Prosty złożony system oceny fenotypu do oceny mysich modeli ataksji móżdżkowej

Summary

Opisujemy protokół do szybkiej i czułej oceny nasilenia choroby w mysich modelach ataksji móżdżkowej. Środki obejmują zaciskanie kończyn tylnych, test półki, chód i kifozę. Protokół ten skutecznie rozróżnia osoby dotknięte chorobą i zdrowe oraz wykrywa postęp osób dotkniętych chorobą w czasie.

Abstract

Opisujemy protokół do szybkiej i czułej oceny nasilenia choroby w mysich modelach ataksji móżdżku. Wywodzi się z wcześniej opublikowanych ocen fenotypu w kilku modelach chorób, w tym ataksji rdzeniowo-móżdżkowej, choroby Huntingtona i rdzeniowo-opuszkowego zaniku mięśni. Środki obejmują zaciskanie kończyn tylnych, test półki, chód i kifozę. Każda miara jest rejestrowana w skali od 0 do 3, przy czym łączna suma wynosi od 0 do 12 dla wszystkich czterech miar. Wyniki skutecznie rozróżniają osoby dotknięte chorobą i zdrowe, jednocześnie określając ilościowo postęp fenotypów chorób neurodegeneracyjnych w czasie. Miary mogą być analizowane indywidualnie lub łączone w złożony wynik fenotypu w celu uzyskania większej mocy statystycznej. Idealna kombinacja czterech opisanych miar będzie zależeć od danego zaburzenia. Przedstawiono przykład protokołu stosowanego do oceny ciężkości choroby w transgenicznym mysim modelu ataksji rdzeniowo-móżdżkowej typu 7 (SCA7).

Albert R. La Spada i Gwenn A. Garden w równym stopniu przyczynili się do powstania tego manuskryptu.

Protocol

Aby zapobiec stronniczości, eksperymentator dokonujący oceny nie powinien mieć wiedzy na temat genotypu zwierzęcia. Poszczególne pomiary są oceniane w skali od 0 do 3, gdzie 0 oznacza brak odpowiedniego fenotypu, a 3 oznacza najcięższą manifestację. Każdy test jest wykonywany wielokrotnie, aby upewnić się, że wynik jest powtarzalny. Otyłość skomplikuje interpretację wszystkich opisanych wskaźników. Badacz może chcieć zważyć myszy na podstawie oceny fenotypu, aby ocenić możliwą rolę otyłości w wynikach.

Test półki

Test półki jest bezpośrednim pomiarem koordynacji, która jest upośledzona w ataksji móżdżku i wielu innych zaburzeniach neurodegeneracyjnych. Środek ten jest najbardziej bezpośrednio porównywalny z ludzkimi objawami ataksji móżdżkowej.

1. Podnieś mysz z klatki i umieść ją na półce klatki. Myszy zazwyczaj chodzą po półce i próbują zejść z powrotem do klatki.
2. Obserwuj mysz, gdy idzie wzdłuż półki klatki i opuszcza się do klatki. Mysz typu dzikiego zazwyczaj chodzi po półce skalnej, nie tracąc równowagi i z wdziękiem opuszcza się z powrotem do klatki, używając łap. Do tego przypisany jest wynik 0. Jeśli mysz straci równowagę podczas chodzenia po półce, ale poza tym wydaje się skoordynowana, otrzymuje wynik 1. Jeśli nie używa skutecznie tylnych nóg lub ląduje na głowie, a nie na łapach podczas schodzenia do klatki, otrzymuje wynik 2. Jeśli spadnie z półki skalnej lub prawie spadnie podczas chodzenia lub próby zejścia się, lub trząś się i w ogóle nie chce się ruszać pomimo zachęty, otrzymuje wynik 3. Niektóre myszy będą wymagały delikatnego szturchnięcia, aby zachęcić je do chodzenia po półce lub zejścia do klatki.
3. Zapisz wynik testu półki
.

Zaciskanie kończyn tylnych

Zaciskanie kończyn tylnych jest markerem postępu choroby w wielu mysich modelach neurodegeneracji, w tym w niektórych ataksjach móżdżku [1].

1. Chwyć ogon w pobliżu jego podstawy i unieś mysz z dala od wszystkich otaczających obiektów.
2. Obserwuj pozycję kończyn tylnych przez 10 sekund. Jeśli tylne kończyny są konsekwentnie rozstawione na zewnątrz, z dala od brzucha, przypisuje się mu wynik 0. Jeśli jedna tylna kończyna jest cofnięta w kierunku brzucha przez ponad 50% czasu zawieszenia, otrzymuje wynik 1. Jeśli obie tylne kończyny są częściowo cofnięte w kierunku brzucha przez ponad 50% czasu zawieszenia, otrzymuje wynik 2. Jeśli jego tylne kończyny są całkowicie cofnięte i dotykają brzucha przez ponad 50% czasu zawieszenia, otrzymuje wynik 3.
3. Umieść mysz z powrotem w klatce i zapisz wynik zaciśnięcia tylnych kończyn
.

chód

Chód jest miarą koordynacji i funkcji mięśni.

