Półautomatyczna optyczna analiza rytmu serca w przypadku małych serc

Podsumowanie

Opracowaliśmy półautomatyczną metodę optycznej analizy bicia serca (SOHA) do analizy szybkich nagrań optycznych z serc Drosophila, rybek danio oraz embrionów myszy. Prezentujemy zastosowanie naszej metodologii w analizie funkcji serca muszki owocowej oraz embrionów myszy.

Streszczenie

Opracowaliśmy metodę analizy szybkich zapisów optycznych zDrosophila, serca danio pręgowanego oraz embrionalne serca myszy (Fink, et. al., 2009). Nasza metoda Półautomatycznej Optycznej Analizy Tętna (SOHA) wykorzystuje nowatorski algorytm detekcji ruchu, który jest w stanie wykryć ruchy serca związane z poszczególnymi zdarzeniami skurczowymi i rozkurczowymi. Program dostarcza szereg fizjologicznie istotnych odczytów, w tym odstępy skurczowe i rozkurczowe, częstość akcji serca, a także jakościowe i ilościowe miary arytmii tętna. Program oblicza również pomiary średnicy serca podczas rozkurczu i skurczu, na podstawie których wyliczane są procentowe skrócenie frakcyjne oraz zmiany powierzchni frakcyjnej. Wyniki są dostarczane w formie pliku cyfrowego kompatybilnego z większością programów do arkuszy kalkulacyjnych. Pomiary są dokonywane dla każdego uderzenia serca w zapisie, co zwiększa moc statystyczną wyników. Prezentujemy każdy z etapów wymagających wprowadzenia danych przez użytkownika oraz pokazujemy zastosowanie naszej metodologii w analizie funkcji serca we wszystkich trzech genetycznie modyfikowalnych modelach serca.

Protokół

Kliknij tutaj, aby przejrzeć opis procedury półautomatycznej analizy rytmu serca (SOHA).

Półautomatyczna optyczna analiza tętna

1. Obróbka wstępna -

Ten etap dostarcza informacji na temat rozkurczowej i skurczowej średnicy serca.

Krawędzie serca są identyfikowane i zaznaczane podczas maksymalnego rozkurczu i skurczu. Nagrania optyczne można odtwarzać z niską prędkością, a nawet klatka po klatce, co pozwala na precyzyjne zidentyfikowanie klatek, w których następuje maksymalny skurcz i rozkurcz serca. Wykonuje się jedną parę oznaczeń wskazujących krawędzie w rozkurczu oraz jedną parę wskazującą krawędzie w skurczu. Oznaczenia można również wprowadzać podwójnie w różnych poziomach wzdłuż serca.

Średnice serca uzyskane na tym etapie służą również do obliczenia dodatkowego parametru, który pozwala oszacować kurczliwość serca. Miarą tą jest procentowe skrócenie frakcyjne (%FS), które określa zakres, w jakim krawędzie serca zbliżają się do siebie podczas skurczu. Wzór stosowany do obliczenia %FS to:

(((średnica rozkurczowa - średnica skurczowa)/średnica rozkurczowa) x 100)

Uwaga – punkty zidentyfikowane w tym zestawie służą wyłącznie do pomiarów średnicy i skrócenia frakcyjnego i nie są wykorzystywane do wykrywania ruchu.

Przykład: U Drosophila mutacje punktowe w domenie transduktora ciężkiego łańcucha miozyny, regionie znanym z modulowania aktywności enzymatycznej silnika molekularnego, prowadzą do powstania serc rozszerzonych lub zwężonych, w zależności od tego, czy hamują one, czy nasilają aktywność ATPase miozyny (Cammarato, et al. 2008). Tego rodzaju pomiary nie mogą być wykonywane u nienaruszonych much, ponieważ zazwyczaj nie jest możliwe zidentyfikowanie krawędzi serca wzdłuż całej długości rurki serca przez kutykulę i tłuszcz (porównać tryby M dla Wildtype, D45 i Mhc5 na poniższym „Rysunku trybu M”), które normalnie otaczają serce. Pomiary wykonywane podczas wizualizacji serca u nienaruszonych much przy użyciu innych powszechnie stosowanych metod są zazwyczaj ograniczone do najbardziej przedniej części serca, czyli regionu komory stożkowej. Nie jest również możliwe uzyskanie takiego pomiaru dynamicznego w utrwalonej tkance.

2. Detekcja ruchu-

Ten krok jest wykonywany automatycznie przez program i wykorzystuje dwa różne algorytmy do analizy ruchu w każdym filmie. W skrócie, pierwszy algorytm, tzw. algorytm „średniej ciemności klatki” (Average Frame Darkness), stosuje podejście klatka po klatce. Algorytm ten oblicza średnią intensywność ciemności dla całej klatki filmu, normalizuje tę wartość do przedziału od 0 do 1 i nanosi na wykres znormalizowaną średnią dla każdej klatki filmu w funkcji czasu. Drugie podejście, algorytm „piksel po pikselu” (Pixel by Pixel), analizuje zmianę ciemności wszystkich poszczególnych pikseli z jednej klatki do następnej. Piksele wykazujące zmiany intensywności powyżej zadanego progu są sumowane dla każdej klatki i naniesione na wykres dla każdej klatki filmu w funkcji czasu.

