Drosophila hemocyty rozprzestrzeniają się po całym rozwijającym się embrionie. Niniejszy protokół demonstruje sposób montowania i obrazowania tych migracji z wykorzystaniem embrionów z hemocytami znakowanymi fluorescencyjnie.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Obrazowanie na żywo migracji hemocytów embrionalnych Drosophila melanogaster
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Wiele badań podejmuje kwestię migracji komórek z wykorzystaniemin vitro metody, podczas gdy środowiskiem istotnym fizjologicznie jest organizm sam w sobie. W niniejszym opracowaniu przedstawiamy protokół montażuDrosophila melanogaster zarodki i późniejsze obrazowanie na żywo fluorescencyjnie znakowanych hemocytów, które są makrofagami zarodkowymi tego organizmu. Z wykorzystaniem systemu Gal4-uas1indukujemy ekspresję różnych markerów kodowanych genetycznie i znakowanych fluorescencyjnie w hemocytach, aby śledzić ich rozwojowe rozprzestrzenianie się w całym embrionie. Po zebraniu embrionów na pożądanym etapie rozwoju, usuwa się zewnętrzny chorion, a następnie embriony są montowane w oleju halokarbonowym pomiędzy hydrofobową, przepuszczalną dla gazów membraną a szkiełkiem podstawowym w celu obrazowania na żywo. Oprócz ogólnych parametrów migracji, takich jak prędkość i kierunkowość, obrazowanie o wyższej rozdzielczości w połączeniu z zastosowaniem fluorescencyjnych reporterów F-aktyny i mikrotubul może dostarczyć bardziej szczegółowych informacji na temat dynamiki tych komponentów cytoszkieletu.
Protokół
Przygotowanie
- Należy pozyskać odpowiednie linie Drosophila zawierające specyficzny dla hemocytów sterownik Gal4 (np. srp-Gal42) oraz genetycznie zakodowany reporter fluorescencyjny pod kontrolą UAS (np. uas-GFP). Muchy homozygotyczne dla srp-Gal4,uas-GMA3 lub crq-Gal4,uas-GFP4, 5 są szczególnie użyteczne do celów obrazowania (n.b. GMA to GFP połączone z domeną wiążącą aktynę moezyny); zakres dostępnych sterowników Gal4 i konstruktów uas omówiono poniżej (Bloomington Stock Centre oferuje szeroki wybór).
- Krzyżówki genetyczne są zazwyczaj przeprowadzane w taki sposób, aby allele mutantów były zrównoważone za pomocą fluorescencyjnych balancerów CTG lub TTG6, przy czym sterowniki Gal4 i konstrukty uas znajdują się na alternatywnych chromosomach homologicznych. Umożliwia to selekcję mutantów homozygotycznych na podstawie braku fluorescencji GFP związanej z CTG/TTG (czynność ta jest wykonywana w kroku 2.1).
- Należy namnożyć populacje i umieścić muchy w klatce do składania jaj z płytką z agarem z soku jabłkowego7. Muchy potrzebują co najmniej dwóch dni na aklimatyzację w klatce, zanim zacznie być składane wystarczająca liczba embrionów. Zazwyczaj dwudziestu osobników każdej płci powinno wystarczyć do uzyskania odpowiedniej liczby embrionów do obrazowania, jednak należy pamiętać, że poszczególne linie różnią się stopniem płodności. Stosujemy 5mm szalki Petriego, które pasują do dna plastikowego zlewki z przebitym dnem w celu zapewnienia przepływu powietrza. Dokładny sposób zbierania embrionów nie jest istotny, natomiast kluczowe jest zachowanie ram czasowych, aby zebrać embriony w odpowiednim stadium rozwoju.
