Izolacja i manipulacja genetyczna kardiomiocytów dorosłych do obrazowania konfokalnego

Podsumowanie

Kardiomiocyty dorosłych są komórkami pierwotnymi, które można wyizolować z serc zwierząt i hodować przez kilka dni. W tym okresie hodowli można zastosować adenowirusowy transfer genów w celu ekspresji genetycznie kodowanych biosensorów (GEB) lub fluorescencyjnych białek fuzyjnych. Obie metody umożliwiają badania komórkowe z wykorzystaniem mikroskopii konfokalnej.

Streszczenie

Kardiomiocyty izolowane z serc dorosłych osobników są powszechnie uznawane za model stanowiący stadium pośrednie pomiędzy komórkami mięśniowymi zarodkowymi i noworodkowymi a funkcjonującym sercem. W związku z tym kardiomiocyty służą jako dobre modele fizjologii i patofizjologii komórkowej serca, badań farmakologicznych, a także analiz modeli zwierząt transgenicznych. W niniejszej pracy opisujemy metodę izolacji tych komórek z serca. Ponadto pokazujemy, w jaki sposób można przeprowadzić manipulację genetyczną kardiomiocytów bez konieczności hodowli zwierząt transgenicznych: jest to połączenie długoterminowej hodowli (1 tydzień) i adenowirusowego transferu genów. Ten ostatni proces opisano od etapu konstrukcji wirusa po transdukcję komórek. Metoda ta może być wykorzystana do ekspresji genetycznie kodowanych biosensorów (GEBs), fluorescencyjnych białek fuzyjnych, a także do nadekspresji i wyciszania białek, np. z wykorzystaniem RNAi. Przedstawiamy tutaj przykład ekspresji białka fuzyjnego barwiącego strukturę subkomórkową (aparat Golgiego). Ekspresję takiego białka można zwizualizować za pomocą obrazowania konfokalnego stosów z-stack w celu rekonstrukcji 3D struktur subkomórkowych. Protokół obejmuje najnowocześniejsze techniki z zakresu hodowli komórkowej, biologii molekularnej i biofizyki, dostarczając tym samym podejścia pozwalającego na eksplorację nowych horyzontów w kardiologii komórkowej.

Protokół

Ogólny schemat protokołu obejmującego cztery główne etapy przedstawiono na Rysunku 1. Wszystkie kroki opisano szczegółowo. Izolacja komórek, transdukcja i hodowla, a następnie obrazowanie konfokalne około 24 godziny później, stanowią następujące po sobie i obowiązkowe ramy czasowe. Konstrukcja wirusa powinna zostać przeprowadzona przed izolacją komórek, a następnie wykorzystana do transdukcji genetycznej.

