Mezoskopowa tomografia fluorescencyjna do obrazowania in vivo rozwijającej się Drosophila

Podsumowanie

Mezoskopowa tomografia fluorescencyjna działa poza granicami penetracji mikroskopii fluorescencyjnej z podziałem tkanek. Technika ta opiera się na oświetleniu wieloprojekcyjnym i opisie transportu fotonów. Demonstrujemy wizualizację 3D całego ciała in vivo morfogenezy dysków imaginalnych skrzydeł wyrażających GFP u Drosophila melanogaster.

Streszczenie

Wizualizacja rozwoju tworzenia się narządów, jak również postępu i leczenia chorób często w dużym stopniu opiera się na zdolności do optycznego badania zmian molekularnych i funkcjonalnych w nienaruszonych organizmach żywych. Większość istniejących metod obrazowania optycznego jest nieodpowiednia do obrazowania w wymiarach, które mieszczą się między granicami penetracji nowoczesnej mikroskopii optycznej (0,5-1 mm) a limitami narzuconymi dyfuzją makroskopii optycznej (>1 cm) [1]. W związku z tym wiele ważnych organizmów modelowych, np. owady, zarodki zwierzęce lub kończyny małych zwierząt, pozostaje niedostępnych do obrazowania optycznego in vivo.

Chociaż rośnie zainteresowanie rozwojem metod obrazowania optycznego o rozdzielczości nanometrów, nie podjęto wielu udanych prób poprawy głębokości penetracji obrazowania. Możliwość wykonywania obrazowania in vivo poza granicami mikroskopii napotyka na trudności związane z rozpraszaniem fotonów obecnym w tkankach. Niedawne próby obrazowania całych zarodków, na przykład [2,3], wymagają specjalnej obróbki chemicznej próbki, aby oczyścić je z rozproszenia, procedury, która sprawia, że nadają się one tylko do obrazowania pośmiertnego. Metody te wskazują jednak na potrzebę obrazowania większych próbek niż te, które zwykle pozwalają na to mikroskopia dwufotonowa lub konfokalna, zwłaszcza w biologii rozwoju i odkrywaniu leków.

Opracowaliśmy nową technikę obrazowania optycznego o nazwie Mezoskopowa Tomografia Fluorescencyjna [4], która jest odpowiednia do nieinwazyjnego obrazowania in vivo w wymiarach 1mm-5mm. Metoda ta wymienia rozdzielczość na głębokość penetracji, ale oferuje bezprecedensową wydajność obrazowania tomograficznego i została opracowana w celu dodania czasu jako nowego wymiaru w obserwacjach biologii rozwojowej (i być może w innych obszarach badań biologicznych) poprzez przekazanie możliwości obrazowania ewolucji odpowiedzi znakowanych fluorescencją w czasie. W związku z tym może przyspieszyć badania morfologicznych lub funkcjonalnych zależności od mutacji genów lub bodźców zewnętrznych, a co ważne, może uchwycić pełny obraz rozwoju lub funkcji tkanek, umożliwiając podłużną wizualizację poklatkową tego samego, rozwijającego się organizmu.

Technika wykorzystuje zmodyfikowany mikroskop laboratoryjny i oświetlenie wieloprojekcyjne do zbierania danych w projekcjach 360 stopni. Zastosowano w nim uproszczenie Fermiego do rozwiązania równania transportu fotonów metodą Fokkera-Planka, w połączeniu z zasadami optyki geometrycznej w celu zbudowania realistycznego schematu inwersji odpowiedniego dla zasięgu mezoskopowego. Pozwala to na wizualizację in vivo całego ciała nieprzezroczystych trójwymiarowych struktur w próbkach o wielkości do kilku milimetrów.

Pokazaliśmy wydajność techniki in vivo, obrazując trójwymiarowe struktury rozwijających się tkanek Drosophila in vivo i śledząc morfogenezę skrzydeł w nieprzezroczystych poczwarkach Drosophila w czasie rzeczywistym przez sześć kolejnych godzin.

Protokół

Zasoby Drosophila melanogaster użyte w tym eksperymencie są następujące:

• elav-Gal4 (FBti0002575)
• ap-Gal4md544 (FBal0051787)
• UAS-srcEGFP (FBti0013990)
• w1118 (FBal0018186)

We wszystkich eksperymentach system UAS-Gal4 był używany do nadekspresji GFP w interesującej tkance (np. gruczołach ślinowych lub krążkach skrzydeł). Mówiąc dokładniej, samice much transgenicznych z odpowiednim Gal4 skrzyżowano z transgenicznymi partnerami UAS-EGFP. Krzyżówki hodowano w temperaturze 25°C w wilgotnym inkubatorze. Kiedy poczwarki zaczynają zapełniać fiolki (około 5-6 dni po rozpoczęciu krzyżowania), zostały wybrane do fluorescencji GFP w fazie białej poczwarki (0-1 godzina po utworzeniu poczwarki) i pobrane do obrazowania tomograficznego.

