Protokół fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) w ludzkich plemnikach

Podsumowanie

Niniejszy artykuł wideo przedstawia krok po kroku sposób przetwarzania próbki nasienia w celu uzyskania wysokiej jakości hybrydyzacji fluorescencyjnej in situ na ludzkich plemnikach. Otrzymane preparaty mogą być wykorzystywane do przesiewowego badania aneuploidii w ramach diagnostyki klinicznej.

Streszczenie

Aneuploidie są najczęstszymi aberracjami chromosomowymi u ludzi. Większość tych nieprawidłowości wynika z błędów mejozy podczas procesu gametogenezy u rodziców. U mężczyzn błędy te mogą prowadzić do powstawania plemników z numerycznymi aberracjami chromosomowymi, co wiąże się ze zwiększonym ryzykiem przekazania tych anomalii potomstwu.

Z tego powodu technika fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) jąder plemników stała się protokołem szeroko stosowanym w ramach diagnostyki klinicznej. Praktyka ta pozwala na oszacowanie częstości występowania numerycznych aberracji chromosomowych w gametach pacjentów szukających poradnictwa genetycznego w zakresie prokreacji.

Do tej pory w analizach FISH plemników najczęściej uwzględniano chromosomy X, Y, 13, 18 i 21.

Niniejszy artykuł wideo opisuje krok po kroku, jak przetwarzać i utrwalać próbkę nasienia ludzkiego, jak dekondensować i denaturować chromatinę plemników, jak przygotować preparaty do badania FISH plemników oraz jak wizualizować wyniki pod mikroskopem. W celu uzyskania najlepszych rezultatów zamieszczono specjalne uwagi do najważniejszych etapów procesu.

Protokół

I. Przetwarzanie próbek i fiksacja komórek

1. Pozostaw próbkę nasienia w sterylnych pojemnikach w temperaturze pokojowej przez 20 minut do momentu upłynnienia.
2. Przenieś próbkę do probówki do wirowania i wiruj przy 1000g przez 5 minut.
3. Ostrożnie usuń i odrzuć nadsącz za pomocą pipety Pasteura.
4. Dodawaj kroplami roztwór hipotoniczny (KCl, 0,075M) uprzednio podgrzany do 37°C, mieszając na wortexie, aż do uzyskania końcowej objętości 10 ml.
5. Umieść probówkę w kąpieli wodnej o temperaturze 37°C na 30 minut.
6. Wiruj przy 1000g przez 5 minut. Ostrożnie usuń nadsącz poprzez odlanie, nie naruszając osadu.
7. Po resuspensji osadu dodawaj kroplami świeżo przygotowany fiksator Carnoya (metanol:kwas octowy 3:1), mieszając na wortexie, do uzyskania końcowej objętości 8 ml.
8. Powtórz punkty 6 i 7 tyle razy, ile jest to konieczne, aby uzyskać biały osad.
9. Dodawaj kroplami świeżo przygotowany metanol:kwas octowy (3:1), aby dostosować końcową objętość do stężenia komórek wymaganego do uzyskania dobrego rozprzestrzenienia komórek (w przypadku małego osadu wystarczy kilka kropli, natomiast w próbkach z odzyskaną dużą ilością plemników objętość końcowa może wynieść 1-2 ml). Można przygotować preparat testowy, nanosząc resuspenderowaną próbkę na odtłuszczone szkiełko i badając ją pod mikroskopem fazokontrastowym. Pozwoli to sprawdzić uzyskaną dyspersję komórkową i w razie potrzeby skorygować ją w kolejnych preparatach.
10. Aby wykonać rozmazy, nanieś z minimalnej wysokości 40 cm dwie lub trzy krople zawiesiny komórkowej na środek matowych szkiełek (wcześniej przechowywanych w metanolu w -20°C w celu ich odtłuszczenia). Aby umożliwić lokalizację próbki w trakcie protokołu, zaznacz obszar z rozmazem plemników po drugiej stronie szkiełka za pomocą rysika diamentowego.
11. Przechowuj szkiełka w temperaturze -20°C przez co najmniej 24 godziny.
    Uwaga: Dodawanie metanolu:kwasu octowego (3:1) kropla po kropli podczas mieszania jest bardzo ważnym krokiem, aby uniknąć tworzenia się agregatów plemników.

