Mezoskopowa tomografia fluorescencyjna do obrazowania in-vivo rozwijających się Drosophila

Podsumowanie

Mezoskopowa tomografia fluorescencyjna działa poza limitami penetracji charakterystycznymi dla fluorescencyjnej mikroskopii sekcji tkanek. Technika ta opiera się na oświetleniu wieloprojekcyjnym oraz opisie transportu fotonów. Demonstrujemy wizualizację 3D całego organizmu in-vivo podczas morfogenezy wyobraźników skrzydeł wykazujących ekspresję GFP u Drosophila melanogaster.

Streszczenie

Wizualizacja formowania się rozwijających się organów, a także progresji i leczenia chorób, często w dużym stopniu opiera się na możliwości optycznego badania zmian molekularnych i funkcjonalnych w nienaruszonych żywych organizmach. Większość istniejących metod obrazowania optycznego jest nieodpowiednia do obrazowania w wymiarach leżących pomiędzy granicami penetracji nowoczesnej mikroskopii optycznej (0,5-1mm) a ograniczeniami dyfuzyjnymi makroskopii optycznej (>1cm) [1]. W związku z tym wiele ważnych organizmów modelowych, np. owady, embriony zwierzęce lub kończyny małych zwierząt, pozostaje niedostępnych dla optycznego obrazowania in-vivo.

Mimo rosnącego zainteresowania opracowywaniem metod obrazowania optycznego o rozdzielczości nanometrycznej, nie podjęto wielu skutecznych prób zwiększenia głębokości penetracji obrazowania. Możliwość wykonywania obrazowania in-vivo poza limitami mikroskopii napotyka w rzeczywistości trudności związane z rozpraszaniem fotonów występującym w tkankach. Niedawne próby obrazowania całych embrionów, na przykład [2,3], wymagają specjalnej obróbki chemicznej preparatu w celu usunięcia rozpraszania, co sprawia, że procedura ta nadaje się wyłącznie do obrazowania post-mortem. Metody te dowodzą jednak potrzeby obrazowania większych obiektów niż te, które są zazwyczaj dopuszczalne w mikroskopii dwufotonowej lub konfokalnej, szczególnie w biologii rozwoju i w poszukiwaniu nowych leków.

Opracowaliśmy nową technikę obrazowania optycznego o nazwie mezoskopowa tomografia fluorescencyjna [4], która jest odpowiednia do nieinwazyjnego obrazowania in vivo w wymiarach od 1mm do 5mm. Metoda ta poświęca rozdzielczość na rzecz głębokości penetracji, ale oferuje bezprecedensową wydajność obrazowania tomograficznego i została opracowana, aby wprowadzić czas jako nowy wymiar w obserwacjach biologii rozwoju (oraz potencjalnie w innych obszarach badań biologicznych), nadając zdolność obrazowania ewolucji odpowiedzi znakowanych fluorescencyjnie w czasie. W ten sposób może ona przyspieszyć badania zależności morfologicznych lub funkcjonalnych od mutacji genowych lub bodźców zewnętrznych i, co istotne, uchwycić pełny obraz rozwoju lub funkcji tkanki, umożliwiając podłużną wizualizację time-lapse tego samego, rozwijającego się organizmu.

Technika ta wykorzystuje zmodyfikowany mikroskop laboratoryjny oraz oświetlenie wieloprojekcyjne do zbierania danych w projekcjach 360 stopni. Stosuje ona uproszczenie Fermiego do rozwiązania równania Fokkera-Plancka dla równania transportu fotonów, w połączeniu z zasadami optyki geometrycznej, w celu opracowania realistycznego schematu inwersji odpowiedniego dla zakresu mezoskopowego. Umożliwia to wizualizację in-vivo całego ciała nieprzezroczystych struktur trójwymiarowych w próbkach o rozmiarach do kilku milimetrów.

Wykazaliśmy skuteczność tej techniki in vivo, obrazując trójwymiarowe struktury rozwijających się tkanek Drosophila in vivo oraz śledząc w czasie rzeczywistym morfogenezę skrzydeł u nieprzezroczystych pociorek Drosophila przez sześć kolejnych godzin.

Protokół

The Drosophila melanogaster szczepy wykorzystane w tym eksperymencie to:

• elav-Gal4 (FBti0002575)
• ap-Gal4md544 (FBal0051787)
• UAS-srcEGFP (FBti0013990)
• w1118 (FBal0018186)

W przypadku wszystkich eksperymentów system UAS-Gal4 został wykorzystany do nadekspresji GFP w badanej tkance (tj. w gruczołach ślinowych lub krążkach skrzydeł). Bardziej szczegółowo, samice much transgeniczne z odpowiednim Gal4 krzyżowano z transgenicznymi partnerami UAS-EGFP. Krzyżówki hodowano w temperaturze 25°C w nawilżanym inkubatorze. Gdy poczwarki zaczynały pojawiać się w fiolkach (około 5-6 dni po rozpoczęciu krzyżowania), wyselekcjonowano je pod kątem fluorescencji GFP w białym stadium przedpoczwarkowym (0-1 h po utworzeniu puparium) i zebrano do obrazowania tomograficznego.