- Należy zebrać embriony z płytki z agarem z soku jabłkowego inkubowanej przez noc w 25°C lub z płytki z kontrolowanym czasem składania. W tym drugim przypadku zazwyczaj pozwalamy muchom składać jaja na uprzednio ogrzanej płytce przez 4 godziny, po czym usuwamy płytkę i umieszczamy ją w 18°C na 15-16 godzin przed montowaniem embrionów; pozwala to uzyskać embriony od późnego stadium 12 do stadium 15 rozwoju. Płytka inkubowana przez noc zawiera większą różnorodność stadiów, ale oferuje zaletę wyższego poziomu ekspresji reportera fluorescencyjnego w hemocytach dzięki dłuższemu okresowi czasu w 25°C, ponieważ system Gal4-UAS jest wrażliwy na temperaturę.
Procedura
- Oddziel zarodki z płytki z agarem z soku jabłkowego, używając niewielkiej ilości wody i pędzla z miękkim włosiem. Oddzielone zarodki są łatwo widoczne gołym okiem.
- Przenieś zarodki do sitka komórkowego (Fisher) lub własnoręcznie wykonanego koszyczka7, wlewając wodę z płytki z agarem z soku jabłkowego do koszyczka umieszczonego nad zlewką, w której zbiera się wodę odpadową.
- Powtarzaj krok 2.2 do momentu, aż uznasz, że z płytki z agarem z soku jabłkowego przeniesiono wystarczającą liczbę zarodków.
- Przepłucz zarodki w sitku komórkowym/koszyczku, używając wody.
- Umieść sitko komórkowe/koszyczek w pokrywce szalki Petriego od płytki z agarem z soku jabłkowego i dodaj wystarczającą ilość czystego wybielacza, aby zawiesić zarodki w sitku komórkowym/koszyczku.
- Monitoruj proces dechorionizacji zarodków pod mikroskopem dissectingowym w świetle jasnym: dechorionizacja jest zakończona, gdy wypustki grzbietowe ulegną rozpuszczeniu, co powinno nastąpić w ciągu dwóch minut.
- Wyjmij sitko komórkowe/koszyczek z zarodkami z wybielacza i wypłucz pozostałości wybielacza wodą. Wszystkie ślady wybielacza muszą zostać usunięte przed przejściem do kroku 2.8. Sposobem na sprawdzenie, czy cały wybielacz został usunięty, jest osuszenie resztek wody za pomocą niebieskich ręczników laboratoryjnych – jeśli pozostanie wybielacz, niebieski kolor zmieni się w biały/różowy.
- Osusz pozostałą wodę za pomocą ręczników laboratoryjnych/mediwipes, przykładając je do spodu sitka komórkowego/koszyczka.
- Umieść kroplę wody w pokrywce szalki Petriego. Za pomocą cienkiego pędzla zbierz wszystkie zdechorionizowane zarodki z koszyczka i zawieś je ponownie w kropli wody. Następnie osusz zarodki, odsysając wodę za pomocą mikropipety lub ostrożnie absorbując ją ręcznikiem laboratoryjnym/mediwipes.
- Po osuszeniu zarodków dodaj kroplę oleju voltalef, aby pokryć wszystkie zarodki. Obok kropli z zarodkami umieść drugą małą kroplę oleju. Uwaga: nie udało nam się znaleźć dostawcy oleju voltalef w Wielkiej Brytanii; zamiast niego można użyć oleju halokarbonowego 70 (Sigma).
- Pod fluorescencyjnym mikroskopem dissectingowym wybierz z kropli oleju odpowiednio rozwinięte zarodki pożądanego genotypu, używając pęsety zegarmistrzowskiej (numer 5). Pęseta ta powinna być zgięta do wewnątrz (Rysunek 1), aby móc podchwycić zarodki bez przebicia ich błony żółtkowej. Przenieś wybrane zarodki do drugiej kropli oleju. Ważne jest, aby widzieć fluorescencyjne hemocyty pod mikroskopem dissectingowym, co umożliwi wykonanie wysokiej jakości obrazów pod mikroskopem konfokalnym (Rysunek 2). Zazwyczaj montujemy zarodki w stadium 13/14, aby obrazować boczną migrację hemocytów wzdłuż linii środkowej brzusznej, lub zarodki w stadium 15, aby obrazować ruchliwość hemocytów po ich rozprzestrzenieniu się po zarodku.