1. Wyjmij mysz z klatki i połóż ją na płaskiej powierzchni z głową skierowaną w stronę przeciwną do badacza.
2. Obserwuj mysz od tyłu, gdy idzie. Jeśli mysz porusza się normalnie, z ciężarem ciała opartym na wszystkich kończynach, z brzuchem nie dotykającym ziemi i z obiema tylnymi kończynami uczestniczącymi równomiernie, otrzymuje wynik 0. Jeśli wykazuje drżenie lub wydaje się, że utyka podczas chodzenia, otrzymuje wynik 1. Jeśli wykazuje silne drżenie, silne utykanie, obniżoną miednicę lub stopy skierowane są od ciała podczas lokomocji ("kacze stopy"), otrzymuje wynik 2. Jeśli mysz ma trudności z poruszaniem się do przodu i ciągnie brzuchem po ziemi, otrzymuje wynik 3.
3. Umieść mysz z powrotem w klatce i zapisz jej wynik chodu.

Kifoza

Kyfoza to charakterystyczne grzbietowe skrzywienie kręgosłupa, które jest częstym przejawem choroby neurodegeneracyjnej w modelach mysich [2]. Jest to spowodowane utratą napięcia mięśniowego w mięśniach rdzenia kręgowego wtórną do neurodegeneracji.

1. Wyjmij mysz z klatki i umieść ją na płaskiej powierzchni.
2. Obserwuj go, gdy idzie. Jeśli mysz jest w stanie łatwo wyprostować kręgosłup podczas chodzenia i nie ma uporczywej kifozy, otrzymuje wynik 0. Jeśli mysz wykazuje łagodną kifozę, ale jest w stanie wyprostować kręgosłup, otrzymuje wynik 1. Jeśli nie jest w stanie całkowicie wyprostować kręgosłupa i utrzymuje uporczywą, ale łagodną kifozę, otrzymuje wynik 2. Jeśli mysz utrzymuje wyraźną kifozę podczas chodzenia lub siedzenia, przypisuje się jej wynik 3.
3. Umieść mysz z powrotem w klatce i zapisz jej wynik kifozy.

Reprezentatywne wyniki

Przy wystarczającej liczbie zwierząt, ta procedura jest w stanie wykryć różnice fenotypowe między szczepami i w obrębie tego samego szczepu w czasie. W celu analizy danych oblicz wynik dla każdej miary, biorąc średnią z trzech pomiarów w każdej osobie. Miary mogą być analizowane oddzielnie lub łączone w złożony wynik fenotypu dla każdej osoby.

Sporządź wykres danych i zastosuj odpowiednie metody statystyczne, aby określić istotność. Rysunek 1 przedstawia wyniki złożonej oceny fenotypu mysiego transgenicznego modelu SCA7. W tym transgenicznym modelu SCA7-92Q ludzki gen ataksyny-7 z 92 powtórzeniami CAG jest otoczony miejscami loxP i ulega ekspresji ze sztucznego chromosomu bakteryjnego. Złożony wynik fenotypu obejmuje oceny zapinania, chodzenia po półkach, chodu i kifozy, co daje maksymalny możliwy wynik 12. Postępujący fenotyp SCA7 u myszy transgenicznych z floksowanym SCA7-92Q wykazuje rosnący złożony wynik fenotypu, co jest zgodne z postępującym charakterem choroby u ludzi.

Rysunek 1. Myszy Floxed-SCA7-92Q wykazują postępujący fenotyp SCA7, który znacznie różni się od nietransgenicznych rodzeństwa z miotu, począwszy od 20 tygodnia (2-kierunkowa ANOVA: Bonferroni post-hoc; ***P<0,001). Myszy oceniano w skali 0-3 pod kątem testu półki, zaciskania, chodu i kifozy. Obliczono średni złożony wynik dla każdego genotypu w każdym wieku. Słupki reprezentują SEM.

Discussion

Protokół ten został zaprojektowany tak, aby był czułą i łatwą do przeprowadzenia oceną ciężkości choroby w mysich modelach ataksji móżdżkowej. Poszczególne elementy systemu punktacji będą mniej lub bardziej skuteczne w różnych mysich modelach neurodegeneracji.

Elementy tego systemu punktacji zostały skutecznie wykorzystane do oceny różnych mysich modeli chorób neurodegeneracyjnych u ludzi, w tym ataksji móżdżkowej, choroby Huntingtona i rdzeniowo-opuszkowego zaniku mięśni [1-3]. Idealna kombi...