1. Izolacja dorosłych miocytów serca z serca szczura

1. Dorosłe samce szczurów linii Wistar o masie ciała około 250 g (wiek 6-12 tygodni) poddaje się znieczuleniu poprzez doszpikowe wstrzyknięcie 170 μl roztworu znieczulającego na 100 g masy ciała.
2. Dodatkowo, aby zapobiec krzepnięciu krwi podczas operacji, wstrzykuje się roztwór cytrynianu (2 μl / g masy ciała).
3. Należy przygotować zestaw do perfuzji Langendorffa. Wszystkie roztwory powinny być nasycone tlenem.
4. Po znieczuleniu szczura zwierzę zostaje unieruchomione na stole operacyjnym, a górna część ciała zostaje zdezynfekowana 70% etanolem.
5. Zwierzę zostaje uśmiercone poprzez przecięcie tętnicy szyjnej.
6. Klatkę piersiową otwiera się za pomocą nożyczek. Serce i aorta powinny być teraz dostępne. Usuwa się osierdzie.
7. Lodowaty roztwór A+ (5 ml) wstrzykuje się do obu komór za pomocą igły 26G, aby zatrzymać akcję serca i wypłukać krew.
8. Aortę chwyta się kleszczykami i przecina na wysokości łuku aorty, dokładnie w miejscu pierwszego odgałęzienia.
9. Serce zostaje usunięte z klatki piersiowej, a aortę mocuje się do kaniuli zestawu perfuzyjnego za pomocą pęsety i kleszczyków, aby umożliwić wsteczną perfuzję Langendorffa. Należy uważać, aby nie uszkodzić zastawek aorty.
10. Serce należy przymocować za pomocą ligatury wokół aorty/kaniuli. Otwarte naczynia również muszą zostać podwiązane.
11. Serce poddaje się wstecznej perfuzji nasyconym tlenem roztworem A+ w temperaturze pokojowej (23°C) przez 10 min pod ciśnieniem około 70 mbar. Należy upewnić się, że do aorty nie dostały się pęcherzyki powietrza.
12. Roztwór perfuzyjny zostaje zmieniony na roztwór Liberase w temperaturze 37°C na około 25 min przy przepływie 4 ml/min za pomocą pompy perystaltycznej. Pod koniec perfuzji serce powinno mieć marmurkowy, biały wygląd. Czas trawienia może wymagać dostosowania do sytuacji lub stanu tkanki.
13. Serce wyjmuje się z zestawu perfuzyjnego i umieszcza w szalce Petriego zawierającej roztwór A w temperaturze 37°C. Pozostałe naczynia i przedsionki zostają odcięte. Naczynia są usuwane, a przedsionki – jeśli jest to konieczne – są traktowane w inny sposób (poza zakresem niniejszego protokołu). Komory dzieli się na około 6 kawałków.
14. Kawałki przenosi się do kolby Erlenmeyera o pojemności 100 ml zawierającej 20 ml roztworu A w temperaturze 37°C i lekko miesza w łaźni wodnej o temperaturze 37°C przez 5 min. Na koniec odrzuca się nadsącz.
15. Opisaną powyżej procedurę powtarza się raz lub dwa razy. Nadsącz powinien stać się lekko mętny.
16. Zwiększenie stężenia wapnia zewnątrzkomórkowego rozpoczyna się poprzez dodanie 20 ml roztworu B_1/2 w temperaturze 37°C do komórek i tkanki pozostającej w pozostałości roztworu A w kolbie Erlenmeyera. Próbkę lekko wstrząsa się w łaźni wodnej o temperaturze 37°C przez dodatkowe 5 min. Następnie odrzuca się nadsącz.
17. Dodaje się kolejne 20 ml roztworu B_1/2. (Roztwór/nadsącz powinien teraz zawierać żywe komórki). Kroplę zawiesiny komórkowej przenosi się na szalkę Petriego i ogląda pod odwróconym mikroskopem do hodowli komórkowych. Jeśli komórki wykazują wysoką aktywność spontaniczną (skurcze), należy odczekać, aż przejdą w stan spoczynku.
18. Ponownie odrzuca się nadsącz i dodaje 20 ml roztworu B_1/2.
19. Koniec plastikowej pipety Pasteura odcina się w taki sposób, aby kawałki tkanki mogły swobodnie przechodzić przez otwór podczas mieszania. Za pomocą płomienia wygładza się (stopi) ostre krawędzie.
20. Następnie kawałki tkanki są delikatnie i ostrożnie triturywane. Kawałki tkanki powinny „rozpaść się” na pojedyncze komórki.
21. Zawierający komórki nadsącz jest zlewany i rozcieńczany roztworem B do uzyskania pożądanej gęstości komórek, która zależy od rodzaju przeprowadzanych doświadczeń i powinna zostać określona empirycznie.

2. Konstrukcja adenowirusa do transdukcji białka fuzyjnego

Do produkcji adenowirusów wykorzystuje się system wektorów adenowirusowych Transpose-Ad firmy MP Biomedicals¹. Niniejszy protokół rozpoczyna się od dostępnego i przetestowanego wektora wejściowego (pCR259) dla fluorescencyjnego białka fuzyjnego lub GEB s².

