Metoda ELIME (Enzyme Linked Immuno Magnetic Electrochemical) do wykrywania mikotoksyn

Podsumowanie

Przedstawiono protokół wykrywania trichotecenów (mykotoksyn stanowiących zagrożenie dla zdrowia ludzi) z wykorzystaniem nowo opracowanej metody przesiewowej, opartej na konkurencyjnej metodzie immunochemicznej oraz końcowej detekcji elektrochemicznej.

Streszczenie

Testy immunoenzymatyczne stanowią trafną alternatywę dla droższych i bardziej czasochłonnych ilościowych metod HPLC lub GC^{1, 2} w badaniach przesiewowych wykrywających niebezpieczne mikotoksyny w produktach spożywczych. W niniejszym protokole przedstawiamy sposób wykonania i analizy elektrochemicznego konkurencyjnego immunomagnetycznego testu enzymatycznego, opartego na wykorzystaniu kulek magnetycznych jako stałego nośnika dla łańcucha immunochemicznego³ oraz elektrod sitodrukowanych jako platformy sensorycznej.

Nasza metoda ma na celu oznaczenie całkowitej ilości toksyn HT-2 i T-2, które są mikotoksynami z rodziny trichotecenów i stanowią poważne zagrożenie dla zdrowia ludzi⁴. Zastosowanie klonu przeciwciała o 100% reaktywności krzyżowej wobec HT-2 i T-2 umożliwia jednoczesne wykrycie obu toksyn z podobną czułością⁵.

Pierwszym etapem naszego testu jest etap powlekania, podczas którego unieruchamiamy toksynę w postaci koniugatu HT2-KLH na powierzchni kulek magnetycznych. Po etapie blokowania, niezbędnym do uniknięcia nieswoistych absorpcji, dodanie przeciwciała monoklonalnego umożliwia konkurencję między unieruchomionym HT-2 a wolnym HT-2 lub T-2 obecnym w próbce lub rozpuszczonym w roztworze standardowym.

Na zakończenie etapu konkurencji ilość przeciwciała monoklonalnego związanego z unieruchomionym HT-2 będzie odwrotnie proporcjonalna do ilości toksyny w roztworze próbki.

Do wykazania wiązania pomiędzy przeciwciałem specyficznym a unieruchomionym HT-2 wykorzystuje się przeciwciało wtórne znakowane fosfatazą alkaliczną (AP). Końcowy etap pomiaru polega na naniesieniu alikwoty zawiesiny kulek magnetycznych, odpowiadającej konkretnemu roztworowi próbki lub wzorca, na powierzchnię sitodrukowanej elektrody roboczej; kulki magnetyczne są unieruchamiane i zagęszczane za pomocą magnesu umieszczonego precyzyjnie pod elektrodą sitodrukowaną. Po dwuminutowej inkubacji kulek magnetycznych z substratem dla AP, produkt enzymatyczny jest wykrywany metodą woltamperometrii impulsowej różnicowej (DPV) przy użyciu przenośnego urządzenia (PalmSens), które umożliwia również automatyczne zainicjowanie ośmiu pomiarów w odstępach kilku sekund.

Protokół

1) Blokowanie powlekanych kulek magnetycznych:

W celu zablokowania powlekanych kulek magnetycznych należy postąpić w następujący sposób:

1. Przygotować zestaw probówek Eppendorfa o pojemności 2 ml;
2. Zhomogenizować (poprzez wstrząsanie, nie wirowanie w vorteksie) powlekane kulki magnetyczne (przygotowanie powlekanych kulek magnetycznych opisano w aneksie), używając rotacyjnego mieszadła do próbek;
3. Bezpośrednio po homogenizacji odpipetować 10 μl powlekanych kulek magnetycznych do każdej z osobnych probówek Eppendorfa;
4. Do każdej probówki Eppendorfa z zestawu dodać 1 ml roztworu blokującego z odtłuszczonego mleka;
5. Inkubować kulki magnetyczne przez 30 min w temperaturze pokojowej na rotacyjnym mieszadle do próbek;
6. Usunąć roztwór blokujący: w tym celu umieścić probówkę w koncentratorze cząstek magnetycznych z włączonym magnesem na 2 min (kulki magnetyczne powinny przywrzeć do bocznej ścianki probówki); ostrożnie odpipetować nadsącz, nie naruszając kulek;
7. Do każdej probówki dodać 1 ml buforu PBS + NaN₃ + BSA jako roztwór do przechowywania;
8. Przechowywać powlekane i zablokowane kulki magnetyczne w temperaturze 4°C (należy pamiętać, że powlekane kulki magnetyczne są stabilne przez co najmniej 2 miesiące w 4°C);

