Wykorzystanie systemu elektroporacji Gene Pulser MXcell do wysokowydajnej transfekcji komórek pierwotnych

Podsumowanie

Niniejsza procedura przedstawia sposób wykorzystania systemu do elektroporacji Gene Pulser MXcell w celu szybkiego i łatwego zidentyfikowania optymalnych warunków elektroporacji dla embrionalnych fibroblastów mysich (MEFs) lub innych komórek pierwotnych. W towarzyszącym filmie omówiono również kwestie związane z rozwiązywaniem problemów.

Streszczenie

Coraz bardziej oczywistym staje się fakt, że elektroporacja jest najskuteczniejszą metodą wprowadzania plazmidowego DNA lub siRNA do komórek pierwotnych. System elektroporacji Gene Pulser MXcell oraz bufor do elektroporacji Gene Pulser (Bio-Rad) zostały opracowane specjalnie w celu łatwej transfekcji kwasów nukleinowych do komórek ssaków oraz komórek trudnych do transfekcji, takich jak komórki pierwotne i macierzyste. Zaprezentujemy sposób przeprowadzenia prostego eksperymentu w celu szybkiego zidentyfikowania optymalnych warunków elektroporacji. Pokażemy, jak poddać kilka próbek różnym parametrom elektroporacji, tak aby eksperyment mógł być realizowany równocześnie z optymalizacją. Przedstawimy również, w jaki sposób optymalne warunki określone przy użyciu 96-dołkowych płytek do elektroporacji można zastosować w standardowych kuwetach do elektroporacji, co ułatwia przejście z płytek na kuwety przy zachowaniu tej samej wydajności elektroporacji. W filmie omówimy również kluczowe czynniki, które mogą wpłynąć na sukces lub niepowodzenie eksperymentów z elektroporacją.

Protokół

1) Przygotowanie komórek

1. W przypadku użycia komórek adherentnych konieczne jest potraktowanie ich trypsyną i zebranie przed elektroporacją.
2. Aby porównać wydajność transfekcji w czterech kulturach zarodkowych fibroblastów mysich (MEF), reprezentujących trzy różne numery pasażu, wykonaj następujące czynności w każdej kolbie.
3. Odsaj cały pożywkę hodowlana.
4. Dodaj PBS w celu przemycia komórek.
5. Usuń PBS; dodaj odpowiednią ilość trypsyny, aby pokryć komórki, i odczekaj kilka minut, aby trypsyna mogła oddzielić komórki od podłoża.
6. Sprawdź kolby pod mikroskopem, aby zweryfikować stan komórek, delikatnie uderz w kolbę, aby oddzielić komórki, a następnie ponownie sprawdź kolbę, aby upewnić się, że wszystkie komórki zostały oddzielone.
7. Odczekaj dodatkowy czas i powtórz czynność, jeśli to konieczne.
8. Gdy wszystkie komórki zostaną oddzielone, dodaj pożywkę zawierającą serum, aby zneutralizować trypsynę.
9. Przenieś komórki do probówki wirówkowej i odwirowaj je (rcf = 30 x g).
10. Usuń supernatant i resuspenderuj komórki w znanej objętości PBS.
11. Policz komórki.
12. Przenieś do nowej probówki odpowiednią objętość zawiesiny komórkowej, aby uzyskać wymaganą liczbę komórek do eksperymentów (wymagane będzie 150 μL komórek na studzienkę przy gęstości 1 x 10⁶ komórek/mL).
13. Odwiruj komórki.
14. Usuń supernatant i resuspenderuj komórki w odpowiedniej objętości buforu do elektroporacji Gene Pulser, aby uzyskać gęstość komórek 1 x 10⁶ komórek/mL.
15. Dodaj 20 μg plazmidu na 1 mL zawiesiny komórkowej i delikatnie wymieszaj.

2) Przygotowanie naczynia do elektroporacji i przeprowadzanie elektroporacji

Przygotowanie płytki i elektroporacja

1. Podłącz komorę na płytki do modułu zasilania systemu do elektroporacji Gene Pulser MXcell.
2. Pipetuj 150 μL mieszaniny komórek lub buforu do studni 96-dołkowej płytki do elektroporacji.
3. Włóż płytkę do komory i przeprowadź impulsy elektryczne.
4. Wyjmij płytkę z komory.
5. Dokładnie wymieszaj zawartość studni, pipetując ciecz w górę i w dół w każdej z nich.
6. Przenieś komórki z każdej studni do uprzednio ogrzanego buforu w płytkach 12-dołkowych.
7. Wystukaj płytkę, aby równomiernie rozdzielić komórki, a następnie umieść ją w inkubatorze.
8. Pozostaw komórki do regeneracji na 24 godziny.

Przygotowanie kuwety i elektroporacja

9. Odłącz komorę do płytek z modułu zasilania systemu elektroporacji Gene Pulser MXcell i podłącz komorę do kuwet ShockPod™.
10. Pipetuj 60 μL zawiesiny komórkowej do kuwety do elektroporacji z przerwą 0,4 cm.
11. Umieść kuwetę w komorze ShockPod i podaj impuls elektryczny.
12. Wyjmij kuwetę z komory.
13. Wymieszaj zawartość kuwety, pipetując ciecz w górę i w dół.
14. Przenieś komórki z każdej studzienki do uprzednio ogrzanego buforu w płytkach 12-dołkowych.
15. Opukaj płytkę, aby rozmieścić komórki, i umieść ją w inkubatorze.
16. Pozostaw komórki do regeneracji na 24 godziny.