1. Ilość 10 ng wyżej wspomnianego początkowego wektora pCR259 zawierającego gen zainteresowania transformuje się za pomocą 100 μl kompetentnych komórek HighQ-1 Transpose-AD™ 294.
2. Mieszaninę tę inkubuje się przez 20 min na lodzie, po czym przeprowadza się szok termiczny przez 45 s w temperaturze 42°C, a następnie przechowuje na lodzie przez kolejne 2 min.
3. Dodaje się 900 μl nieaselektywnego medium LB i hoduje w temperaturze 37°C przy łagodnym wytrząsaniu przez 4 godziny.
4. Wysiewa się 50 μl, 100 μl i 200 μl na płytki zawierające medium LB z chloramfenikolem (Cm, 20 μg/ml), ampicyliną (100 μg/ml), tetracykliną (15 μg/ml), X-Gal (280 μg/ml) i IPTG (40 μg/ml). (Bardziej intensywne i szybsze niebieskie barwienie jest możliwe przy użyciu droższego barwnika Bluo-Gal w stężeniu 300 μg/ml. Należy go stosować szczególnie wtedy, gdy nie posiada się dużego doświadczenia w rozpoznawaniu i rozróżnianiu kolonii niebieskich i białych).
5. Hoduje się przez 24 godziny w temperaturze 37°C. Przechowuje się w temperaturze 4°C do czasu, aż możliwa będzie dokładna identyfikacja kolonii niebieskich. W przypadku trudności z decyzją, która kolonia jest naprawdę biała, wybiera się kilka kolonii i replikuje je na innej płytce zawierającej trzy antybiotyki, X-Gal i IPTG, a następnie pozostawia do wzrostu przez noc w temperaturze 37°C.
   Uwaga) Komórki HighQ-1 Transpose-AD™ 294 zawierają dwa ważne plazmidy: szkielet adenowirusa (Transpose-Ad™ 294) oraz plazmid pomocniczy wykazujący ekspresję transpozazy, która pośredniczy w insercji genu zainteresowania do jego miejsc docelowych, zlokalizowanych w genie LacZ plazmidu Transpose-AD 294.
6. Aby zidentyfikować pozytywne kolonie zawierające gen zainteresowania w szkielecie wirusa, przeprowadza się PCR kolonii zgodnie z opisem w sekcjach 2.7-2.9. Należy użyć starterów wektorowych flankujących wielomiejscowy region klonowania (forward ^5'CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG^3', reverse ^5'GCGGATAACAATTTCACACAGG^3') i wykonać PCR kolonii dla kolonii 100% białych, używając jednej kolonii niebieskiej jako kontroli dla plazmidów Transpose-AD 294 bez wstawionego genu zainteresowania. Kolonie niebieskie dadzą krótki fragment PCR (~200 bp), kolonie zawierające gen zainteresowania wykażą duży produkt PCR (zależnie od długości genu zainteresowania), a kolonie z dwoma fragmentami są koloniami wielokomórkowymi i muszą zostać rozdzielone przed dalszym użyciem.
7. Zgodnie z poniższą tabelą należy przygotować master mix.
8. Wybiera się pojedynczą, 100% białą kolonię za pomocą autoklawowanego wykałaczką i najpierw wykonuje replikę tej kolonii na płytce LB z Cm.
9. Przenosi się kolonię do mieszaniny PCR. Obraca się ją w mieszaninie PCR 3-4 razy, a następnie usuwa wykałaczkę, zanim wchłonie zbyt dużo mieszaniny PCR. Protokół PCR zależy od kb wstawki i użytej polimerazy. Temperatura przyłączania starterów wynosi 57°C i zaleca się zastosowanie 35 cykli.
10. Hoduje się nocne kultury (medium LB z Cm) pozytywnych klonów i izoluje plazmidy za pomocą dostępnego komercyjnie zestawu bez kolumn wirowych, ponieważ siła odśrodkowa niszczy ogromny wektor wirusowy.
11. Transformuje się 0,5 μg izolowanych plazmidów w 100 μl kompetentnych komórek DH5α. DNA inkubuje się z komórkami na lodzie przez 30 min. Szok termiczny przeprowadza się przez 45 s w 42°C, a następnie pozostawia na lodzie przez 2 min.
12. Dodaje się 900 μl nieaselektywnego medium LB i hoduje w 37°C przy łagodnym wytrząsaniu przez 1 godzinę.
13. Wysiewa się 50 μl na płytkę zawierającą medium LB z Cm, X-Gal i IPTG. Inkubuje się w 37°C przez 24 godziny.
14. Wybiera się i replikuje do 20 kolonii 100% białych na oddzielnych płytkach z ampicyliną, tetracykliną i chloramfenikolem zawierających IPTG i X-Gal. Pozostawia się je do wzrostu przez noc w 37°C. Wybiera się kolonie, które są 100% białe, oporne na chloramfenikol oraz wrażliwe na ampicylinę i tetracyklinę.
15. PCR kolonii (opcjonalnie): pozytywne klony można ponownie przetestować za pomocą PCR kolonii, aby sprawdzić, czy zawierają wstawkę.
16. Wybiera się pojedynczą kolonię pozytywnego rekombinanta i hoduje w 600 ml medium LB z Cm.
