W niniejszym filmie przedstawiono i porównano dwa modele eksperymentalne służące do badania rozwoju obliteracyjnej choroby dróg oddechowych (OAD) u myszy: model heterotopowej oraz ortotopowej transplantacji tchawicy.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Heterotopowe i ortotopowe przeszczepy tchawicy u myszy wykorzystywane jako modele do badania rozwoju obliteracyjnej choroby dróg oddechowych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Z obliteracyjną chorobą dróg oddechowych (OAD) wiąże się główna komplikacja po transplantacjach płuc, która ogranicza długoterminową przeżywalność (1-7).
Aby zbadać patofizjologię, leczenie i zapobieganie OAD, opracowano różne modele zwierzęce transplantacji tchawicy u gryzoni (1-7). W niniejszej pracy wykorzystujemy dwa uznane modele transplantacji tchawicy – model heterotopowy oraz ortotopowy – i przedstawiamy ich zalety oraz ograniczenia.
W modelu heterotopowym tchawica dawcy jest owinięta w sieci większą biorcy, natomiast w modelu ortotopowym tchawica dawcy jest łączona za pomocą anastomozy końcówka-końcówka.
W obu modelach wykazano rozwój zmian z obliteracją, które pod względem histologicznym są podobne do klinicznego OAD (1-7).
W niniejszym filmie pokazano, jak przeprowadzić technikę transplantacji tchawicy u myszy, zarówno w sposób heterotopowy, jak i ortotopowy, oraz porównano przebieg czasowy rozwoju OAD w obu modelach z wykorzystaniem histologii.
Protokół
- Samce myszy Balb/C (8-12 tygodni) są nabywane z Charles River Laboratories (Sulzfeld, Niemcy). Myszy są utrzymywane w konwencjonalnych warunkach, karmione standardową karmą dla myszy i pojoną wodą ad libitum.
- Do znieczulenia stosuje się 2% Isofluran.
PRZYGOTOWANIE DONORA
- Obgolone włosy z okolic brzucha i zdezynfekowano ten obszar za pomocą betaisodony.
- Pod kontrolą mikroskopu wykonano cięcie w linii środkowej szyi od poziomu krtani do mostka.
- Usunięto tkankę tłuszczową podskórną oraz mięśnie pasmowate, aby uzyskać wyraźny widok tchawicy.
- Wypreparowano tchawicę z otaczających ją tkanek, takich jak przełyk, nerwy, tętnice i tkanka łączna.
- Usunięto całą tchawicę (od krtani do rozwidlenia).
- Przeszukano przeszczep zimną solą fizjologiczną i przechowywano go w temperaturze 4°C.
- Dawca został poddany eutanazji poprzez zwichnięcie szyi po pobraniu tchawicy.
ODBIORCA: PRZESZCZEP HETEROTOPICZNY
- Ogolić włosy na brzuchu w szerokim marginesie wokół miejsca nacięcia i zdezynfekować ten obszar trzykrotnie, używając betaisodony (betadyny), a następnie alkoholu. Oczy należy przesmarować maścią oftalmiczną, aby zapobiec wysychaniu rogówek.
- Wykonać laparotomię pośrodkową i umieścić jelita w sterylnej, zwilżonej rękawiczce.
- Ostrożnie rozłożyć sieciówkę większą. Umieścić przeszczep w centrum i utrwalić go pojedynczym szwem 8-0 (Prolene, Ethicon, Germany).
- Całkowicie przykryć przeszczep sieciówką większą i utrwalić go pojedynczym szwem 8-0 (Prolene, Ethicon, Germany).
- Włożyć jelita z powrotem do jamy brzusznej i wypłukać ciepłym, sterylnym roztworem soli fizjologicznej przed zamknięciem.
- Zamknąć ranę w dwóch warstwach – ścianę brzucha i skórę – stosując szew ciągły, używając nici 7-0 Prolene dla mięśni oraz 7-0 Vicryl dla skóry.
