W niniejszym opracowaniu opisujemy podstawowy protokół fluorescencyjnego znakowania różnych elementów cewek serca larw i osobników dorosłych Drosophila melanogaster. Próbki te są dobrze dostosowane do obrazowania za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej lub konfokalnej. Technika ta umożliwia szczegółową analizę strukturalną cech serc tego potężnego organizmu modelowego.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Fluorescencyjne znakowanie struktur serca Drosophila
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
TheDrosophila melanogasternaczynie grzbietowe, czyli serce, jest strukturą rurkowatą składającą się z pojedynczej warstwy kurczliwych kardiomiocytów, komórek osierdzia ułożonych wzdłuż każdej ze ścian serca, wspierających mięśni skrzydełek oraz, u osobników dorosłych, warstwy brzusznych komórek mięśni podłużnych. Włókna kurczliwe zawierają konserwowane składniki cytoarchitektury mięśniowej, w tym gęsto upakowane pęczki miofibryli oraz kompleksy białek cytoszkieletowych i podbłonowych, które oddziałują z homologicznymi komponentami macierzy zewnątrzkomórkowej. W niniejszym dokumencie opisujemy protokół fiksacji i znakowania fluorescencyjnego wybranych elementów mięśnia sercowego z serc wypreparowanych larw oraz częściowo nienaruszonych osobników dorosłychDrosophilaW szczególności demonstrujemy znakowanie sarkomerycznej F-aktyny oraz α-aktyniny w sercach larwalnych. Dodatkowo przeprowadzamy znakowanie F-aktyny i α-aktyniny u dorosłych much wykazujących ekspresję miozyny-GFP, a także znakowanie α-aktyniny i perikardyny, kolagenu macierzy pozakomórkowej typu IV, w sercach dorosłych osobników typu dzikiego. Szczególną uwagę poświęcono strategii montowania półzachowanych serc dorosłych, która minimalizuje manipulacje i optymalizuje szanse na zachowanie integralności rurek serca oraz powiązanych z nimi tkanek. Preparaty te nadają się do obrazowania za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i konfokalnej. Ogólnie rzecz biorąc, procedura ta pozwala na staranną i szczegółową analizę cech strukturalnych serca w potężnym, podatnym na modyfikacje genetyczne modelu systemowym.
Protokół
Przed rozpoczęciem
- Przygotować następujące roztwory:
- bufor relaksujący (sztuczna hemolimfa Drosophila (ADH) (patrz: „Visualizing the beating heart in Drosophila”) zawierająca 10 mM EGTA)
- utrwalacz (4% formaldehyd w 1x PBS)
- PBSTx (PBS zawierający 0,1% Triton-X-100)
- odpowiednio rozcieńczone przeciwciała pierwotne oraz specyficzne gatunkowo, znakowane fluorescencyjnie przeciwciała wtórne w PBSTx
- Przeprowadzić sekcję Drosophila w celu odsłonięcia rurek serca (much dorosłych i/lub larw) zgodnie z:
- protokołem preparatyki pół-zachowawczego serca Drosophila opisanym w "Visualizing the beating heart in Drosophila", lub
- Drosophila protokołem sekcji NMJ larw1 z następującymi modyfikacjami: podczas sekcji larw należy stosować natleniony ADH i lekko przesunąć tylną szpilkę z linii środkowej brzusznej. Larwy należy przeciąć wzdłuż linii środkowej brzusznej. Nie usuwać żadnych tkanek przed utrwaleniem.
Barwienie fluorescencyjne
- Sprawdzić, czy wszystkie serca biją rytmicznie w natlenionym ADH. Szybko zastąpić ADH buforem relaksującym. Zbadać każdą rurkę serca, aby upewnić się, że skurcze zostały zahamowane.
- Utrwalić serca, zastępując bufor relaksujący utrwalaczem. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut przy delikatnym wstrząsaniu. (W przypadku preparatów larwalnych wstrząsanie na żadnym etapie nie jest konieczne i może zostać uznane za szkodliwe dla integralności tkanki serca).