2) Łańcuch immunologiczny na kulkach magnetycznych do konstrukcji krzywej kalibracyjnej i analizy próbek

Postępuj zgodnie z poniższymi instrukcjami, aby przygotować kuleczki magnetyczne do pomiaru:

1. Pobrać jedną probówkę Eppendorf (2 ml) z roztworem powlekającym i blokującym dla każdego ekstraktu z próbki przeznaczonego do analizy;
2. Pobrać dodatkową probówkę Eppendorf dla każdego roboczego roztworu kalibracyjnego;
3. Przed użyciem homogenizować kuleczki magnetyczne przez 2 min za pomocą rotacyjnego mieszadła do próbek;
4. Usunąć ciecz konserwującą, używając koncentratora cząstek magnetycznych;
5. Przemyć kuleczki magnetyczne trzykrotnie roztworem piorącym PBS/BSA. Usunąć ciecz piorącą;
6. Etap konkurencji: Do każdej probówki zawierającej przemyte kuleczki magnetyczne dodać 200μl przygotowanego ekstraktu z próbki; użyć jednej probówki z kuleczkami magnetycznymi dla każdej próbki. Powtórzyć tę samą procedurę dla każdego roztworu standardu. Do każdej probówki z kuleczkami magnetycznymi dodać 200 μl roztworu przeciwciał monoklonalnych. Inkubować kuleczki magnetyczne przez pół godziny na rotacyjnym mieszadle do próbek w temperaturze pokojowej;
7. Usunąć z probówek Eppendorf roztwór użyty na etapie konkurencji;
8. Etap znakowania: Do każdej probówki Eppendorf z kuleczkami magnetycznymi dodać 400μl znakowanych przeciwciał wtórnych. Inkubować kuleczki magnetyczne przez pół godziny na rotacyjnym mieszadle do próbek w temperaturze pokojowej;
9. Usunąć roztwór znakujący z probówek Eppendorf;
10. Przemyć kuleczki magnetyczne trzykrotnie roztworem piorącym PBS/TWEEN® 20. Usunąć ciecz;
11. Każdą porcję kuleczek magnetycznych resuspendować w 100μl buforu DEA. Kuleczki magnetyczne są teraz gotowe do etapu pomiaru elektrochemicznego;

3) Montaż urządzenia PalmSens z opcjami multipleksora (Mux)

Uwaga: produkt enzymatycznej hydrolizy substratu zanieczyszcza powierzchnię elektrody; z tego powodu do każdego pomiaru niezbędna jest nowa elektroda.

1. Podłącz laptop z komputerem PC do urządzenia PalmSens za pomocą kabla szeregowego;
2. Podłącz wtyczkę 9-DIN multipleksera CH8 do urządzenia PalmSens.
3. Podłącz kabel szeregowy styku elektrycznego ośkanałowego multipleksera do multipleksera CH8;
4. Umieść pasek z elektrodami na bloku ośmiu magnesów. Należy zadbać o to, aby każdy magnes znajdował się pod każdą z elektrod roboczych (należy pamiętać, że zastosowanie pojedynczego magnesu dla każdej elektrody jest niezbędne, w przeciwnym razie cząsteczki magnetyczne nie zostaną skoncentrowane w obszarze elektrody roboczej);
5. Wepnij pasek z elektrodami do styku elektrycznego ośkanałowego multipleksera;

Do pomiaru DPV należy wprowadzić następujące parametry w odpowiednie pola:
E begin: 0 (V); E end: 0,6 (V); E step: 0,016 (V); E pulse: 0,0339 (V); E conditioning: 0 (V); E deposition: 0 (V); Szybkość skanowania: 0,1 (V/s); T pulse: 0,06 (s); T conditioning: 0 (s); T deposition: 0 (s); T equilibration: 8 (s).