3. Interwały kontrolne-

Wyniki z dwóch algorytmów detekcji ruchu są wyświetlane w tym module, przy czym wynik „Average Darkness” prezentowany jest w oknie powyżej okna wyniku „Pixel by pixel”. Aby upewnić się, że przedziały detekcji są zgodne z ruchem w rzeczywistym filmie, bezpośrednio poniżej okien wyników algorytmów wyświetlamy ślad krawędzi lub obraz w trybie M (M-mode) utworzony z analizowanych klatek. Obraz M-mode powstaje poprzez cyfrowe wycinanie z każdej klatki filmu plastrów o szerokości jednego piksela przechodzących przez serce i ustawianie ich poziomo, co zapewnia przekrój ruchów krawędzi serca w czasie. W oknie „Pixel by pixel” zidentyfikowane przedziały rozkurczowe są oznaczone poziomą zieloną linią, a bezpośrednio nad nią znajduje się liczba klatek wchodzących w skład tego przedziału. Przedziały skurczowe są identyfikowane jako odstęp między dwoma następującymi po sobie rozkurczami. Początek skurczu w trybie M-mode jest zaznaczony pionową niebieską linią, a koniec – pionową czerwoną linią. Dzięki takiemu sposobowi wyświetlania stosunkowo łatwo jest ocenić, czy wyniki algorytmu są zgodne z rzeczywistymi ruchami serca.

Choć detekcja ruchu odbywa się automatycznie, wynik należy sprawdzić pod kątem dokładności. Wynika to z kilku przyczyn; jedną z nich jest często występująca w tle powolna fluktuacja poziomu światła, niezwiązana z ruchem serca. Można ją zazwyczaj wyeliminować za pomocą wbudowanego filtra górnoprzepustowego. Druga przyczyna wiąże się z czułością podejścia „Pixel by pixel”. Wynikiem działania tego algorytmu są zazwyczaj dwa ślady ruchu: jeden dla skurczu, a drugi dla rozkurczu. U starszych much oraz u niektórych mutantów czas pomiędzy tymi dwoma ruchami ulega wydłużeniu, przez co program próbuje zinterpretować je jako dwa oddzielne uderzenia. Można to skorygować, prosząc program o porównanie wyników algorytmu Pixel by Pixel z wynikami algorytmu Average Frame Darkness poprzez zaznaczenie pola „Use darkness”.

Przykład (patrz w filmie): U much w wieku od 5 do 7 tygodni odstępy skurczowe są zazwyczaj znacznie dłuższe niż u młodych much. Te długie odstępy są początkowo wykrywane jako dwa oddzielne skurcze przedzielone krótkim rozkurczem. Można to skorygować, zaznaczając pole wyboru „Use darkness”. W takim przypadku program porówna odstęp rozkurczowy zidentyfikowany przez algorytm Pixel by Pixel z wynikiem Average Frame Darkness. Jeśli wynik Average Frame Darkness ma wartość dodatnią, każdy odstęp rozkurczowy zidentyfikowany w algorytmie Pixel by Pixel zostanie zignorowany, a odstępy zostaną określone prawidłowo. Cały film można skanować w 10-sekundowych segmentach i akceptować (klikając „Data OK”) lub odrzucać (klikając „Discard Data”). Czułość filtrów górno- i dolnoprzepustowych (Hi and Lo pass filter) można dostosować ręcznie, aby dokładniej zdefiniować odstępy skurczowe przy zastosowaniu algorytmu Darkness.

4. Statystyki wyjściowe-

Po zaakceptowaniu wyników dla danego filmu program wykorzysta te informacje do automatycznego obliczenia szeregu parametrów. Obejmują one odstępy rozkurczowe i skurczowe, okres pracy serca i częstość akcji serca, kierunek i prędkość fali skurczu, średnice serca oraz %FS. Dodatkowo program posiada wiele metod ilościowego określania arytmii odzwierciedlających nierównomierne cykle skurczu i rozkurczu (patrz Fink et al, 2009). Wyniki statystyczne są dostarczane dla każdego filmu z osobna oraz dla całego zestawu danych w formie pliku wartości rozdzielonych przecinkami (.csv), który można otworzyć w programach do arkuszy kalkulacyjnych, takich jak Microsoft Excel.

Tabela 1-

Przykład wyników wygenerowanych przez program Semi-automated Optical Heart Analysis.