- Przyklej dwa szkiełka nakrywkowe (18x18mm, grubość 1) do spodu naczynia Petriperm/Lumox (Sarstedt), używając 2 małych kropli oleju voltalef, pozostawiając około 1cm odstępu między nimi (Rysunek 3); będą one służyć jako podpory dla szkiełka nakrywkowego umieszczonego nad zarodkami, aby ich nie zmiażdżyć. Naczynia Petriperm (średnica 50mm) zawierają hydrofobową, przepuszczalną dla gazów membranę. Zauważyliśmy, że naczynia te stają się łatwiejsze w użyciu po kilkukrotnym wykorzystaniu (naczynia można przetrzeć 70% etanolem i użyć ponownie).
- Pod mikroskopem dissectingowym w świetle jasnym pobieraj wybrane zarodki pojedynczo za pomocą zgiętej pęsety i układaj je stroną brzuszną do góry, równolegle do krawędzi szkiełek nakrywkowych (Rysunek 3). W ten sposób można ustawić do 15 zarodków, w zależności od zręczności i cierpliwości operatora. Należy manipulować zarodkami delikatnie, ponieważ zarówno zarodki, jak i membrana naczynia Petriperm są kruche i mogą zostać łatwo uszkodzone.
- Po ustawieniu zarodków dodaj małą kroplę oleju i pozwól jej rozprzestrzenić się, tworząc jednorodną warstwę między dwoma szkiełkami nakrywkowymi. Po rozprzestrzenieniu się oleju (może to zająć kilka minut) sprawdź, czy zarodki nadal są zwrócone stroną brzuszną do góry. Jeśli zarodki lekko się obróciły, ponownie ustaw je pęsetą.
- Na koniec, używając pęsety (numer 3), umieść szkiełko nakrywkowe (18x18mm, grubość 1) nad zarodkami, opierając je na dwóch wcześniej przyklejonych szkiełkach. Przyklej to szkiełko do podpór za pomocą lakieru do paznokci (Rysunek 3).
- Przenieś naczynie Petriperm z zamontowanymi zarodkami do mikroskopu konfokalnego lub szerokopolowego i zamocuj naczynie na stoliku za pomocą odpowiedniego adaptera. Można użyć mikroskopu prostego lub odwróconego, z obiektywem ogniskującym przez szkiełko nakrywkowe (a nie przez membranę).
Reprezentatywny wynik:
Niniejszy protokół opisuje sposób montowania zarodków Drosophila do obrazowania na żywo hemocytów znajdujących się po stronie brzusznej zarodka. Przy prawidłowym wykonaniu możliwe będzie łatwe generowanie zarówno nieruchomych obrazów, jak i filmów przedstawiających hemocyty. Głównym czynnikiem determinującym jest użyty do obrazowania hemocytów mikroskop (w szczególności obiektyw), jednak charakter uzyskanych obrazów będzie również zależał od stadium rozwoju, temperatury hodowli zarodków oraz zastosowanych linii Gal4 i uas.
Wyższe poziomy ekspresji białka fluorescencyjnego umożliwią łatwiejsze obrazowanie hemocytów, dlatego ważne jest, aby hemocyty były widoczne w momencie, gdy zarodki znajdują się na etapie 2.1 protokołu (Rysunek 2 zawiera przykłady wyraźnych hemocytów wewnątrz zarodków, wykonane za pomocą kamery zamontowanej na mikroskopie sekcyjnym). Zatem zwiększona liczba konstruktów Gal4 i uas pozwala na uzyskanie lepszego stosunku sygnału do szumu. Ponadto zmniejsza to potrzebę stosowania wysokiej intensywności lasera lub zwiększonego czasu ekspozycji podczas obrazowania, co z kolei umożliwia śledzenie zachowania hemocytów przez dłuższy czas.