- Przemyć preparaty trzykrotnie po dziesięć minut PBSTx w temperaturze pokojowej przy ciągłym wstrząsaniu.
- W przypadku osobników dorosłych ostrożnie przyciąć brzuszne krawędzie kutykuli odwłoka tak, aby pozostały obszar miał kształt bardziej eliptyczny niż zaokrąglony. Dodatkowo, jednym cięciem pomiędzy odwłokiem a klatką piersiową, ostrożnie i precyzyjnie oddzielić oba segmenty ciała, dbając o minimalne uszkodzenie przedniej części serca. W przypadku serc larwalnych ostrożnie usunąć ciało tłuszczowe za pomocą precyzyjnej pęsety. Usuwanie tłuszczu musi być wykonane z najwyższą ostrożnością, ponieważ serce larwalne jest szczególnie kruche i ma bardzo małe wsparcie ze strony innych mięśni lub tkanki łącznej. Nie usuwać odnóg tchawkowych, gdyż może to uszkodzić serce.
- Przenieść przyciętą grzbietową część kutykuli odwłoka, chwytając za krawędzie i unikając kontaktu z centralnie położoną rurką serca, do płytki 96-dołkowej, w której dołki zawierają 50-100 μl przeciwciała pierwszorzędowego rozcieńczonego w PBSTx. Umieścić nie więcej niż 12 preparatów w jednym dołku. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 godziny przy ciągłym mieszaniu. Inkubację można również przeprowadzić przez noc w temperaturze 4° C.
- Usunąć roztwór przeciwciała pierwszorzędowego. Przemyć serca trzykrotnie po dziesięć minut 100 μl PBSTx w temperaturze pokojowej przy ciągłym wstrząsaniu.
- Po usunięciu ostatniego buforu płuczącego dodać 100 μl przeciwciała drugorzędowego w PBSTx, uzupełnionego o Alexa594-falloidynę (1:1000). Inkubować przez jedną godzinę przy ciągłym wstrząsaniu w temperaturze pokojowej. Próbki powinny pozostać przykryte, aby zapobiec blaknięciu fluoroforu.
- Po inkubacji z przeciwciałem drugorzędowym przemyć serca trzykrotnie po dziesięć minut 100 μl PBSTx w temperaturze pokojowej przy ciągłym wstrząsaniu. Próbki należy trzymać pod przykryciem przez cały czas trwania etapów płukania.
- W celu usunięcia Triton-X-100 przepłukać serca ostatni raz w 100 μl PBS przez 10 minut. Preparaty można przechowywać w ciemności w temperaturze 4°C przez kilka dni przed montowaniem.
Montaż serc dorosłych osobników
- Przyklej dwa szkiełka nakrywkowe o wymiarach 18 x 18 mm do przedmiotu szkiełka za pomocą 10 μl medium montażowego Vectashield. Szkiełka nakrywkowe powinny być oddalone od siebie o około 10-15 mm. Umieść małą, trzecią kroplę medium montażowego pomiędzy dwoma szkiełkami nakrywkowymi.
- Nanieś 20 μl Vectashield na środek trzeciego szkiełka nakrywkowego.
- Ostrożnie wyjmij każde z serc z roztworu płuczącego PBS, chwytając za krawędzie kutykuli, a następnie delikatnie ułóż je stroną serca do dołu na kropli medium montażowego na trzecim szkiełku nakrywkowym. Na jednej kropli na szkiełku nakrywkowym należy umieścić nie więcej niż pięć serc.
- Sprawdź pod mikroskopem, czy wszystkie serca są skierowane do dołu.
- Ostrożnie odwróć szkiełko nakrywkowe z sercami i szybko połóż je na przedmiocie szkiełka z parą szkiełek nakrywkowych w taki sposób, aby kropla z cewkami serca połączyła się z kroplą Vectashield znajdującą się pomiędzy parą szkiełek. Szkiełka nakrywkowe powinny utworzyć „mostek”. Serca zostaną zawieszone pomiędzy szkiełkiem nakrywkowym a przedmiotem szkiełka.
- Sprawdź pod mikroskopem, czy serca są teraz skierowane do góry.
