Wykorzystanie systemu elektroporacji Gene Pulser MXcell do wysokowydajnej transfekcji komórek pierwotnych

Podsumowanie

Niniejsza procedura przedstawia sposób wykorzystania systemu do elektroporacji Gene Pulser MXcell w celu szybkiego i łatwego zidentyfikowania optymalnych warunków elektroporacji dla embrionalnych fibroblastów mysich (MEFs) lub innych komórek pierwotnych. W towarzyszącym filmie omówiono również kwestie związane z rozwiązywaniem problemów.

Streszczenie

Coraz bardziej oczywistym staje się fakt, że elektroporacja jest najskuteczniejszą metodą wprowadzania plazmidowego DNA lub siRNA do komórek pierwotnych. System elektroporacji Gene Pulser MXcell oraz bufor do elektroporacji Gene Pulser (Bio-Rad) zostały opracowane specjalnie w celu łatwej transfekcji kwasów nukleinowych do komórek ssaków oraz komórek trudnych do transfekcji, takich jak komórki pierwotne i macierzyste. Zaprezentujemy sposób przeprowadzenia prostego eksperymentu w celu szybkiego zidentyfikowania optymalnych warunków elektroporacji. Pokażemy, jak poddać kilka próbek różnym parametrom elektroporacji, tak aby eksperyment mógł być realizowany równocześnie z optymalizacją. Przedstawimy również, w jaki sposób optymalne warunki określone przy użyciu 96-dołkowych płytek do elektroporacji można zastosować w standardowych kuwetach do elektroporacji, co ułatwia przejście z płytek na kuwety przy zachowaniu tej samej wydajności elektroporacji. W filmie omówimy również kluczowe czynniki, które mogą wpłynąć na sukces lub niepowodzenie eksperymentów z elektroporacją.

Protokół

1) Przygotowanie komórek

1. W przypadku użycia komórek adherentnych konieczne jest poddanie ich trypsynizacji i zebranie przed elektroporacją.
2. Aby porównać efektywność transfekcji w czterech kulturach embrionalnych fibroblastów mysich (MEF), reprezentujących trzy różne numery pasażu, wykonaj następujące czynności dla każdej kolby.
3. Odsuń za pomocą aspiratora pożywkę hodowlaną.
4. Dodaj PBS w celu przemycia komórek.
5. Usuń PBS; dodaj odpowiednią ilość trypsyny, aby pokryć komórki, i odczekaj kilka minut, aby trypsyna oddzieliła komórki od podłoża.
6. Sprawdź kolby pod mikroskopem, aby zweryfikować stan komórek, uderz w kolbę, aby oddzielić komórki, a następnie sprawdź ponownie kolbę, aby upewnić się, że wszystkie komórki zostały oddzielone.
7. Odczekaj dodatkowy czas i powtórz czynność, jeśli jest to konieczne.
8. Po oddzieleniu wszystkich komórek dodaj pożywkę zawierającą surowicę, aby zneutralizować trypsynę.
9. Przenieś komórki do probówki do wirowania i wytrącaj je w osad przez wirowanie (rcf = 300 x g).
10. Usuń supernatant i resuspenduj komórki w znanej objętości PBS.
11. Policz komórki.
12. Przenieś do nowej probówki odpowiednią objętość zawiesiny komórkowej, aby uzyskać wymaganą liczbę komórek do doświadczeń (potrzebne będzie 150 μL komórek na studzienkę przy gęstości 1 x 10⁶ komórek/mL).
13. Odwiruj komórki.
14. Usuń supernatant i resuspenduj komórki w odpowiedniej objętości buforu do elektroporacji Gene Pulser, aby osiągnąć gęstość komórkową 1 x 10⁶ komórek/mL.
15. Dodaj 20 μg plazmidu na mL zawiesiny komórkowej i delikatnie wymieszaj.

2) Przygotowanie naczynia do elektroporacji i elektroporacja

Przygotowanie płytki i elektroporacja

1. Włóż komorę na płytkę do modułu zasilającego systemu do elektroporacji Gene Pulser MXcell.
2. Pipetuj 150 μL mieszaniny komórek lub buforu do dołków płytki do elektroporacji z 96 dołkami.
3. Umieść płytkę w komorze i przeprowadź impulsowanie.
4. Wyjmij płytkę z komory.
5. Dokładnie wymieszaj zawartość dołków, pipetując ciecz w górę i w dół w każdym z nich.
6. Przenieś komórki z każdego dołka do uprzednio podgrzanego buforu w płytkach 12-dołkowych.
7. Opukaj płytkę, aby rozłożyć komórki, i umieść ją w inkubatorze.
8. Pozostaw komórki do regeneracji na 24 godziny.

Przygotowanie kuwety i elektroporacja

9. Odłącz komorę do płytek z modułu zasilania systemu do elektroporacji Gene Pulser MXcell i podłącz komorę do kuwet ShockPod™.
10. Pipetuj 600 μL zawiesiny komórkowej do kuwety do elektroporacji z przerwą 0,4 cm.
11. Umieść kuwetę w komorze ShockPod i podaj impuls elektryczny.
12. Wyjmij kuwetę z komory.
13. Wymieszaj zawartość kuwety, pipetując w górę i w dół.
14. Przenieś komórki z każdej studni do uprzednio ogrzanego buforu w płytkach 12-dołkowych.
15. Opukaj płytkę, aby rozprzestrzenić komórki, i umieść ją w inkubatorze.
16. Pozostaw komórki do regeneracji na 24 godziny.