Bardzo wysokie poziomy ekspresji GFP pozwalają na zaobserwowanie szczegółów morfologii hemocytów, w szczególności cienkich, blaszkowatych lamelli otaczających koliste ciało komórki (Rycina 4A-B). Okrągłe obszary pozbawione GFP reprezentują fagosomy (Rycina 4A-C). Można również zauważyć palczaste filopodia wyłaniające się z lamelli (Rycina 4B). Dwa sterowniki Gal4 pozostają wystarczające do obserwacji tych procesów (Rycina 4C), szczególnie jeśli jednym z nich jest srp-Gal4 (patrz dyskusja), jednak może być wymagana mniejsza prędkość skanowania lub większa moc lasera w mikroskopie konfokalnym. Wraz ze spadkiem poziomów ekspresji obrazowanie wypustek hemocytów staje się trudniejsze; niemniej jednak w tych warunkach wciąż możliwe jest śledzenie migracji hemocytów, ponieważ ciało komórki pozostaje wyraźne nawet wtedy, gdy wypustki są mniej widoczne (Rycina 4D).
Na wcześniejszych etapach rozwoju (do stadium 13) hemocyty migrują w bliskim kontakcie ze sobą, przez co często trudno jest rozróżnić poszczególne komórki. Pod koniec stadium 13 hemocyty tworzą pojedynczą linię wzdłuż brzusznej linii środkowej (Rycina 5A), a następnie, stając się bardziej ruchliwe, migrują bocznie w stronę krawędzi brzusznego sznura nerwowego (Rycina 5B). Cytoszkielet aktynowy w dynamicznych wypustkach hemocytów można bezpośrednio obserwować dzięki ekspresji GMA (Rycina 5C) lub cherry-moesin.
Montowanie zarodków w ten sposób umożliwia wymianę gazową i zapobiega odwodnieniu, dzięki czemu zarodki pozostają żywotne po obrazowaniu. Jeśli zarodek zostanie uszkodzony podczas montowania, jest to zazwyczaj oczywiste, ponieważ zawartość zarodka wycieknie przez błonę witelinową. Jeśli zarodek zacznie ulegać odwodnieniu, często można to zauważyć po deformacjach błony witelinowej. Sporadycznie zarodek może obrócić się w trakcie nagrywania filmu timelapse, jednak zdarza się to zazwyczaj tylko przy filmach obejmujących dłuższe przedziały czasowe. Wreszcie, montowanie kilku zarodków jednocześnie daje eksperymentatorowi największą szansę na uzyskanie zarodka w orientacji idealnej dla prowadzonego doświadczenia.
Rycina 1. Pinceta do manipulacji embrionami po usunięciu otoczki chorionowej.
Końcówki pęsety zegarmistrzowskiej (rozmiar nr 5) należy wygiąć do wewnątrz, aby stworzyć narzędzie do wybierania embrionów, jak pokazano tutaj. Zewnętrzna powierzchnia wygiętego obszaru jest również przydatna do manipulowania embrionami podczas ich pozycjonowania na membranie Petriperm, ponieważ nie posiada ostrych krawędzi, które mogłyby przebić embrion.
Rycina 2. Reprezentatywne obrazy embrionów, które zapewnią dobre wyniki obrazowania na żywo.
Zdjęcia zdechorionowanych embrionów w oleju voltalef (etap 2.1 protokołu) wykonane przy użyciu fluorescencyjnego mikroskopu stereoskopowego. Widoki boczne stadium 13 (A) i stadium 15 (B) srp-Gal4,uas-GFP;crq-Gal4,uas-GFP embriony. Widok boczny stadium 15 srp-Gal4,uas-GFP/+;crq-Gal4,uas-GFP/uas-N17Rac zarodek (C), w którym hemocyty nie przedostały się poza obszar głowy, obrazujący wygląd zarodków, w których hemocyty nie są widoczne wzdłuż dróg migracji. Widok boczny stadium 17 srp-Gal4,uas-GFP;crq-Gal4,uas-GFP zarodek wykazujący skomplikowaną strukturę jelita na tym etapie rozwoju (D); rozpoczęcie skurczów mięśni uniemożliwia obrazowanie na żywo zarodków powyżej tego etapu rozwoju. Widok brzuszny stadium 13 (E) i stadium 14 (F) srp-Gal4, uas-red stinger embriony wykazujące rozproszenie hemocytów z jądrami znakowanymi fluorescencyjnie. Obserwacja hemocytów przy użyciu fluorescencji na etapie 2.1 protokołu jest warunkiem koniecznym do uzyskania wysokiej jakości obrazów; na wszystkich zdjęciach strona przednia znajduje się po prawej stronie.