1. Przygotować odpowiednie krzyżówki i hodować w temperaturze 25°C
2. 5-6 dni po rozpoczęciu krzyżówki wybrać fluorescencyjne potomstwo do obrazowania. Do delikatnego usuwania białych przepoczwarek ze ścianek fiolki należy użyć wilgotnego pędzla.
3. Umieścić przepoczwarki w kropli wody lub PBS w szalce Petriego, aby usunąć cząsteczki pokarmu oraz klej pokrywający poczwarkę, który powoduje autofluorescencję preparatu. Delikatnie oczyścić pędzlem. Jeśli konieczne jest postarzenie poczwarek, wybrane białe przepoczwarki należy umieścić w szalce Petriego z mokrym ręcznikiem papierowym (komora wilgotna) lub na ściankach czystej fiolki z pokarmem dla much. Zapewni to odpowiednią wilgotność niezbędną do prawidłowego rozwoju zwierzęcia.

Drosophila – preparaty trwałe

1. Przyklej dolną część poczwarki do szklanej rurki kapilarnej (średnica 800 mikronów) w taki sposób, aby oś przednio-tylna muchy była zorientowana równolegle do rurki.
2. Umoć rurkę kapilarną pionowo na stole obrotowym.
3. Wyreguluj oś nachylenia stołu obrotowego tak, aby oś obrotu była równoległa do kolumn pikseli matrycy CCD kamery.

Wyznaczenie modelu bezpośredniego

1. Utrwal poczwarkę w kapilarze szklanym i zamocuj zgodnie z wcześniejszym opisem
2. Wypełnij kapilarę kwarcową (100 micronów, OD) barwnikiem fluorescencyjnym (Cy5.5)
3. Wprowadź kapilarę do wnętrza poczwarki pod kątem 45 stopni względem osi przednio-tylnej
4. Naświetl poczwarkę wiązką lasera wzbudzającego przy użyciu soczewki o niskiej aperturze numerycznej. Wykonaj obrazy fluorescencyjne w prześwietleniu, obracając poczwarkę o 360 stopni wokół jej osi pionowej.
5. Dopasuj dane eksperymentalne do odpowiedniego modelu wyprzedzającego

Obrazowanie gruczołów ślinowych

1. Zamocuj poczwarkę wykazującą ekspresję GFP w gruczołach ślinowych zgodnie z wcześniejszym opisem
2. Oświetl preparat wiązką wzbudzenia i zarejestruj w transiluminacji sygnał fluorescencji GFP w zakresie 360 stopni, obracając poczwarkę wokół jej osi pionowej.
3. Zrekonstruuj uzyskane dane, wykorzystując model przewodni (forward model)

Obrazowanie poklatkowe

1. Zamocuj białą przedpoczwarkę z ekspresją GFP w tarczach wyobraźnych skrzydeł
2. Utrzymuj wilgotne środowisko obrazowania w temperaturze pokojowej, aby uniknąć odwodnienia poczwarki.
3. Zastosuj migawkę, aby uniknąć ciągłego oświetlania
4. Oświetl próbkę wiązką wzbudzenia i zbierz sygnał fluorescencji GFP w trybie transiluminacji w zakresie 360 stopni, obracając poczwarkę wokół jej osi pionowej.
5. Zrekonstruuj pozyskane dane, wykorzystując model przedni.

Histologia

1. Wypreparować gruczoły ślinowe, OUN/dyski oka w 1x PBS.
2. Utrwalić tkanki w 4% Formaldehydzie, 1x PEM (100mM Pipes, 1mM EGTA, 1mM MgCl₂) przez 20min w temperaturze pokojowej.
3. Usunąć utrwalacz i zamontować w Vectashield z dapi (Vector).
4. Wykonać obrazowanie za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.

Histologia w trybie poklatkowym

1. Zebrać białe prepoczwarki i umieścić je w komorze wilgotnościowej.
2. Zebrać poczwarki na różnych etapach rozwoju.
3. Przed utrwaleniem dwa razy przebić poczwarkę cienką igłą (szpilka entomologiczna 000, FST) (0 h po utworzeniu puparium).
4. Utrwalić poczwarki w 8% formaldehydzie, 1x PEM przez 6-8 h w temperaturze pokojowej przy delikatnym mieszaniu.
5. Po zakończeniu utrwalania i przemyciu 1x PBS, przeciąć utrwaloną poczwarkę ostrym ostrzem na dwie części prostopadle do osi A/P.
6. Zanurzyć oba fragmenty w medium Vectashield z dapi (Vector) i zamontować na szkiełkach podstawowych z przykrywkami (Lab-Tek) do obrazowania.
7. Wykonać zdjęcia za pomocą konfokalnego mikroskopu fluorescencyjnego.

Rycina 1. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję ryciny 1.

Dyskusja

Na Rys. 1(a) przedstawiono rekonstrukcje in-vivo poczwarki oraz wykazujących ekspresję GFP gruczołów ślinowych prepupy D. melanogaster (pasek skali: 500 microns) wraz z odpowiadającą im histologią (kolor niebieski: barwienie dapi; kolor zielony: fluorescencja GFP). Na Rys. 1(b) przedstawiono serię obrazów time-lapse krążków imaginalnych skrzydła D. melanogaster. Obrazy zostały pozyskane z jednego żywego osobnika w czterech różnych punktach czasowych (0, 3.0, 3.5 i 6.5 hours). W pierwszej kolumnie pokaza...