5. Aktualizacja histogramów-

Ta część programu wyświetla wszystkie dane dotyczące odstępów między uderzeniami serca dla danego zestawu danych w formie histogramu. Ponieważ częstość akcji serca jest zmienna, normalizujemy dane wyjściowe histogramu. Jednak ze względu na to, że rozkład odstępów nie jest symetryczny względem średniej, do normalizacji wykorzystujemy medianę wartości odstępów.

Przykład (patrz wideo): Muchy z mutacją kanału potasowego KCNQ wykazują niezwykle nieregularne odstępy rozkurczowe i skurczowe. Zazwyczaj odstępy skurczowe są znacznie dłuższe i bardziej nieregularne niż u much dzikich w tym samym wieku. Można to wyraźnie zauważyć, prezentując dane w formie histogramu (patrz również Ocorr et al. 2007).

6. Tryb M-

Ten moduł generuje tryby M, które można utworzyć z dowolnej pozycji wzdłuż serca w klatce filmu. Można również określić długość trybu M. Tryby M są przydatne do jakościowego przedstawienia pracy serca w filmie.

Przykład (patrz w wideo): Film przedstawiający serce 3-dniowej larwy zebrafish z widoczną przednią częścią komory, która służy do wygenerowania obrazu w trybie M. Pionowy wycinek pikseli, który zostanie elektronicznie wycięty z każdej klatki filmu, zaznaczono czerwoną linią.

Rycina M-mode: Przykłady obrazowania w trybie M u muszki owocówki (Drosophila) i rybki zebrafish. Jedna z omówionych w kroku wstępnego przetwarzania mutacji miozyny prowadzi do powstania silnika molekularnego o szybszej kinetyce enzymatycznej, co skutkuje restrykcją serca, a sporadycznie blokiem przewodzenia. Oba parametry można przedstawić jakościowo za pomocą trybu M.

Obrazowanie w trybie M wykonane w tym samym obszarze serca u much dzikich i mutantów wyraźnie pokazuje fenotyp restrykcyjny u mutanta Mhc⁵ oraz powiększone średnice i arytmiczne cykle skurczów u mutanta D45 (który wykazuje ekspresję miozyny o obniżonej kinetyce enzymatycznej) (zmodyfikowano na podstawie Cammarato et al., 2008).

Tryb M wykonany z serca larwy Zebrafish, pokazujący przednią część komory (ten sam film z sercem, który zaprezentowano w demonstracji, Fink et.al. 2009).

7. Film Red Dot-

Ten moduł automatycznie generuje spowolnioną (1:4), 20-sekundową wersję analizowanego filmu, w której wszystkie piksele zidentyfikowane jako zmieniające się są zaznaczone na czerwono. Funkcja ta służy przede wszystkim do celów ilustracyjnych.

Film 1 - „Film z czerwonymi kropkami” przedstawiający piksele, w których algorytmy programu zidentyfikowały zmiany intensywności zaciemnienia, zaznaczone kolorem czerwonym. Prędkość filmu została zmniejszona czterokrotnie w stosunku do oryginału.
Kliknij tutaj, aby pobrać Film 1.

8. Dodatkowe zastosowania-

Zaczęliśmy stosować ten system analityczny do filmów wysokich prędkości innych modeli z małymi sercami, które często są trudne do analizy przy użyciu tradycyjnej metodologii. Z sukcesem zastosowaliśmy tę analizę zarówno do serc larwalnych danio pręgowanego, jak i do embrionalnych serc myszy (Fink et al, 2009).

Film 2 - Film przedstawiający serce myszy wraz z ryciną interwałów kontrolnych i wynikiem danych.
Kliknij tutaj, aby pobrać Film 2.

Dyskusja

Model Drosophila okazał się potężnym narzędziem genetycznym, które wykorzystywano do badania różnorodnych kwestii naukowych, od rozwoju embrionalnego po procesy uczenia się i pamięć. Ostatnio ten wszechstronny organizm modelowy został zastosowany do badania genetyki funkcji serca. Wiele prób ilościowej oceny fizjologii serca u dorosłych Drosophila opierało się na obserwacjach przeprowadzanych u nienaruszonych much poprzez kutykulę odwłoka. Większość tych podejść opiera się na obserwacji wizualnej lub rejestracji zmian na...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Oprogramowanie MatLab	Mathworks		Wymagane środowisko dla oprogramowania analitycznego.
Cyfrowa kamera EM-CCD	Hamamatsu Corp.	9100 lub 9300	Inne szybkie kamery cyfrowe również będą odpowiednie.
Oprogramowanie do akwizycji danych obrazowych HC	Hamamatsu Corp.		Inne oprogramowanie do akwizycji obrazu, które generuje pliki wideo w formacie avi, również będzie odpowiednie.
Mikroskop świetlny z obiektywem 10x	Leica Microsystems		Zastosowanie obiektywu immersyjnego, który eliminuje granicę faz powietrze-woda, znacznie poprawia rozdzielczość