17. Izoluje się plazmid za pomocą zestawu do maksi-izolacji plazmidów.
18. Trawi się 5 μg plazmidu enzymem Pac I przez dwie godziny w 37°C i zatrzymuje reakcję w 65°C przez 20 min.
19. Całość trawienia koncentruje się w SpeedVac w temperaturze pokojowej przez 30 min do końcowej objętości 10 μl lub stosuje metodę ekstrakcji fenolowo-chloroformowej.
20. Rozmraża się ampułkę zamrożonych komórek QBI-HEK 293 przy łagodnym wytrząsaniu w kąpieli wodnej o temperaturze 37°C. Zewnątrz ampułki płucze się 70% etanolem i postępuje się aseptycznie w sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza.
21. Przenosi się komórki do sterylnej probówki 15 ml, dodając kroplami 10 ml DMEM (+10% FCS) przy łagodnym wytrząsaniu, a następnie wiruje przez 10 min przy 250xg, abyt stworzyć pellet komórek.
22. Odlewa się supernatant. Pellet resuspenduje się w 10 ml DMEM (+10% FCS) poprzez delikatne pipetowanie w górę i w dół.
23. Wysiewa się do kolby 75 cm² i dodaje do komórek 10 ml DMEM z 10% FCS. Inkubuje się przez noc w 37°C w inkubatorze z 5% CO₂.
24. Następnego dnia weryfikuje się gęstość komórek. Komórki QBI-HEK 293 powinny być pasażowane w stosunku od 1:10 do 1:20.
25. Usuwa się medium z komórek i traktuje trypsyną (2 ml Trypsyny) przez 1-3 min. Dodaje się do komórek 10 ml DMEM i wiruje przy 250xg przez 10 min.
26. Ostrożnie usuwa się medium i dodaje do komórek 10 ml świeżego medium, resuspenduje i przelicza komórki.
27. Wysiewa się do sześciodotykowej płytki, podając do każdego dołka odpowiednio 2x10⁵, 3x10⁵, 4x10⁵, 5x10⁵ i 6x10⁵ komórek. Inkubuje się płytkę w 37°C w inkubatorze CO₂.
28. Następnego dnia używa się dołka z 50% konfluencją do transfekcji skoncentrowanym trawieniem Pac I. Mamy dobre doświadczenia z transfekcją Lipofectamine 2000, ale odpowiednie powinny być również inne metody (takie jak transfekcja fosforanem wapnia).
29. Wymienia się medium w dołku 3-4 h przed transfekcją, aby wprowadzić komórki w fazę wzrostu wykładniczego podczas procedury.
30. Miesza się 5 μl Lipofectamine z 250 μl DMEM i inkubuje w temperaturze pokojowej przez 5 min.
31. Mieszaninę Lipofectamine-Medium dodaje się do DNA (trawienie Pac I) i miesza, uderzając probkę reakcyjną o dłoń; nie mieszać poprzez pipetowanie. Mieszaninę inkubuje się przez 20 min w temperaturze pokojowej.
32. Mieszaninę do transfekcji dodaje się do komórek i kołysze płytką, aby wymieszać. Inkubuje się w 37°C z 5% CO₂. Wymienia się medium po 4-5 godzinach.
33. Dwa dni po transfekcji pobiera się medium z komórek i przelewa je do świeżej kolby hodowlanej (75 cm²).
34. Traktuje się komórki 500 μl trypsyny przez maksymalnie 5 min. Dodaje się do komórek 1 ml DMEM, pobiera całą mieszaninę i przelewa ją wraz z 17 ml świeżego medium (DMEM z FCS) do kolby hodowlanej. Hoduje się komórki w 37°C z 5% CO₂ aż do pojawienia się efektów cytopatycznych (CPE). Patrz Rysunek 2, aby zobaczyć, jak powinny wyglądać CPE.
35. Zbiera się komórki wraz z medium do probówki 50 ml i zamraża w -80°C. Rozbija się komórki za pomocą trzech cykli zamrażania i rozmrażania (-80°C/kąpiel wodna 37°C).
36. Wiruje się przez 20 min przy 8000xg i 4°C. Supernatant odlewa się do naczynia o średnicy 100 mm, a pellet usuwa. Do przefiltrowania supernatantu używa się sterylnego filtra o rozmiarze porów 0,45 μm. Jest to pierwszy zapas wirusa (pasaż 1).
37. Używa się 1/3 tego zapasu do transdukcji kolby 75 cm² z komórkami QBI-HEK 293 o 70% konfluencji. Inkubuje się w 37°C i 5% CO₂ do czasu pojawienia się CPE.
38. Jeśli komórki wykażą CPE, zbiera się je i ekstrahuje wirusy w sposób opisany wcześniej. Jest to pasaż 2 wirusa.
39. Powtarza się kroki 2.37 i 2.38 z wirusem pasażu 2 i tak dalej, aż amplifikacja wirusów pozwoli na uzyskanie wystarczającego zapasu. Wirus może być skoncentrowany za pomocą specyficznych probówek do wirowania (jednostka filtrująca Amicon Ultra-15 z membraną ultracel-100 od Millipore) i przechowywany przez kilka miesięcy w -80°C. Do przeliczenia cząstek infekcyjnych stosuje się test plackowy.
40. Używa się wirusa pasażu 2 lub wyższego do transdukcji komórek i do dalszej amplifikacji wirusa.

