych, delikatnie przecinając i pociągając u nasady.Dobrze, zatem mamy jeden tarczek oka-anteny, a tutaj drugi tarczek oka-anteny. Dobrze. A teraz widzimy wystający tutaj tarczek skrzydła. Ponownie delikatnie zlokalizuję podstawę, przetnę ją i pociągnę.Zatem mamy tutaj tarczkę skrzydłową i przymocowaną do niej tarczkę odnóża, wraz z niewielkim fragmentem tchawki. Dobrze, mamy więc tarczkę skrzydłową z przyłączoną tarczką odnóża, a jak widać, tarczek odnóży jest kilka. Możemy zatem przeszukać ten obszar i odnaleźć więcej tarczek, delikatnie sondując go ostrzem.To wszystkie krążki, jakie znajdziemy w tym osobniku. Jest jeszcze kilka krążków odnóży.

dissection-of-imaginal-discs-from-3rd-instar-drosophila-larvae

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Przekroj tkanek imaginacyjnych z larw Drosophila w 3. stadium

University of California, Irvine (UCI).  Ten protokół pokazuje technikę sekcji stosowaną do izolowywania dysków wyobraźni od larw muszki owocowej w 3. stadium larwalnym. Metody utrwalania tkanki po wypowiedzi i usunięciu dysków skrzydeł, nóg i oczu są demonstrowane bezpośrednio na szklanej osiowce mikroskopowej do późniejszej wizualizacji.

Wypreparowanie tarczek imaginalnych z larw Drosophila w trzecim stadium rozwojowym

W tym artykule

Podsumowanie

Oświadczenia

Przedruki i uprawnienia

Tagi