ODBIORCA: PRZESZCZEP ORTOTOPOWY
- Wygolić włosy z brzucha na szerokim obszarze wokół miejsca nacięcia i zdezynfekować ten obszar trzykrotnie, używając betaisodony (betadyny), a następnie alkoholu. Oczy należy nasmarować maścią oftalmiczną, aby zapobiec wysychaniu rogówek.
- Rozdzielić mięśnie paskowate, aby uwidocznić cały kompleks krtaniowo-tchawkowy.
- Ostrożnie wypreparować tchawicę z otaczających tkanek, dbając o zachowanie wstecznych nerwów krtaniowych.
- Przeciąć tchawicę na poziomie trzech pierścieni w kierunku ogonowym od chrząstki pierścieniowatej. Zwierzę utrzymuje fizjologiczne oddychanie poprzez tracheostomię.
- Zapewnić czyste krawędzie tchawicy zarówno u biorcy, jak i w przeszczepie.
- Przeszczep umieszcza się pomiędzy ubytkami tchawicy biorcy, orientując go tak, aby zachować polarność anatomiczną.
- Za pomocą nici 8-0 (Prolene, Ethicon, Niemcy) przeprowadzić anastomozę przeszczepu dawcy z dystalną (śródpiersową) częścią tchawicy. Tylną część anastomozy wykonuje się szwem ciągłym. Część przednią kończy się następnie szwami przerywanymi.
- Usunąć wszelkie wydzieliny z dróg oddechowych.
- Następnie anastomozę proksymalną wykonuje się w ten sam sposób, co dystalną.
- Upewnić się co do drożności dróg oddechowych oraz prawidłowego, spontanicznego oddychania.
- Przywrócić na miejsce mięśnie paskowate, a następnie zamknąć tkankę podskórną i warstwę skóry, używając szwów 6-0 (Vicryl, Ethicon, Niemcy) metodą ciągłą.
- W przypadku biorcy zastosować znieczulenie iniekcyjne, dzięki czemu zwierzę zachowa fizjologiczne oddychanie przez tchawicę. Do znieczulenia d.o. (i.p.) u myszy stosuje się kombinację propofolu, medetomidyny i fentanylu w dawkach odpowiednio 75/1/0,2 mg/kg.
Rycina 1: Tchawica dawcy.
1A: Tchawica dawcy in situ po przygotowaniu.
1B: Wycięta tchawica dawcy.
1C: Tchawica dawcy po eksplantacji.
Rysunek 2: Model heterotopowy.
2A: Przeszczep jest umieszczony w centrum sieci wielkiego omentum.
2B: Przeszczep jest utrwalony na obu końcach pojedynczym szwem.
2C: Przeszczep jest owinięty w sieci wielkiego omentum i utrwalony pojedynczym szwem.
Rycina 3: Model ortotopowy.
3A: Przeszczep jest umieszczony pomiędzy defektami tchawicy biorcy, a ścianę tylną zeszyto za pomocą szwu ciągłego.
3B: Ścianę przednią zamknięto za pomocą pojedynczego szwu.
Rysunek 4: Histologia.
4A: Odzyskana heterotopowo przeszczepiona tchawica po 28 dniach w barwieniu H+E (15x). Zwróć uwagę na 100% obliterację światła.
4B: Odzyskana ortotopowo przeszczepiona tchawica po 60 dniach w barwieniu H+E (15x). Maksymalnie osiągnięta obliteracja światła wynosi około 45%.