II. Dekondensacja

1. Preparaty przechowywane w -20°C należy rozmrozić przed kontynuacją protokołu (pozostawić w temperaturze pokojowej).
2. Umieścić preparat w dwóch kolejnych naczyniach Coplina z 2-krotnym roztworem soli i cytrynianu sodu (2xSSC) na 3 minuty w każdym z nich.
3. Przenieść preparat przez serię płukań etanolem przez 2 minuty w każdym naczyniu Coplina. Rozpocząć od etanolu 70%, następnie 90% i zakończyć etanolem 100%. Wysuszyć preparat, pozostawiając go w temperaturze pokojowej.
4. Inkubować preparat w roztworze ditiotreitolu (1,4-ditiotreitol 5mM, 1% Triton X-100, 2-Amino-2-(hydroksymetylo)-1,3-propanodiol 50mM) w temperaturze 37°C w inkubatorze w celu dekondensacji chromatyny. Produkt ten działa poprzez zrywanie mostków dwusiarczkowych protamin, które zwijają DNA w jądrze plemnika. Jest to bardzo ważny etap, ponieważ DNA w jądrze plemnika jest silnie upakowane. Czas inkubacji preparatów w roztworze ditiotreitolu (DTT) należy dostosować do reaktywności próbki na ten produkt. Zazwyczaj czas ten wynosi około 8 minut, choć może wahać się od 2 do 15 minut.
5. Natychmiast przenieść preparat do dwóch kolejnych naczyń Coplina z 2xSSC na 3 minuty w każdym naczyniu.
6. Kontynuować, przenosząc preparat przez serię płukań etanolem przez 2 minuty w każdym naczyniu Coplina (etanol 70%, 90% i 100%). Pozostawić preparat do wyschnięcia w temperaturze pokojowej.
   Uwaga: Nadmierna ekspozycja na DTT spowoduje rozproszenie sygnałów FISH na koniec procedury, natomiast zbyt krótka ekspozycja doprowadzi do braku niektórych sygnałów.

III. Hybrydyzacja

1. Zdenaturować DNA plemników poprzez inkubację preparatu w naczyniu Coplina z roztworem formamidu (70% formamidu/2xSSC) w temperaturze 73°C przez 5 minut.
2. Przepłukać preparat w kolejnych roztworach etanolu przez 1 minutę w każdym naczyniu Coplina (począć od etanolu 70%, następnie 85% i zakończyć 100%). Pozostawić preparat do wyschnięcia w temperaturze pokojowej.
3. Nanieść bezpośrednio 5 µl odpowiedniej, gotowej do użycia mieszaniny sond na szkiełko nakrywkę o wymiarach 15x15 mm (panel sond wielokolorowych AneuVysion Assay: CEP 18/X/Y lub LSI 13/21).
4. Zgodnie z instrukcją w materiale wideo, ostrożnie nałożyć preparat na szkiełko nakrywkę tak, aby obszar docelowy stykał się z mieszaniną sond. Uszczelnić krawędzie cementem gumowym.
5. Umieścić preparat w wstępnie podgrzanej do 37°C komorze hybrydyzacyjnej (HYBrite™) i inkubować w temperaturze 37°C przez 6-24 godziny.
   Uwaga: O ile denaturacja próbki plemników jest obowiązkowa, o tyle konieczność denaturacji sond jest określona przez producenta. Mieszaniny sond stosowane w tym protokole są gotowe do użycia, zatem w tym przypadku denaturacja sond nie jest wymagana.
   Objętość mieszaniny sond może się różnić w zależności od wielkości obszaru hybrydyzacji.

IV. Płukanie po hybrydyzacji

1. Wyjmij slajd z komory hybrydyzacyjnej.
2. Usuń klej gumowy i ostrożnie zsuń szkiełko nakrywkę, przesuwając ją delikatnie w bok.
3. Aby wyeliminować niespecyficzne sygnały hybrydyzacyjne, umieść slajd na 2 minuty w naczyniu Coplina z roztworem 0.4xSSC/0.3%NP-40, uprzednio ogrzanym do 73°C w kąpieli wodnej.
4. Przenieś slajd do roztworu płuczącego 2xSSC/0.1%NP-40 w temperaturze pokojowej na 1 minutę. Pozostaw slajd do wyschnięcia w temperaturze pokojowej.
5. Dodaj produkt do barwienia kontrastowego do obszaru docelowego (8 l dla szkiełka nakrywki o wymiarach 18x18). Najczęściej stosowanym produktem jest 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, Vysis Inc.).
6. Zgodnie z instrukcją pokazaną w filmie, przykryj zhybrydyzowany obszar szkiełkiem nakrywką (aby zachować hybrydyzację, szkiełko nakrywkowe można zabezpieczyć lakierem do paznokci).
7. Przechowuj zhybrydyzowane slajdy w temperaturze -20°C w ciemności do czasu planowanej analizy. W tych warunkach slajdy można przechowywać do 12 miesięcy bez znaczącej utraty intensywności sygnału fluorescencyjnego.
   Uwaga: Wyższa temperatura lub zbyt długi czas płukania mogą doprowadzić do eliminacji niektórych sygnałów, natomiast zbyt krótki czas nie usunie niespecyficznych hybrydyzacji sond.
   Objętość dodanego produktu do barwienia kontrastowego będzie zależeć od wielkości obszaru hybrydyzacji do pokrycia.