- Zabezpiecz krawędzie szkiełek nakrywkowych lakierem do paznokci.
- Serca są teraz gotowe do obrazowania za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej lub konfokalnej.
Montowanie serc larwalnych
- Nanieść kroplę (~20 μl) Vectashield na szkiełko mikroskopowe.
- Ostrożnie przenieść do Vectashield maksymalnie dwa okazy larw i ułożyć je stroną grzbietową do dołu, posługując się igłami wolframowymi.
- Przesunąć poszczególne okazy w medium montażowym tak, aby znajdowały się równolegle względem siebie.
- Umieścić szkiełka nakrywkowe po przeciwnych stronach okazu. Za pomocą pęsety nałożyć trzecie szkiełko nakrywkowe na wierzch, kładąc najpierw jedną jego krawędź na tylnej nakrywce, a następnie opuszczając je w stronę przedniej nakrywki, tworząc w ten sposób mostek. Siły kapilarne spowodują przepływ Vectashield z tyłu do przodu, co ułatwi prawidłowe ustawienie serca larwy.
- Utrwalić wszystkie szkiełka nakrywkowe na krawędziach za pomocą lakieru do paznokci i ostrożnie wypełnić przestrzeń między nakrywkami 20-30 μl Vectashield.
- Uszczelnić lakierem do paznokci i przechowywać w temperaturze 4°C, lub w temperaturze -20°C w przypadku przechowywania długoterminowego.
Reprezentatywne wyniki
Przy prawidłowym wykonaniu wszystkie elementy i powiązane tkanki naczynia grzbietowego powinny pozostać nienaruszone i być łatwo widoczne. Fluorescencja tła powinna być minimalna. U osobników dorosłych brzuszna warstwa mięśni podłużnych barwi się bardzo dobrze i generuje silny sygnał (Rysunek 1 i Rysunek 2). Leżące pod nią koliste kardiomiocyty mają jednak tendencję do generowania słabszego sygnału niż nadrzędna warstwa brzuszna. Miocyty przedniej „komory stożkowej” serca dorosłego osobnika zawierają znaczną ilość materiału kurczliwego, w związku z czym obszar ten wydaje się najbardziej wyraźny w porównaniu z pozostałą częścią rurki serca. Serce larwalne wykazuje spiralną strukturę miofibrylarną podobną do tej, którą mają kurczliwe kardiomiocyty osobników dorosłych (Rysunek 3).
Rysunek 1: Góra. Mikrografia fluorescencyjna przedstawiająca całą rurkę serca dorosłej Drosophila melanogaster wykazującej ekspresję miozyny-GFP. Obraz wykonano za pomocą fluorescencyjnego mikroskopu Zeiss Imager Z1 wyposażonego w moduł przesuwny Apotome. Miozyna-GFP jest widoczna w kolorze zielonym, aktyna została zabarwiona falloidyną AlexaFluor® 594 (kolor czerwony), a α-aktynina została oznakowana przeciwciałem anty-α-aktyninowym (kolor niebieski). Należy zauważyć, że procedura preparatywna pozwala na odzyskanie próbek serca o dobrze zachowanych strukturach. CC = komora stożkowa; AM = mięsień alarny; V = zastawka wewnętrzna; VLL = brzuszna podłużna warstwa mięśniowa. Dół. Odcinek rurki serca dorosłego osobnika od CC przez 3. segment brzuszny serca, tuż pod brzuszną warstwą podłużną, ukazujący spiralną strukturę miofibryli kurczliwych kardiomiocytów. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję Rysunku 1a, oraz tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję rysunku 1b
Rysunek 2: Reprezentatywne serie obrazów konfokalnych przedniej części dorosłego serca barwionej faloidyną AlexaFluor® 594 (czerwony) oraz przeciwciałem anty-perikardyna (kolagen typu IV) (zielony). Perikardyna wiąże się z sercem wzdłuż powierzchni brzusznej, prawdopodobnie wywodząc się z podłużnie zorientowanych miofibryli brzusznej warstwy mięśniowej. Aby zobaczyć większą wersję rysunku 2, kliknij tutaj.