Rysunek 3. Montaż embrionów na płytce Petriperm/Lumox.
Dwie szkiełka nakrywkowe o wymiarach 18x18 mm (grubość 1) zostają przymocowane do dolnej powierzchni naczynia Petriperm za pomocą małej kropli oleju, w odstępie około 1 cm, jak pokazano na rysunku. Następnie zarodki ustawia się stroną brzuszną do góry, tak aby ich oś długa (przednio-tylna) była równoległa do krawędzi szkiełek, a następnie pokrywa się je małą kroplą oleju. Gdy olej rozprzestrzeni się i wypełni przestrzeń między dwoma szkiełkami, trzecie szkiełko nakrywkowe (18x18 mm, grubość 1) delikatnie kładzie się na pokrytych olejem zarodkach, wykorzystując dwa wcześniej przymocowane szkiełka jako pomost, aby zapobiec zgnieceniu zarodków. Szkiełko to zostaje następnie przyklejone do dwóch szkiełek pomostowych za pomocą dwóch małych kropel lakieru do paznokci. Po zastygnięciu lakieru zarodki można obrazować pod mikroskopem prostym lub odwróconym, ustawiając ostrość obiektywu przez szkiełko nakrywkowe (a nie przez membranę Petriperm).
Rycina 4. Reprezentatywne wyniki obrazowania na żywo hemocytów znakowanych białkiem GFP.
Projekcje Z hemocytów na stronie brzusznej stadium 14 srp-Gal4,uas-GFP;crq-Gal4,uas-GFP embrion (A-B). (A) jest obrazem o mniejszym powiększeniu, stosowanym np. do monitorowania migracji rozwojowych hemocytów w filmach poklatkowych. (B) jest statycznym obrazem o większym powiększeniu przedstawiającym hemocyty na linii środkowej brzusznej, ukazującym szczegóły ich morfologii. (C) jest pojedynczym przekrojem o grubości 1 $\mu$m przedstawiającym hemocyty na linii środkowej brzusznej w stadium 14 srp-Gal4,uas-GFP/+;crq-Gal4,uas-GFP/+ zarodek, wykazując, że mniejsza liczba kopii sterowników Gal4 oraz konstruktów UAS jest również wystarczająca do uzyskania wysokiej jakości obrazów. (D) przedstawia projekcję osi Z hemocytów w stadium 14 crq-Gal4, uas-GFP zarodek. Tutaj wypustki hemocytów są mniej widoczne ze względu na niższą ekspresję GFP, jednak przy zastosowaniu tej kombinacji drivera Gal4 i konstruktu uas nadal możliwe jest nagrywanie filmów i śledzenie migracji hemocytów. Obrazy wykonano przy użyciu konfokalnego mikroskopu Leica LSM510; na wszystkich zdjęciach góra odpowiada stronie przedniej; pierścienie na obrzeżach obrazów są wynikiem autofluorescencji błony witelialnej.
Rycina 5. Reprezentatywne wyniki obrazowania na żywo hemocytów wykazujących ekspresję GMA.