V. Wizualizacja

Preparaty można ocenić pod mikroskopem epifluorescencyjnym wyposażonym w filtr trójpasmowy dla DAPI/Texas Red/FITC oraz filtry jednopasmowe dla Aqua, FITC i Texas Red. W celu prawidłowej oceny jąder plemników należy stosować standardowe kryteria oceny ¹.

Preparat zhybrydyzowany z sondami dla chromosomów X, Y i 18 powinien wykazywać sygnały dla tych trzech chromosomów. Każdy prawidłowy plemnik musi wykazywać jeden niebieski sygnał (odpowiadający chromosomowi 18) oraz sygnał zielony (plemniki z chromosomem X) lub sygnał czerwony (plemniki z chromosomem Y).

W preparacie zhybrydyzowanym z sondami dla chromosomów 13 i 21, w każdym prawidłowym plemniku powinny być widoczne zielony sygnał dla chromosomu 13 oraz czerwony sygnał dla chromosomu 21.

Dyskusja

Niniejszy protokół opisuje sposób przetwarzania próbek ludzkiego nasienia w celu przygotowania preparatów do analizy FISH plemników. Dzięki zastosowaniu tego protokołu możliwe jest analizowanie aberracji chromosomalnych w męskich gametach. Przesiewowe badanie aneuplodii plemników znajduje zastosowanie zarówno w badaniach podstawowych, jak i w poradnictwie reprodukcyjnym dla mężczyzn z niepłodnością. Choć w diagnostyce klinicznej najczęściej badane są chromosomy X, Y, 13, 18 i 21, dostępne są również inne komercyjne sondy...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1,4-ditiotreitol (DTT)	Materiały	Grupa Roche	10197777001
2-amino-2-(hydroksymetylo)-1,3-propanodiol	Materiały	Grupa Roche	10708976001
Kwas octowy	Materiały	Merck & Co., Inc.	100.063
AneuVysion® Zestaw wielokolorowych sond DNA 20x roztwór soli sodowej cytrynianu 4,6-diamidyno-2-fenyloindol (DAPI II) sonda DNA CEP 18/X/Y NP-40 Sonda DNA LSI 13/21	Materiał	Vysis Inc.	32-161075 30-805850 30-804941 30-171077 30-804820 30-171078
Wirówka 5804R	Narzędzie	Eppendorf
Probówka do wirowania	Materiały	Nalge Nunc international	347856
naczynie Coplina (szklane)	Materiały	Barloworld Scientific	Hellendahl (ZCT278)
naczynie Coplin (plastikowe)	Materiały	Deltalab	191087
Kवkrycie szkiełko (15x15)	Materiały	Knittel Glaser	4600115
Szkiełka nakrywkowe (18x18)	Materiały	Knittel Glaser	4600118
Rysik diamentowy	Materiały	Hammacher	335117010
Etanol	Materiały	Merck & Co., Inc.	100.983
Formamid	Materiały	Grupa Roche	11814320001
Zamrażarka	Narzędzie	Zanussi
Rękawiczki	Materiały	Sanyo	101/3300
HYBrite™	Narzędzie	Vysis Inc.
olej immersyjny	Materiały	Olympus Corporation	35505
Inkubator	Narzędzie	Heraeus Instruments
Metanol	Materiały	Merck & Co., Inc.	106.009
Mikropipeta	Materiały	Systemy laboratoryjne	Pipeta Finnpipette (4500000)
Wymiana końcówki mikropipety	Materiały	Daslab	16-2001
Lakier do paznokci	Materiały	Kosmetyki Quo
mikroskop epifluorescencyjny Olympus BX60	Narzędzie	Olympus Corporation		Wyposażony w filtr trójpasmowy dla DAPI/Texas Red/FITC oraz filtry jednopasmowe dla Aqua, FITC i Texas Red.
Pipeta Pasteura	Materiały	Rubilabor	211.0230
Mikroskop fazokontrastowy	Narzędzie	Nikon Instruments
Plastikowa pipeta (3 ml)	Materiały	Deltalab	200007
Chlorek potasu (KCl)	Materiały	Fluka	60128
Klej gumowy	Materiały	Najlepszy test
Slajdy	Materiały	Knittel Glaser	4520022
Pojemniki do przechowywania preparatów	Materiały	Deltalab	19276.1
Sterylny pojemnik	Materiały	Deltalab	409726
Strzykawka	Materiały	PentaFerte	002022300
Termometr	Materiały	Comark Instruments, Inc	KM12
Woda trzykrotnie destylowana	Materiały
Triton X-100	Materiały	Sigma-Aldrich	9002-93-1
Pęseta	Materiały	B. Braun Medical	Aesculap (BD224R)
Pionowy przepływ laminarny dygestorium z laminarnym przepływem powietrza	Narzędzie	Burdinola	OR-ST 1500
Mieszadło wiroxowe	Narzędzie	Fisher Scientific	FB15012
Kąpiel wodna	Narzędzie	Raypa®