3) Reprezentatywne wyniki

Po transfekcji komórek i umożliwieniu im regeneracji, przeanalizuj wydajność transfekcji jakościowo, wykorzystując mikroskopię epifluorescencyjną, oraz ilościowo, przy użyciu cytometrii przepłyewowej.

Rycina 1. Komórki, które zostały pomyślnie poddane elektroporacji i obecnie wykazują ekspresję genu GFP, widoczne w mikroskopii epifluorescencyjnej.

Rysunek 2. Obserwacja komórek w kontraście fazowym pozwala na wizualizację zarówno komórek transfektowanych, jak i nietransfektowanych. Są to komórki poddane elektroporacji z impulsem o najniższym napięciu 200V. Komórki są w dużej mierze konfluencyjne ze względu na wysoką gęstość komórkową.

Rysunek 3. Ten sam obszar widzenia w epifluorescencji pokazuje, że liczba komórek wykazuje ekspresję markera GFP, jednak stanowią one jedynie niewielki procent komórek widocznych na poprzednim obrazie.

Rycina 4. Przy 250V całkowita liczba żywych komórek widocznych w kontraście fazowym nieznacznie spada.

Rysunek 5. W świetle epifluorescencyjnym widać, że liczba komórek wykazujących ekspresję GFP wzrosła.

Rysunek 6. Przy najwyższym przyłożonym napięciu 375V widoczna jest mniejsza liczba żywych komórek.

Rysunek 7. Jednakże duży odsetek pozostałych komórek wykazuje ekspresję GFP. Wybór optymalnego warunku zależy od projektu doświadczenia. W niektórych eksperymentach optymalna może być największa liczba komórek transfekowanych, w innych natomiast najwyższy procent transfekcji.

Interesuje nas procent komórek wykazujących pozytywny wynik dla GFP w każdym z warunków oraz to, jak wartości te zmieniają się wraz z wiekiem komórek. Cytometria przepływowa może dostarczyć ilościowych informacji na temat wyników transfekcji w każdym z różnych warunków elektroporacji.

Rycina 8. Przedstawiono tutaj procent komórek wykazujących pozytywny sygnał GFP w komórkach z 5. pasażu dla każdego z 12 warunków elektroporacji. Maksymalny odsetek transfekcji wyniósł około 80% przy najwyższym napięciu impulsu o wykładniczym spadku (warunek 6) oraz 70% przy najsilniejszym przetestowanym impulsie prostokątnym (warunek 12).

Rycina 9. W przypadku komórek pasażowanych 9 razy przed elektroporacją ogólny wzorzec procentu transfekcji jest niemal identyczny, jednak z bardzo niewielkim spadkiem wartości procentowych transfekcji.

Rysunek 10. Przedstawiono tutaj procentowe udziały komórek GFP w komórkach z 13. pasażu, które wykazują znaczny spadek procentu transfekcji w porównaniu z młodszymi komórkami. Najwyższe wartości procentowe transfekcji stanowiły około połowy wyników osiągniętych w przypadku młodszych komórek, co dowodzi znaczenia wykorzystania zdrowych komórek tak szybko, jak to możliwe po ich izolacji.

Elektroporacja Warunki stosowane do transfekcji komórek MEF przy użyciu urządzenia Gene Pulser MXcell
Warunki (1-6) wykładniczy zanik impulsów, wszystkie z 350 μF, 1000 Ω	Napięcie (V)
1	200
2	250
3	300
4	326
5	350
6	376
Warunek (7-12) impulses prostokątne, wszystkie z 2000 µF, 1000 Ω i 1 impulsem	Napięcie (V)	Czas trwania impulsu (ms)
7	200	10
8	250	10
9	300	10
10	200	20
11	250	20
12	300	20

Dyskusja

Niniejszy artykuł wideo demonstruje, jak wykorzystać system elektroporacji MXcell do łatwego wyznaczenia optymalnych warunków elektroporacji dla MEF lub innych pierwotnych linii komórkowych. Format płytki 96-dołkowej pozwala na jednoczesne przeprowadzenie wielu powtórzeń warunków eksperymentalnych lub optymalizacyjnych, co może wyeliminować konieczność wykonywania wielu oddzielnych doświadczeń. Podczas przeprowadzania tej procedury należy pamiętać o tym, aby używać zdrowych komórek jak najkrócej po ich izolacji oraz stosować warunki elektroporacji dopasowane do użytego buforu do elektroporacji.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Bufor do elektroporacji Gene Pulser®	Bio-Rad	165-2676
System do elektroporacji Gene Pulser MXcell™	Bio-Rad	165-2670
Komora na kuwety Gene Pulser MXcell™ ShockPod™	Bio-Rad	165-2673
System do elektroporacji Gene Pulser MXcell™ z komorą na kuwety ShockPod™	Bio-Rad	165-2674