Opisujemy protokół szybkiej i czułej kwantyfikacji stopnia nasilenia choroby w mysich modelach ataksji móżdżkowej. Pomiary obejmują kleszczenie kończyn tylnych, test krawędzi, chód oraz kifozę. Protokół ten skutecznie rozróżnia osobniki dotknięte chorobą od osobników zdrowych i pozwala wykryć postęp choroby u osobników dotkniętych w czasie.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Prosty system punktacji złożonego fenotypu do oceny modeli mysich ataksji móżdżkowej
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Opisujemy protokół do szybkiej i czułej kwantyfikacji stopnia zaawansowania choroby w mysich modelach ataksji móżdżkowej. Został on opracowany na podstawie wcześniej opublikowanych ocen fenotypowych w kilku modelach chorobowych, w tym w ataksjach spinocerebelarnych, chorobie Huntingtona oraz spinobulbarnej atrofii mięśniowej. Pomiary obejmują przykurcz tylnych kończyn (clasping), test krawędzi, chód oraz kifozę. Każdy parametr jest oceniany w skali 0-3, dając łączną sumę od 0 do 12 dla wszystkich czterech pomiarów. Wyniki skutecznie różnicują osobniki dotknięte chorobą od tych zdrowych, kwantyfikując jednocześnie czasowy postęp fenotypów chorób neurodegeneracyjnych. Pomiary można analizować oddzielnie lub łączyć w złożony wynik fenotypowy w celu uzyskania większej mocy statystycznej. Optymalna kombinacja czterech opisanych pomiarów zależy od analizowanego schorzenia. Przedstawiamy przykład zastosowania protokołu do oceny stopnia zaawansowania choroby w transgenicznym modelu mysim ataksji spinocerebelarnej typu 7 (SCA7).
Albert R. La Spada i Gwenn A. Garden wnieśli równy wkład w przygotowanie tego manuskryptu.
Protokół
Aby zapobiec błędom poznawczym, osoba przeprowadzająca oceny nie powinna znać genotypu zwierzęcia. Pojedyncze pomiary ocenia się w skali od 0 do 3, gdzie 0 oznacza brak odpowiedniego fenotypu, a 3 najsilniejszy przejaw. Każdy test wykonuje się wielokrotnie, aby upewnić się, że wynik jest powtarzalny. Otyłość utrudni interpretację wszystkich opisanych pomiarów. Badacz może chcieć zważyć myszy po ocenie fenotypu, aby ocenić możliwy wpływ tkanki tłuszczowej na wyniki.
Test krawędziowy
Test krawędziowy jest bezpośrednią miarą koordynacji, która jest upośledzona w ataksjach móżdżkowych i wielu innych schorzeniach neurodegeneracyjnych. Pomiar ten jest najbardziej bezpośrednio porównywalny z ludzkimi objawami ataksji móżdżkowej.
- Podnieś mysz z klatki i umieść ją na jej krawędzi. Myszy zazwyczaj idą wzdłuż krawędzi i próbują zejść z powrotem do klatki.
- Obserwuj mysz podczas chodzenia wzdłuż krawędzi klatki i schodzenia do jej wnętrza. Mysz typu dzikiego zazwyczaj idzie wzdłuż krawędzi bez utraty równowagi i zgrabnie schodzi do klatki, używając łap. Takie zachowanie ocenia się na 0 punktów. Jeśli mysz traci przyczepność podczas chodzenia po krawędzi, ale poza tym wydaje się skoordynowana, otrzymuje 1 punkt. Jeśli nie korzysta efektywnie z tylnych kończyn lub podczas schodzenia do klatki ląduje na głowie zamiast na łapach, otrzymuje 2 punkty. Jeśli mysz spada z krawędzi lub prawie spada podczas chodzenia bądź próby zejścia, lub trzęsie się i całkowicie odmawia ruchu mimo zachęty, otrzymuje 3 punkty. Niektóre myszy mogą wymagać delikatnego popchnięcia, aby zachęcić je do przejścia wzdłuż krawędzi lub zejścia do klatki.
- Zapisz wynik testu krawędziowego.
Kurcz tylnych kończyn
Przykurcz kończyn tylnych jest markerem progresji choroby w wielu modelach mysich neurodegeneracji, w tym w przypadku niektórych ataksji móżdżkowych [1].
- Chwyć mysz za ogon u nasady i unieś ją nad wszystkie otaczające przedmioty.
- Obserwuj ułożenie kończyn tylnych przez 10 sekund. Jeśli kończyny tylne są stale rozstawione na zewnątrz, z dala od brzucha, przypisuje się wynik 0. Jeśli jedna kończyna tylna jest przyciągnięta do brzucha przez ponad 50% czasu zawieszenia, przypisuje się wynik 1. Jeśli obie kończyny tylne są częściowo przyciągnięte do brzucha przez ponad 50% czasu zawieszenia, przypisuje się wynik 2. Jeśli kończyny tylne są całkowicie przyciągnięte i dotykają brzucha przez ponad 50% czasu zawieszenia, przypisuje się wynik 3.
- Umieść mysz z powrotem w klatce i zapisz uzyskany wynik przyciągania kończyn tylnych.
Chód
Chód jest miarą koordynacji i funkcji mięśniowej.
- Wyjmij mysz z klatki i umieść ją na płaskiej powierzchni tak, aby głowa była skierowana w stronę przeciwną do badacza.