3. Pierwotna hodowla komórkowa i transdukcja adenowirusowa

1. Sterylne okrągłe szkiełka nakrywkowe o średnicy 20 mm umieszcza się w standardowych płytkach 12-dołkowych.
2. 20 μl roztworu ECM rozprowadza się równomiernie na każdym szkiełku nakrywkowym. Nadmiar roztworu usuwa się. Suszenie powinno trwać minimum 1 h w temperaturze 37° C. Alternatywnie powłokę można suszyć przez noc (12 h) w temperaturze pokojowej.
3. Każdy dołek wypełnia się 1 ml Medium M199 z dodatkami zawierającymi antybiotyki oraz ITS.
4. Do każdego dołka dodaje się od 200 do 400 μl zawiesiny komórkowej (z kroku 1.21). Hodowla komórek odbywa się w temperaturze 37°C w inkubatorze z 5% CO₂.
5. Pozostawia się komórki do osadzenia, a po 1 h wymienia medium.
6. Bezpośrednio po wymianie medium, odpowiednią ilość roztworu zawierającego wirusa (z pasażu 2 lub wyższego) miesza się poprzez delikatne kołysanie płytki.
7. W przypadku długoterminowej hodowli medium wymienia się co 2 dni.
8. Ekspresja GEB jest wykrywalna 24 godziny po transfekcji.

4. Obrazowanie konfokalne struktur podkomórkowych 3D i sygnałów Ca²⁺

Obrazowanie konfokalne można przeprowadzić na dowolnym mikroskopie konfokalnym. Jednakże eksperymenty z obrazowaniem wapnia wymagają szybkości akwizycji co najmniej na poziomie częstotliwości wideo (25-30 Hz). Ogranicza to dostępne technologie do skanerów wielowiązkowych (np. tarcza Nipkowa, skaner z przemieszczaną wiązką lub skaner z macierzą tysiąca wiązek) lub bardzo szybkich skanerów jednowiązkowych (np. skaner rezonansowy lub skaner z akustyczno-optycznym deflektorem (AOD)). Przegląd tych technologii znajduje się w Ref. 3. Obrazowanie subkomórkowe 3D wymaga napędu w osi z. W niniejszej procedurze zastosowano skaner z macierzą tysiąca wiązek (VTinfinity, VisiTech Int., Sunderland, UK).