4) Reakcja enzymatyczna i pomiar elektrochemiczny

1. Zhomogenizuj każdą probówkę Eppendorf zawierającą kuleczki magnetyczne przygotowane do etapu pomiaru elektrochemicznego, delikatnie nimi potrząsając, aby uzyskać dobrze zdyspergowaną zawiesinę kuleczek magnetycznych;
2. Bezpośrednio po homogenizacji pipetuj z każdej probówki Eppendorf alikwot 20 μl dyspersji kuleczek magnetycznych na powierzchnię odpowiadającej im elektrody roboczej. Dla każdej elektrody jednego paska należy użyć 20 μl kuleczek magnetycznych pobranych z różnych probówek Eppendorf (np. dla ośmiu elektrod użyj ośmiu różnych probówek Eppendorf);
3. Dodaj 80 μl roztworu substratu enzymatycznego na pierwszą elektrodę. Uruchom odliczanie 2 min. Po 14 s dodaj 80 μl roztworu substratu enzymatycznego na drugą elektrodę. Po kolejnych 14 s dodaj 80 μl roztworu substratu enzymatycznego na trzecią elektrodę. Postępuj w tych samych odstępach czasu (14 sekund) aż do ostatniej elektrody (oznacza to: nakładaj każdy alikwot substratu w odstępach 14 s). Odstęp czasu 14 s jest obliczony jako czas potrzebny potencjostatowi na wykonanie pomiaru; należy zauważyć, że roztwór 80 μl na każdym sensorze powinien pokrywać elektrodę roboczą, odniesienia i przeciwelektrodę. Co więcej, roztwory dla każdego sensora nie powinny stykać się z roztworami sąsiednich elektrod.
4. Po upływie 2 min od pierwszej aplikacji roztworu substratu enzymatycznego rozpoczęcie pomiaru elektrochemicznego;
5. Użyj oprogramowania PalmSens Lite, aby uzyskać wartości pików prądu (μA) dla każdego roztworu.

5) Obliczenia

Utwórz krzywą kalibracyjną przy użyciu równania logistycznego czterech parametrów i oblicz stężenie całkowitej ilości toksyny HT-2/T-2 w nanogramach na mililitr dla każdej probówki Eppendorf zawierającej nieznaną próbkę.

Dane eksperymentalne, przedstawiające wysokość piku (μA) w funkcji stężenia kalibratorów (ng/ml), muszą zostać dopasowane przy użyciu nieliniowego równania logistycznego czterech parametrów (4-PL) zgodnie z wykresem (1) (przy użyciu programu Sigma Plot 8.0 lub Kaleidagraph). Nieliniowy model 4-PL jest zazwyczaj stosowany do opisu testów wiązania ligandów (LBA) ⁶.

(1)
a, b, x0, y0 to parametry logistyczne wyznaczone przez program dopasowania krzywych Sigma Plot.
Należy użyć rozwiniętego wzoru, aby obliczyć całkowitą zawartość toksyny HT-2/T-2 w rozcieńczonym roztworze ekstraktu z próbki
(2)
x to stężenie masowe całkowitej ilości toksyn HT-2/T-2 w rozcieńczonym roztworze ekstraktu, obliczone z czteroparametrowego równania logistycznego w nanogramach na mililitr (ng/ml)
y to wartość prądu w μA uzyskana dla nieznanej próbki

Dodatek

6) Powlekane kulki magnetyczne

W celu przygotowania powlekanych kulek magnetycznych należy postępować zgodnie z poniższymi instrukcjami:

Procedura płukania

1. Ujednolicić zawiesinę aktywowanych tosylanem kulek Dynabeads® M-280 (roztwór stokowy 2 x 109 beads/ml) poprzez wstrząsanie i mieszanie w wortexie (maksymalna prędkość) przez 1 min (unikając pienienia) (należy pamiętać, że stężenie kulek magnetycznych musi być zawsze takie samo, aby zapewnić powtarzalność pomiaru);
2. Niezwłocznie przenieść pipetą 1 ml powyższych ujednoliconych kulek do probówki Eppendorfa o pojemności 2 ml;
3. Umieścić probówkę w koncentratorze cząstek magnetycznych z włączonym magnesem na 2 min (do momentu, aż kulki magnetyczne przykleją się do bocznej ścianki probówki);
4. Ostrożnie odpipetować nadsącz, nie naruszając osadu kulek;
5. Wyjąć probówkę Eppendorfa z koncentratora cząstek magnetycznych i resuspender kulki w 1 ml 0.1 M buforu boranowego pH 9.5. Mieszać delikatnie przez 2 min w rotacyjnym mieszalniku do próbek;
6. Odpipetować nadsącz;
7. Przenieść pipetą 1 ml roztworu buforu boranowego do probówki Eppendorfa. Kulki magnetyczne są teraz gotowe do etapu powlekania;