1. Ustaw odpowiednie krzyże i tył w temperaturze 25°C
2. 5-6 dni po rozpoczęciu krzyżowania należy wybrać fluorescencyjne potomstwo do obrazowania. Użyj mokrego pędzla, aby delikatnie usunąć białe poczwarki ze ścianek fiolki.
3. Umieść poczwarki w kropli wody lub PBS umieszczonym na szalce Petriego, aby usunąć resztki jedzenia i klej, który pokrywa obudowę poczwarki i sprawia, że próbka ulega autofluorescencji. Delikatnie wyczyść pędzlem. Jeśli konieczne jest starzenie się poczwarek, umieść wybrane białe poczwarki na szalce Petriego z mokrym ręcznikiem papierowym (wilgotna komora) lub po bokach czystej fiolki z pokarmem dla much. Zapewni to wystarczającą wilgotność, aby umożliwić prawidłowy rozwój zwierzęcia.

Montaż Drosophila

1. Przyklej dolną część obudowy poczwarki do szklanej rurki kapilarnej (średnica 800 mikronów) tak, aby oś przednia/tylna muchy była zorientowana równolegle do rurki.
2. Zamocuj rurkę kapilarną pionowo na stoliku obrotowym.
3. Wyreguluj oś nachylenia stolika obrotowego tak, aby oś obrotu była równoległa do kolumn pikseli matrycy CCD do obrazowania.

Model determinacji do przodu

1. Zamocuj poczwarkę w szklance kapilarnej i zamontuj zgodnie z wcześniejszym opisem
2. Napełnij rurkę kapilarną z krzemionki (100 mikronów, OD) barwnikiem fluorescencyjnym (Cy5.5)
3. Wprowadzić rurkę kapilarną do wnętrza poczwarki pod kątem 45 stopni w stosunku do osi przedniej/tylnej
4. Oświetl poczwarkę wiązką lasera wzbudzającego z soczewką o niskiej aperturze numerycznej. Zbieraj obrazy transoświetlenia fluorescencyjnego w zakresie 360 stopni, obracając poczwarkę wzdłuż jej osi pionowej.
5. Dopasuj dane eksperymentalne do odpowiedniego modelu do przodu

Obrazowanie gruczołów ślinowych

1. Zamontuj poczwarkę wykazującą ekspresję GFP w gruczołach ślinowych, jak opisano wcześniej
2. Oświetlić wiązką wzbudzenia i zebrać w transiluminacji sygnał fluorescencyjny GFP o 360 stopni, obracając poczwarkę wzdłuż jej osi pionowej.
3. Rekonstrukcja pozyskanych danych przy użyciu modelu do przodu

Obrazowanie poklatkowe

1. Zamontuj białą poczwarkę wyrażającą GFP w wyimaginowanych dyskach skrzydła
2. Utrzymuj wilgotne środowisko obrazowania i temperaturę pokojową, aby uniknąć odwodnienia poczwarki.
3. Umieść żaluzję, aby uniknąć ciągłego oświetlenia
4. Oświetlić wiązką wzbudzenia i zebrać w transiluminacji sygnał fluorescencyjny GFP o 360 stopni, obracając poczwarkę wzdłuż jej osi pionowej.
5. Zrekonstruuj pozyskane dane przy użyciu modelu do przodu.

Histologia

1. Wypreparuj ślinianki OUN / krążki oczne w 1x PBS.
2. Utrwal tkanki w 4% formaldehydzie, 1x PEM (rurki 100mM, 1mM EGTA, 1mM MgCl₂) przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
3. Usuń mocowanie i zamontuj w Vectashield za pomocą dapi (Vector)
4. Obraz za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.

Histologia poklatkowa

1. Zbierz białe poczwarki i umieść je w wilgotnej komorze.
2. Zbieraj poczwarki na różnych etapach rozwoju
3. Nakłuć obudowę poczwarki dwukrotnie (0 godzin po utworzeniu się puparium) cienką igłą (szpilka do owadów 000, FST) przed utrwaleniem.
4. Utrwal poczwarki w 8% formaldehydzie, 1x PEM przez 6-8 godzin w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem.
5. Po usunięciu utrwalenia i spłukaniu 1x PBS, przeciąć utrwaloną poczwarkę ostrym ostrzem na dwie części prostopadłe do osi A/P;
6. Zanurz dwie części w Vectashield za pomocą dapi (Vector) i zamontuj na szkiełkach nakrywkowych (Lab-Tek) w celu obrazowania.
7. Rejestruj obrazy za pomocą fluorescencyjnego mikroskopu konfokalnego.

Rysunek 1. Proszę kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję rysunku 1.

Dyskusja

Rekonstrukcje in vivo przypadku poczwarki i gruczołów ślinowych wykazujących ekspresję GFP prepupa D . melanogaster (pasek skali, 500 mikronów) z odpowiednią histologią (niebieski, barwienie dapi; zielony, fluorescencja GFP) pokazano na ryc. 1 (a). Obrazowanie w serii poklatkowej dysków imaginalnych skrzydeł D. melanogaster pokazano na ryc. 1(b). Obrazy są uzyskiwane z pojedynczego żywego osobnika, w czterech różnych punktach czasowych (0,3,0, 3,5 i 6,5 godziny). W pierwszej kolumnie pokazano jeden rzu...