3) Reprezentatywne wyniki

Po transfekcji komórek i ich regeneracji, przeanalizuj wydajność transfekcji jakościowo, wykorzystując mikroskopię epifluorescencyjną, oraz ilościowo, za pomocą cytometrii przepływowej.

Rycina 1. Komórki, które zostały pomyślnie poddane elektroporacji i wykazują obecnie ekspresję genu GFP, są widoczne w mikroskopii epifluorescencyjnej.

Rysunek 2. Obserwacja komórek w kontraście fazowym pozwala na wizualizację zarówno komórek transfekowanych, jak i nietransfekowanych. Są to komórki poddane elektroporacji z najniższym napięciem impulsu wynoszącym 20 V. Komórki są w dużej mierze konfluencyjne ze względu na wysoką gęstość komórkową.

Rysunek 3. Ten sam obszar widzenia w epifluorescencji pokazuje, że część komórek wykazuje ekspresję markera GFP, stanowią one jednak jedynie niewielki odsetek komórek widocznych na poprzednim obrazie.

Rysunek 4. Przy 250 V całkowita liczba żywych komórek widocznych w kontraście fazowym nieznacznie spada.

Rycina 5. W świetle epifluorescencyjnym można zauważyć, że liczba komórek wykazujących ekspresję GFP wzrosła.

Rycina 6. Przy najwyższym przyłożonym napięciu, wynoszącym 375 V, widocznych jest mniej żywych komórek.

Rycina 7. Jednak duży odsetek pozostałych komórek wykazuje ekspresję GFP. To, który warunek jest optymalny, zależy od projektu eksperymentalnego. W niektórych doświadczeniach optymalna może być największa liczba komórek transfekowanych, w innych zaś najwyższy procent transfekcji.

Interesuje nas odsetek komórek GFP-dodatnich w każdym z warunków oraz sposób, w jaki wartości te zmieniają się wraz z wiekiem komórek. Cytometria przepływowa pozwala na uzyskanie ilościowych informacji na temat wyników transfekcji dla każdego z różnych warunków elektroporacji.

Rysunek 8. Poniżej przedstawiono odsetek komórek wykazujących ekspresję GFP w komórkach z pasażu 5 dla każdego z 12 warunków elektroporacji. Maksymalny odsetek transfekcji wyniósł około 80% przy zastosowaniu impulsu o najwyższym napięciu z wykładniczym spadkiem (warunek 6) oraz 70% przy najsilniejszym z przetestowanych impulsów prostokątnych (warunek 12).

Rysunek 9. W przypadku komórek poddanych 9 pasażom przed elektroporacją ogólny wzorzec procentowej wydajności transfekcji jest niemal identyczny, jednak z bardzo niewielkim spadkiem wartości tych procentów.

Rysunek 10. Przedstawiono tutaj procentową zawartość komórek GFP w komórkach z pasażu 13, w których widoczny jest znaczny spadek procentu transfekcji w porównaniu z młodszymi komórkami. Najwyższe wartości procentowe transfekcji stanowiły około połowy wyników osiągniętych w przypadku młodszych komórek, co wykazuje znaczenie wykorzystania zdrowych komórek tak szybko, jak to możliwe po ich izolacji.

Warunki elektroporacji stosowane do transfekcji komórek MEF przy użyciu Gene Pulser MXcell
Warunek (1-6) impulsy o wykładniczym spadku, wszystkie z 350 uF, 10ohm	Napięcie (V)
1	20
2	250
3	300
4	326
5	350
6	376
Warunek (7-12) impulsy prostokątne, wszystkie z 20 uF, 10 ohm i 1 impulsem	Napięcie (V)	Czas trwania impulsu (ms)
7	200	10
8	250	10
9	300	10
10	20	20
1	250	20
12	30	20

Dyskusja

Niniejszy artykuł wideo demonstruje, jak wykorzystać system elektroporacji MXcell do łatwego wyznaczenia optymalnych warunków elektroporacji dla MEF lub innych pierwotnych linii komórkowych. Format płytki 96-dołkowej pozwala na jednoczesne przeprowadzenie wielu powtórzeń warunków eksperymentalnych lub optymalizacyjnych, co może wyeliminować konieczność wykonywania wielu oddzielnych doświadczeń. Podczas przeprowadzania tej procedury należy pamiętać o tym, aby używać zdrowych komórek jak najkrócej po ich izolacji oraz stosować warunki elektroporacji dopasowane do użytego buforu do elektroporacji.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Bufor do elektroporacji Gene Pulser®	Bio-Rad	165-2676
System do elektroporacji Gene Pulser MXcell™	Bio-Rad	165-2670
Komora na kuwety Gene Pulser MXcell™ ShockPod™	Bio-Rad	165-2673
System do elektroporacji Gene Pulser MXcell™ z komorą na kuwety ShockPod™	Bio-Rad	165-2674