1. Mikroskop i urządzenia peryferyjne muszą zostać wprowadzone w tryb pracy. W przypadku lasera może to wymagać okresu rozgrzewania aż do osiągnięcia stabilnej mocy wyjściowej.
2. Komórki należy przenieść do komory eksperymentalnej (transfer lamellki). Lamellki z komórkami są przenoszone do komory eksperymentalnej, po czym dodaje się 1mL roztworu Tyrode'a (zawierającego 1.8 mM wapnia zewnątrzkomórkowego).
3. Komorę eksperymentalną należy umieścić na stole mikroskopu. Odpowiednio należy ustawić elektrody stymulujące, układ perfuzyjny oraz pozostałe urządzenia peryferyjne, np. kontrolę temperatury.
4. Ostrość na komórkach zostanie ustawiona, a same komórki zostaną wybrane przy użyciu światła białego i/lub oświetlenia epifluorescencyjnego.
5. Należy ustawić parametry akwizycji, takie jak moc lasera, czas ekspozycji itp., lub cały protokół eksperymentu.
6. Można pozyskiwać serie czasowe i/lub obrazy z przekrojów Z (Z-section).
7. W tak przygotowanym układzie można przeprowadzać zaawansowane pomiary wielomodalne z wykorzystaniem elektrofizjologii (patch-clamp) i/lub manipulacji optycznych, takich jak redystrybucja fluorescencji po fotowybielaniu (FRAP) lub uwalnianie substancji z klatek (uncaging), w tym fotoliza dwufotonowa.
8. Analiza obrazu, a w szczególności rekonstrukcja 3D, jest wykonywana w dedykowanym oprogramowaniu analitycznym, takim jak Imaris (Bitplane AG, Zürich, Switzerland), VeloCity (Improvision, Coventry, UK) lub Arivis Browser (arivis GmbH, Rostock, Germany).

5. Reprezentatywne wyniki:

Końcowymi wynikami protokołu są sekwencje obrazów, które mogą zostać wykorzystane do dalszej ekstrakcji danych.

Przykładem jest badanie struktur i organelli subkomórkowych. Rysunek 3 przedstawia przykład trójwymiarowego rozmieszczenia aparatu Golgiego. W przeciwieństwie do mikroskopii elektronowej wszystkie badania można przeprowadzić na żywych komórkach.

Rycina 1: Ogólny przebieg głównych etapów eksperymentu.

Rysunek 2: Obraz po lewej przedstawia komórki Q-HEK w hodowli z konfluencją 90-95%, które nie zostały poddane transdukcji. Efekty cytopatyczne po transdukcji wirusowej pokazano w części prawej. Komórki zaokrąglają się i odrywają od dna płytki. W tych komórkach jądro zajmuje większą część komórki w wyniku aktywnej produkcji wirusa.

Rysunek 3: Miocyt serca dorosłego szczura transfekowany białkiem fuzyjnym YFP celującym w aparat Golgiego. Miocyty serca po adenowirusowym transferze genów (jeden dzień w hodowli) wykazują ekspresję fluorescencyjnego białka fuzyjnego. Panel A przedstawia pojedynczy przekrój konfokalny wykonany ze stosu z-stack. W panelu B przedstawiono tę samą komórkę po dekonwolucji z wykorzystaniem teoretycznej funkcji rozmycia punktowego (PSF). Ten obraz o zredukowanym rozmyciu służy następnie do renderowania komórki w celu uzyskania rekonstrukcji objętościowej 3D, jak pokazano w panelu C, lub rekonstrukcji powierzchniowej 3D (D). Pasek skali reprezentuje 10 μm.