Projekcje Z hemocytów na brzusznej linii środkowej w stadium 13 (A) i stadium 14 (B) srp-Gal4, uas-GMA zarodki, pobrane z filmów timelapse, przedstawiające migracje rozwojowe hemocytów. Szczegółowe informacje na temat dynamiki aktyny można uzyskać dzięki obrazowaniu hemocytów wykazujących ekspresję GMA przy większym powiększeniu (C). GMA składa się z białka GFP połączonego z domeną wiążącą aktynę moezyny i znakuje filamenty aktynowe. Na wszystkich obrazach góra odpowiada stronie przedniej; zdjęcia wykonano za pomocą mikroskopu konfokalnego.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Najważniejszymi elementami tej procedury są wybór zdrowych zarodków z wyraźnie oznakowanymi hemocytami oraz ich ostrożne montowanie w celu uniknięcia uszkodzeń. Po umieszczeniu zarodków w oleju halowęglowym stają się one odporne na odwodnienie i po zamontowaniu mogą być obrazowane przez kilka godzin. W naszych warunkach jesteśmy w stanie obrazować hemocyty przez trzy godziny, przy pomijalnym odwodnieniu zarodka lub braku widocznych uszkodzeń fotochemicznych, wykonując z-stack obrazów co trzy minuty na mikroskopie konfoka...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Podziękowania
Niniejszy protokół został opracowany w ramach naszej pracy oraz we współpracy z laboratoriami Paula Martina i Antonio Jacinto. Dziękujemy Bloomington Stock Centre za doskonałą obsługę, a społeczności badawczej Drosophila za dalsze udostępnianie linii much. BS jest obecnie finansowany z grantu projektowego BBSRC. WW jest finansowany w ramach stypendium Career Development Fellowship przyznanego przez Wellcome Trust.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Sito do komórek | BD Biosciences | 352350 | pory 70μm |
| Olej Halcarbon 700 | Sigma-Aldrich | H8898 | |
| Szalka Lumox/Petriperm | Sarstedt Ltd | 96077305 |
Bibliografia
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
- Bruckner, K. The PDGF/VEGF receptor controls blood cell survival in Drosophila. Dev Cell. 7, 73-84 (2004).
- Dutta, D., Bloor, J. W., Ruiz-Gomez, M., VijayRaghavan, K., Kiehart, D. P. Real-time imaging of morphogenetic movements in Drosophila using Gal4-UAS-driven expression of GFP fused to the actin-binding domain of moesin. Genesis. 34, 146-151 (2002).
- Stramer, B. Live imaging of wound inflammation in Drosophila embryos reveals key roles for small GTPases during in vivo cell migration. J Cell Biol. 168, 567-573 (2005).
- Wood, W., Jacinto, A. Drosophila melanogaster embryonic haemocytes: masters of multitasking. Nat Rev Mol Cell Biol. 8, 542-551 (2007).
- Halfon, M. S. New fluorescent protein reporters for use with the Drosophila Gal4 expression system and for vital detection of balancer chromosomes. Genesis. 34, 135-138 (2002).
- Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. Drosophila protocols. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. NY. (2000).
- Tepass, U., Fessler, L. I., Aziz, A., Hartenstein, V. Embryonic origin of hemocytes and their relationship to cell death in Drosophila. Development. 120, 1829-1837 (1994).
- Millard, T. H., Martin, P. Dynamic analysis of filopodial interactions during the zippering phase of Drosophila dorsal closure. Development. 135, 621-626 (2008).
- Doerflinger, H., Benton, R., Shulman, J. M., St Johnston, D. The role of PAR-1 in regulating the polarised microtubule cytoskeleton in the Drosophila follicular epithelium. Development. 130, 3965-3975 (2003).
- Olofsson, B., Page, D. T. Condensation of the central nervous system in embryonic Drosophila is inhibited by blocking hemocyte migration or neural activity. Dev Biol. 279, 233-243 (2005).
- Paladi, M., Tepass, U. Function of Rho GTPases in embryonic blood cell migration in Drosophila. J Cell Sci. 117, 6313-6326 (2004).
- Vlisidou, I. Drosophila embryos as model systems for monitoring bacterial infection in real time. PLoS Pathog. 5, e1000518-e1000518 (2009).
- Jacinto, A. Dynamic actin-based epithelial adhesion and cell matching during Drosophila dorsal closure. Curr Biol. 10, 1420-1426 (2000).
- Wood, W., Jacinto, A. Imaging cell movement during dorsal closure in Drosophila embryos. Methods Mol Biol. 294, 203-210 (2005).
- Kunwar, P. S. Tre1 GPCR initiates germ cell transepithelial migration by regulating Drosophila melanogaster E-cadherin. J Cell Biol. 183, 157-168 (2008).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