Procedura powlekania

8. Do 1 ml kuleczek magnetycznych dodać 600 ml roztworu zapasowego HT-2 sprzężonego z KLH (hemocyjaniną z małża Keyhole Limpet) (końcowe stężenie HT-2-KLH wynoszące 375 mg/ml); inkubować kuleczki magnetyczne i roztwór HT-2-KLH przez 20h w 37°C* przy powolnym obrocie kątowym na mieszalniku rotacyjnym;
9. Po inkubacji umieścić probówkę w koncentratorze cząstek magnetycznych i odpipetować nadsącz;
   Przemyć powlekane kuleczki dwukrotnie 1 ml roztworu buforowego PBS/BSA. Po każdym przemyciu usunąć roztwór PBS/BSA. Wszystkie etapy przemywania przeprowadzano, umieszczając kuleczki magnetyczne i PBS/BSA na mieszalniku rotacyjnym przez 5 min;
10. Przemyć kuleczki magnetyczne raz, używając 1 ml roztworu buforowego TRIS/BSA. Usunąć roztwór TRIS/BSA. Ten etap przeprowadzać, umieszczając kuleczki magnetyczne i bufor TRIS/BSA na mieszalniku rotacyjnym przez 4 h w 37°C*;
11. Przemyć kuleczki magnetyczne raz, używając 1ml świeżego (przechowywanego w lodówce w 4°C) roztworu buforowego PBS/BSA. Usunąć roztwór PBS/BSA. Ten etap przeprowadzać, umieszczając kuleczki magnetyczne i bufor PBS/BSA na mieszalniku rotacyjnym przez 5min w temperaturze pokojowej;
12. Po etapie przemywania usunąć cały płyn do przemywania i dodać 1 ml buforu PBS + NaN₃ + BSA jako płyn do przechowywania;
13. Przechowywać powlekane kuleczki magnetyczne w 4°C (należy pamiętać, że powlekane kuleczki magnetyczne są stabilne przez co najmniej 2 miesiące w 4°C);

*W tym celu mieszadło umieszcza się w inkubatorze wyposażonym w otwór umożliwiający wprowadzenie kabla zasilającego. Alternatywnie mieszadło można umieścić w pomieszczeniu z termostatem w temperaturze 37°C.

7) Przygotowanie i ekstrakcja próbek

25 g drobno zmielonej próbki (jedzenia dla niemowląt lub płatków śniadaniowych) odważone są do kielicha blendera i ekstrahowane 100 ml roztworu acetonitrylu/wody (86/14) przez 3 min w blenderze wysokoobrotowym. Po wirowaniu przy 4000 rpm (3000 g) przez 5 min pobrano 8 ml supernatantu i oczyszczono go za pomocą kolumny Mycosep, a następnie 4 ml oczyszczonego ekstraktu wysuszono w strumieniu azotu. Wysuszone próbki można przechowywać w temperaturze -30 °C do kilku miesięcy.

8) Rekonstytucja próbki

Płatki śniadaniowe

Zrekonstytuuj wysuszony ekstrakt z płatków śniadaniowych (produktu zbożowego przeznaczonego do spożycia przez dorosłych), dodając 40 ml PBS pH 7.4. W ten sposób próbka o stężeniu toksyny równym domniemanemu limitowi prawnemu (200 ng/g) wygeneruje w etapie pomiaru sygnał mieszczący się w środku zakresu roboczego.

Jedzenie dla niemowląt

Zrekonstytuuj wysuszony ekstrakt z jedzenia dla niemowląt (produkt zbożowy przeznaczony do spożycia przez niemowlęta), dodając 4 ml PBS. W ten sposób próbka o stężeniu toksyn równym przypuszczalnemu limitowi prawnemu (20-25 ng/g) wygeneruje w kroku pomiarowym sygnał wypadający w środku zakresu roboczego.

Dyskusja

Wykorzystanie przeciwciał jako biomolekularnych sond rozpoznających znalazło szerokie zastosowanie w technologiach sensorycznych; immunochemiczne metodologie detekcji, takie jak ELISAs i MEIAs, są obecnie jednymi z najczęściej używanych i stosowanych platform w wielu laboratoriach⁷.

Choć podejścia te charakteryzują się wyjątkową czułością i swoistością, głównym celem wielu grup badawczych w ostatnich latach była poprawa i optymalizacja ich wydajności.