| Model heterotopicznego przeszczepu tchawicy | Model ortotopowego przeszczepu tchawicy | |
| Zalety | + Łatwość wykonania + Obliteracja światła z całkowitym zamknięciem dróg oddechowych po 28 dniach + Brak fizycznego wpływu OAD na zwierzęta |
+ Fizyczna wentylacja przeszczepu + Możliwość podawania leków drogą wziewną + Silne reakcje immunologiczne, takie jak produkcja alloreaktywnych przeciwciał IgM + Fizjologiczne środowisko klatki piersiowej + Anastomoza tchawica-tchawica naśladuje warunki kliniczne |
| Wady | - Brak wentylacji przeszczepionej tchawicy - Brak możliwości oceny patogenów wziewnych - Zahamowanie oczyszczania mukocyliarnego i zaleganie wydzieliny - Mikrośrodowisko otrzewnej zamiast środowiska klatki piersiowej |
- Konieczność przeszkolenia chirurgicznego - Obliteracja światła z zamknięciem światła w ok. 45% po 60 dniach - U zwierząt mogą rozwinąć się objawy OAD |
Tabela 1: Zalety i wady heterotopowego i ortotopowego przeszczepiania tchawicy.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Myszy są dostępne w różnych modelach transgenicznych i knockoutowych, w związku z czym nadają się do badania mechanistycznych kwestii związanych z OAD (4).
Oba modele transplantacji tchawicy przedstawione w tym filmie mogą służyć jako wiarygodne modele do badania rozwoju OAD.
Jednakże każdy z modeli wykazuje określone zalety i ograniczenia.
Heterotopowy przeszczep tchawicy jest łatwy do wykonania i nie wymaga specjalistycznego szkolenia chiru...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Sonja Schrepfer otrzymała grant badawczy od Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) (SCHR992/3–1).]
Wszystkie zwierzęta poddawano opiece zgodnie z Zasadami Opieki nad Zwierzętami Laboratoryjnymi (Principles of Laboratory Animal Care); doświadczenia na zwierzętach przeprowadzono zgodnie z wytycznymi i przepisami ustanowionymi przez National Society for Medical Research oraz Guide for the Care and Use of Laboratory Animals opublikowanym przez National Institutes of Health (publikacja National Institutes of Health 85-23, wersja z 1985 r.).
Wszystkie zwierzęta zostały pozyskane z Charles River Laboratories (Sulzfeld, Niemcy) i utrzymywane w jednostce opieki nad zwierzętami Uniwersyteckiego Szpitala Hamburg Eppendorf. Zwierzęta otrzymywały standardową karmę i wodę ad libitum.
Podziękowania
Autorzy dziękują Christiane Pahrmann (kierownikowi laboratorium).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Bibliografia
- Adams, B., Berry, G., Huang, X., Shorthouse, R., Brazelton, T., Morris, R. Immunosuppressive therapies for the prevention and treatment of obliterative airway disease in heterotopic rat trachea allografts. Transplantation. 69, 2260-2266 Forthcoming.
- Adams, B., Brazelton, T., Berry, G., Morris, R. The role of respiratory epithelium in a rat model of obliterative airway disease. Transplantation. 69, 661-665 Forthcoming.
- Deuse, T., Schrepfer, S., Reichenspurner, H., Hoyt, G., Fischbein, M., Robbins, R., Pelletier, M. Techniques for experimental heterotopic and orthotopic tracheal transplantations – when to use which model; Transplant Immunology 17. , 255-261 (2007).
- Hele, D., Yacoub, M., Belvisi, M. The heterotopic tracheal allograft as an animal model of obliterative bronchiolitis. Respiratory Research. 2, 169-183 Forthcoming.
- Hertz, M., Jessurun, J., King, M., Savic, S., Murray, J. Reproduction of the obliterative bronchiolitis lesion after heterotopic transplantation of mouse airways. American Journal of Pathology. 142, (1993).
- McDyer, J. Human and murine obliterative bronchiolitis in transplant. Proceedings of the American Thoracic Society. 4, 37-43 Forthcoming.
- Schrepfer, S., Deuse, T., Hoyt, G., Sheikh, A., Hoffmann, J., Reichenspurner, H., Robbins, R., Pelletier, M. Experimental orthotopic tracheal transplantation: the stanford technique. Microsurgery. 27, 187-189 (2007).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