Rycina 3: Mikrografia fluorescencyjna segmentu A7 właściwego serca larwy Drosophila w trzecim stadium. Obraz wykonano za pomocą fluorescencyjnego mikroskopu Zeiss Imager Z1 wyposażonego w moduł przesuwny Apotome. Aktyna została znakowana faloidyną AlexaFluor® 594 (kolor zielony), a α-aktynina została zabarwiona przeciwciałem anty-α-aktyniną (kolor czerwony). Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję ryciny 3.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W niniejszej pracy przedstawiamy protokół przydatny do przygotowania i barwienia naczynia grzbietowego oraz tkanek towarzyszących u Drosophila melanogaster w celu obrazowania za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej lub konfokalnej. Przedstawiamy zwięzły opis kroków dopracowanych i powszechnie stosowanych w naszym laboratorium w celu skutecznego barwienia, które umożliwia wysokorozdzielcze obrazowanie in situ rurek serca larwalnych i dorosłych osobników Drosophila. Inne metody o podobnym charakte...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Podziękowania
Autorzy dziękują S.I. Bernstein (San Diego State University) za krytyczne przeczytanie oraz pomocne sugestie dotyczące przygotowania niniejszego manuskryptu. Praca ta była finansowana z grantów NIH przyznanych S.I. Bernstein (SDSU) oraz R. Bodmer (BIMR), a także z stypendiów postdoktorskich przyznanych przez Western States Affiliate of the American Heart Association dla G. Vogler oraz A. Cammarato.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze | |
|---|---|---|---|---|
| Glikol etylenowy-bis (2-amino-etyloeter) -N,N,N’,N’-tetra-kwas octowy (EGTA) | Odczynnik | Sigma-Aldrich | E4378 | |
| Formaldehyd, 10%, wolny od metanolu, Ultra Pure | Odczynnik | Polysciences, Inc. | 50-00-0 | |
| Triton-X-100 | Odczynnik | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | |
| Alexa Fluor® falloidyna 594 | Odczynnik | Invitrogen | A12381 | |
| Vectashield® medium montażowe do fluorescencji z DAPI | Odczynnik | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Igły wolframowe | Odczynnik | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Uchwyt do igieł | Odczynnik | Fine Science Tools | 26018-17 |
Bibliografia
- Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Drosophila larval NMJ dissection. J Vis Exp. , (2009).
- Molina, M. R., Cripps, R. M. Ostia, the inflow tracts of the Drosophila heart, develop from a genetically distinct subset of cardial cells. Mech Dev. 1, 51-59 (2001).
- Dulcis, D., Levine, R. B. Glutamatergic innervation of the heart initiates retrograde contractions in adult Drosophila melanogaster. J Neurosci. 2, 271-280 (2005).
- Zeitouni, B. Signalling pathways involved in adult heart formation revealed by gene expression profiling in Drosophila. PLoS Genet. 10, 1907-1921 (2007).
- Robertson, C. W. The metamorphosis of Drosophila melanogaster, including an accurately timed account of the principal morphological change. J. Morphol. 2, 351-399 (1936).
- Miller, A. The internal anatomy and histology of the imago of Drosophila melanogaster. , Wiley. New York. (1950).
- Rizki, T. M. The circulatory system and associated cells and tissues. , Academic Press. New York. (1978).
- Cammarato, A. Myosin transducer mutations differentially affect motor function, myofibril structure, and the performance of skeletal and cardiac muscles. Mol Biol Cell. 2, 553-562 (2008).
- Taghli-Lamallem, O. Dystrophin deficiency in Drosophila reduces lifespan and causes a dilated cardiomyopathy phenotype. Aging Cell. 2, 237-249 (2008).
- Kelso, R. J. a database documenting a GFP protein-trap insertion screen in Drosophila melanogaster. Nucleic Acids Res. 32, D418-D420 (2004).
- Dietzl, G. A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila. Nature. 7150, 151-156 (2007).
- Mery, A. The Drosophila muscle LIM protein, Mlp84B, is essential for cardiac function. J Exp Biol. 211, 15-23 (2008).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