W...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Chlorek potasu	Sigma-Aldrich	P9333
Wodorofosforan potasu	Sigma-Aldrich	P9791
Wodorofosforan sodu dwuwodny	Sigma-Aldrich	S3264
Chlorek sodu	Sigma-Aldrich	S3014
MgCl₂2 bezwodny	Sigma-Aldrich	M8266
DEA (99,5%)	Sigma-Aldrich	31589
HCl 37%	Sigma-Aldrich	320331
H3BO3	Sigma-Aldrich	B6768
Tris[hydroksymetylo]-aminometan	Sigma-Aldrich	252859
BSA (albumina surowicy wołowej)	Sigma-Aldrich	A4503
NaOH	Sigma-Aldrich	S5881
TWEEN 20	Sigma-Aldrich	P9416
NaN3	Aldrich	71290
Sól disodowa 1-naftylofosforanu	Fluka	N7255
Roztwór blokujący z mleka odtłuszczonego – odtłuszczone mleko w proszku	Bio-Rad	170-6404
HT-2 sprzężony z KLH (hemocyjaniną z małża Keyhole Limpet), roztwór macierzysty (1 mg/ml w PBS):	Biopure	004050	Koniugat HT-2-KLH otrzymano metodą CDI, w której wolne grupy OH w pozycjach 3 i 4 toksyny HT-2 zostały aktywowane za pomocą N,N'-karbonyldiimidazol (CDI), a aktywowaną toksynę HT-2 pozostawiono do reakcji z grupami aminowymi białka (KLH) w celu wytworzenia stabilnego wiązania karbaminianowego.
Przeciwciało wtórne znakowane: przeciwciało przeciwko mysiej IgG (H+L) pochodzące z konia, koniugowane z fosfatazą alkaliczną, stężenie 1 mg/ml.	Vector Laboratories	AP-2000
Toksyna HT-2	Biopure
Kuleczki magnetyczne: Dynabeads®	Invitrogen	M-280 aktywowane tosylanem	Stężenie 2 x 109 kulek/ml.
Bufor fosforanowy w soli fizjologicznej (PBS), pH 7,4			Rozpuścić 0,20 g chlorku potasu, 0,20 g wodoru fosforanu potasu, 1,16 g wodoru fosforanu sodu oraz 8,00 g chlorku sodu w 900 ml wody
Bufor dietanoloaminowy, DEA, 0,97 M + 1 mM MgCl22 + 0,15 M KCl, pH 9,8			Rozpuścić 0,0476 g MgCl22 bezwodny oraz 7,359 g KCl w ok. 300 ml wody. Po rozpuszczeniu dodać 51 ml DEA (99,5%). Dostosować pH do wartości 9,8 za pomocą HCl (6 M). Dopełnić wodą do objętości 500 ml.
Bufor boratowy, 0,1 M, pH 9,5			Rozpuścić 3,09 g H3BO3 w ok. 300 ml wody destylowanej; dostosować pH do 9,5 za pomocą NaOH i/lub HCl (6 M lub niższych stężeń). Dopełnić do 500 ml wodą destylowaną.
bufor TRIS, 0,2 M, pH 8,5			Rozpuścić 3,85 g Tris[hydroksymetylo]-aminometanu w 100 ml wody. Dostosować pH do wartości 8,5 za pomocą NaOH i/lub HCl (6 M lub stężeń niższych). Dopełnić wodą do objętości 200 ml.
bufor TRIS + roztwór BSA (0,1%), pH 8,4			Rozpuścić 0,050 g BSA w 50 ml buforu TRIS o pH 8,4. Roztwór ten należy przygotować na świeżo w dniu użycia.
bufor PBS + TWEEN® 0.05%			Rozpuścić 0,250 g TWEEN 20 w 500 ml wcześniej przygotowanego buforu PBS o pH 7,4
bufor PBS + roztwór BSA 0,1%			Rozpuścić 0,050 g BSA w 50 ml buforu PBS o pH 7,3. Roztwór ten należy przygotować bezpośrednio przed użyciem w dniu badania.
bufor PBS + BSA 0,1% + NaN33 0.02%			Rozpuścić 0,050 g BSA oraz 0,010 g NaN₃3 w 50 ml buforu PBS, pH 7,3. Roztwór do przechowywania
Substrat enzymatyczny			Rozpuścić 0,010 g soli sodowej 1-naftylofosforanu w 100 ml buforu DEA o pH 9,8. Kolbę należy szczelnie owinąć folią aluminiową. Roztwór ten musi zostać przygotowany na świeżo w dniu użycia.
Roztwór blokujący z odtłuszczonego mleka			Do 200 ml buforu PBS o pH 7,3 dodać 0,20 g odtłuszczonego mleka w proszku do blokowania (Blotting Grade Blocker Non-Fat Dry Milk; Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Roztwór ten należy przygotować na świeżo w dniu użycia.