- Obserwuj mysz od tyłu podczas chodzenia. Jeśli mysz porusza się normalnie, ciężar ciała jest rozłożony na wszystkie kończyny, brzuch nie dotyka podłoża, a obie kończyny tylne pracują równomiernie, otrzymuje wynik 0. Jeśli występuje drżenie lub mysz utyka podczas chodzenia, otrzymuje wynik 1. Jeśli występuje silne drżenie, silne utykanie, obniżenie miednicy lub stopy są skierowane na zewnątrz podczas poruszania się („stopy kacze”), otrzymuje wynik 2. Jeśli mysz ma trudności z poruszaniem się do przodu i przeciąga brzuch po ziemi, otrzymuje wynik 3.
- Umieść mysz z powrotem w klatce i zapisz ocenę chodu.
Kifoza
Kifoza to charakterystyczne wygięcie grzbietowe kręgosłupa, które jest częstą manifestacją chorób neurodegeneracyjnych w modelach mysich [2]. Jest ona spowodowana utratą napięcia mięśni grzbietu wtórnie do neurodegeneracji.
- Wyjmij mysz z klatki i umieść ją na płaskiej powierzchni.
- Obserwuj mysz podczas chodzenia. Jeśli mysz jest w stanie łatwo wyprostować kręgosłup podczas chodzenia i nie wykazuje utrwalonej kifozy, otrzymuje ocenę 0. Jeśli mysz wykazuje łagodną kifozę, ale jest w stanie wyprostować kręgosłup, otrzymuje ocenę 1. Jeśli nie jest w stanie całkowicie wyprostować kręgosłupa i utrzymuje utrwaloną, lecz łagodną kifozę, otrzymuje ocenę 2. Jeśli mysz utrzymuje wyraźną kifozę podczas chodzenia lub siedzenia, przypisuje się jej ocenę 3.
- Umieść mysz z powrotem w klatce i zapisz ocenę kifozy.
Reprezentatywne wyniki
Przy zastosowaniu odpowiedniej liczby zwierząt procedura ta pozwala na wykrycie różnic fenotypowych pomiędzy szczepami oraz w obrębie tego samego szczepu w czasie. W celu analizy danych należy obliczyć wynik dla każdego pomiaru, wyciągając średnią z trzech pomiarów u każdego osobnika. Pomiary mogą być analizowane oddzielnie lub połączone w złożony wynik fenotypowy dla każdego osobnika.
Przedstaw dane na wykresach i zastosuj odpowiednie metody statystyczne w celu określenia istotności. Rysunek 1 przedstawia wyniki złożonej oceny fenotypowej mysiego modelu transgenicznego SCA7. W tym modelu transgenicznym floxed-SCA7-92Q ludzki gen ataksyny-7 z 92 powtórzeniami CAG jest flankowany sekwencjami loxP i eksprymowany z bakteryjnego chromosomu sztucznego. Złożony wynik fenotypowy obejmuje oceny przywierania kończyn (clasping), chodzenia po krawędzi, chodu oraz kifozy, przy maksymalnej możliwej liczbie punktów wynoszącej 12. Postępujący fenotyp SCA7 u transgenicznych myszy floxed-SCA7-92Q objawia się wzrostem złożonego wyniku fenotypowego, co jest zgodne z postępującym charakterem tej choroby u ludzi.
Rycina 1. Myszy Floxed-SCA7-92Q wykazują progresywny fenotyp SCA7, który różni się znacząco od rodzeństwa Non-Transgenic począwszy od 20. tygodnia (ANOVA 2-drogowa: test post-hoc Bonferroniego; ***P<0.001). Myszy oceniano w skali 0-3 dla każdego z testów: testu krawędzi, przywierania (clasping), chodu oraz kifozy. Obliczono średni wynik złożony dla każdego genotypu w każdym wieku. Słupki reprezentują SEM.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Niniejszy protokół został opracowany jako czuła i łatwa do przeprowadzenia metoda oceny stopnia nasilenia choroby w mysich modelach ataksji móżdżkowej. Poszczególne elementy systemu punktacji będą w różnym stopniu skuteczne w zależności od zastosowanego mysiego modelu neurodegeneracji.
Elementy tego systemu oceniania zostały skutecznie wykorzystane do oceny różnych modeli mysich ludzkich chorób neurodegeneracyjnych, w tym ataksji móżdżkowych, choroby Huntingtona oraz rdzeniowo-opłtkowej atrof...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Badania te zostały zatwierdzone przez Komisję ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (Institutional Animal Care and Use Committee) Uniwersytetu Waszyngtońskiego.
Podziękowania
Praca ta była finansowana z grantów NIH NS052535 dla G.A.G oraz EY014061 i EY014997 dla A.R.L., a także z funduszy konsorcjum UL1DE019583-02.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Bibliografia
- Chou, A. H. Polyglutamine-expanded ataxin-3 causes cerebellar dysfunction of SCA3 transgenic mice by inducing transcriptional dysregulation. Neurobiol Dis. 31 (1), 89-101 (2008).
- Thomas, P. S. Jr Loss of endogenous androgen receptor protein accelerates motor neuron degeneration and accentuates androgen insensitivity in a mouse model of X-linked spinal and bulbar muscular atrophy. Hum Mol Genet. 15 (14), 2225-2238 (2006).
- Ditzler, S., Stoeck, J., LeBlanc, M., Kooperberg, C., Hansen, S., Coppin, L., Olson, J. M. A Rapid Neurobehavioral Assessment Reveals that FK506 Delays Symptom Onset in R6/2 Huntington's Disease Mice. Preclinica Research Articles. 1 (3), 115-126 (2003).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