Dyskusja

Opisaną procedurę izolacji kardiomiocytów szczura można w razie potrzeby dostosować do innych gatunków, np. myszy⁴. Parametrem wymagającym dostosowania jest mieszanina enzymów do trawienia (patrz poniżej), a także czas trwania tego procesu. Należy pamiętać, że komórki niektórych gatunków (np. myszy) mogą być bardziej delikatne niż komórki innych (np. szczura).

Wybór kolagenazy jest prawdopodobnie najważniejszym etapem procedury izolacji. Wybieramy Liberase Blendzyme, ponieważ jest ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Roztwór znieczulający	Serumwerk Bernburg GmbH (Ursotamin), Bayer Health Care (Rompun)		Mieszanina 1 ml Ursotamin (100 mg/ml chlorowodorku ketaminy) i 240 μRompun (2% chlorowodorek ksylazyny)
Roztwór cytrynianu			117,64 mg cytrynianu sodu w 10 ml 0,9% roztworu NaCl
Roztwór A			134 mM NaCl, 4 mM KCl, 11 mM glukozy, 1,2 mM MgSO44, 1,2 mM Na2HPO4, 10 mM HEPES, pH skorygowane do 7,35 przy użyciu 10 M NaOH, filtrowane sterylnie
Roztwór A+			Zawartość roztworu A oraz 0,2 mM EGTA, pH skorygowane do 7,35 przy użyciu 10 M NaOH, przefiltrowane sterylnie
roztwór Liberase	F. Hoffmann‐ La Roche Ltd.	11988476 001	500 μroztwór zapasowy w 15 ml roztworu A (roztwór zapasowy: 10 mg/ml Liberase Blendzyme 4 w wodzie destylowanej)
Roztwór B			Zawartość roztworu A plus 200 μM CaCl22 oraz 0,1% roztwór DNazy
Roztwór B1/2			mieszanina roztworu A i roztworu B w stosunku 1:1
roztwór DNazy	Sigma-Aldrich	D4527	Deoksiribonukleazę I, typ 2 z trzustki bydlęcej, 40 KU (15 mg) rozpuszcza się w 5 ml 10 mM Tris‐bufor HCl, z pH dostrojonym do 7,35, dodatkowa zawartość: 50 mM NaCl, 10 mM MgCl22, 1 mM ditiotreitolu–erytrytol; roztwór ten miesza się z 5 ml glicerolu
Roztwór białek macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM)	Roztwór białek macierzy pozakomórkowej (ECM)	E1270	1 ml roztworu zapasowego w postaci zakupionej rozcieńcza się w 6 ml pożywki M199
Pożywka M199	Laboratoria PAA	E15‐834	Pożywka M199 uzupełniona o 1 μroztwór ITS l/ml oraz 20 μl/ml penicyliny‐roztwór streptomycyny (5000 jednostek/ml)
roztwór ITS			25 mg insuliny, 25 mg transferyny i 50 μRoztwór zapasu selenitu rozpuszcza się w 5 ml wody destylowanej (roztwór zapasu: 0,5 mg/ml selenitu sodu w wodzie destylowanej). Należy dodać kilka kropel 1 M HCl, aż do uzyskania klarownego roztworu. Alikwoty można mrozić.
roztwór Tyrode'a			135 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 1,8 mM CaCl22, 2 mM MgCl22, 10 mM glukozy, 10 mM HEPES, pH skorygowane do 7,35 przy użyciu 10 M NaOH, filtrowane sterylnie
Mieszanina główna			5 μl 10×PCR‐Bufor, 5 μl MgCl22 (25 mM), 2 μstarter forward l, 2 μodwrócony primer l, 1 μ1 μL dNTP´s (po 10 mM), 33 μl H2O, 1 μl DMSO, 1 μl Taq‐polimeraza DNA dla każdej próbki
LB‐Pożywka			10 g/l tryptony, 5 g/l ekstraktu drożdżowego, 5 g/l NaCl (oraz 15 g/l agaru, jeśli stosowane jako pożywka stała), pH 7,0
Pac I	New England Biolabs	R0547L	przygotowanie: 50 μg DNA, 5 μl 10×bufor, 0,5 μl 100×BSA, 0,75 μw Pac I, napełnić H2do uzyskania objętości końcowej 50μl