Roztwór zapasowy HT-2			Rozpuścić 10 mg toksyny trichotecenowej HT-2 z fiolki w 10 ml acetonitrylu, aby otrzymać roztwór o stężeniu 1 mg/ml. Podzielić ten roztwór na jednorazowe alikwoty po 30 µl i przechowywać je w temperaturze poniżej -30°C. °C.
Roboczy roztwór wzorcowy HT-2			Odpipetować 20 μl roztworu stokowego toksyny HT-2 do kalibrowanej kolby miarowej o pojemności 2 ml i rozcieńczyć acetonitrylem, aby otrzymać roztwór roboczy HT-2 o stężeniu 10 μg/ml toksyny trichotecenowej. Roztwór ten należy przygotować świeżo w dniu użycia.
Robocze roztwory kalibracyjne HT-2			Rozcieńczyć roboczy roztwór wzorca HT-2 (10 μ(g/ml) w celu przygotowania roboczego roztworu kalibracyjnego o stężeniu 100 ng/ml. Rozcieńczyć roboczy roztwór kalibracyjny HT-2 (100 ng/ml), aby przygotować robocze roztwory kalibracyjne o następujących stężeniach: 0 (próba ślepa), 0,5, 1, 2, 4, 10 ng/ml. Roztwory te należy przygotować na świeżo w dniu użycia.
HT-2 sprzężony z KLH			Podziel roztwór gęsty HT-2 sprzężonego z KLH (hemocyjaniną z małża Keyhole Limpet) (1 mg/ml w PBS) na jednorazowe alikwoty po 350 $\mu$l μ1. Przechowywać alikwoty w temperaturze -30°C °C.
Specyficzne przeciwciało monoklonalne			Rozcieńczyć roztwór treściwy przeciwciała monoklonalnego (stężenie 1,383 mg/ml) w buforze PBS w stosunku 1:350 (v:v) do wykorzystania w etapie konkurencji. Roztwór ten należy przygotować bezpośrednio przed użyciem. 10 μl roztworu treściwego przeciwciał w PBS, co daje objętość końcową 3,5 ml, jest wystarczające do analizy 17 standardów i/lub próbek.
Wtórne przeciwciało znakowane			Przeciwciało przeciwko mysim IgG (H+L) sprzężone z fosfatazą alkaliczną rozcieńcza się 1:100 (v:v) w PBS do wykorzystania w etapie konkurencji. 100 μroztwór zapasowy przeciwciał w PBS do uzyskania końcowej objętości 10 ml jest wystarczający do analizy 25 wzorców i/lub próbek. Roztwór ten musi być przygotowany bezpośrednio przed użyciem.
Koncentrator cząstek magnetycznych: MPC®-S	Invitrogen
urządzenie PalmSens	PalmSens		Dostarczone wraz z urządzeniem PalmSens Lite, kabel szeregowy łączący laptop z komputerem osobistym oraz oprogramowanie z opcjami Mux
Multiplexer PalmSens CH8	PalmSens
Ośmiokanałowy styk elektryczny multipleksera (Mux)			wykonany ręcznie
Pasek z ośmioma elektrodami sitodrukowanymi (SPE)			wykonany ręcznie
Specjalnie zaprojektowany uchwyt do pasków z elektrodami			wykonane ręcznie. Zawiera 8 magnesów neodymowych, z których każdy jest umieszczony pod powierzchnią każdej elektrody roboczej SPE
Kalisrowane pipety mikrolitrowe	Gilson, Inc.
Mieszadło magnetyczne i mieszadełka magnetyczne.
Zlewki szklane (100, 50, 20 ml).
Kolby miarowe (2 ml).
probówki Eppendorf o pojemności 0,2 i 2 ml.	Eppendorf
Probówki Falcon o pojemności 5 ml i 15 ml.	Falcon BD
Mieszadło wierzchołkowe (vortex)			Nie należy używać mieszadła wibracyjnego (vortexa) do resuspensji kulek magnetycznych powlekanych HT2-KLH lub połączonych z łańcuchem immunologicznym, aby uniknąć denaturacji części białkowych.
Piec laboratoryjny lub pomieszczenie termostatowane			Wybierz inkubator umożliwiający utrzymanie temperatury 37°C±3 °C.