Artykuł metodologiczny

Hi-C: Metoda badania trójwymiarowej architektury genomów.

415.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/1869

⸱

6 maja 2010

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Program in Gene Function and Expression, Department of Biochemistry and Molecular Pharmacology, University of Massachusetts Medical School, 2Broad Institute of Harvard and Massachusetts Institute of Technology, 3Division of Health Sciences and Technology, Massachusetts Institute of Technology, 4Program for Evolutionary Dynamics, Department of Organismic and Evolutionary Biology, Department of Mathematics, Harvard University , 5Department of Applied Mathematics, Harvard University , 6Department of Physics, Massachusetts Institute of Technology, 7Department of Systems Biology, Harvard Medical School, 8Department of Biology, Massachusetts Institute of Technology

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Metoda Hi-C umożliwia bezstronną, genomową identyfikację oddziaływań chromatyny (1). Hi-C łączy ligację bliskościową z sekwencjonowaniem masowo równoległym. Wynikowe dane mogą być wykorzystane do badania architektury genomowej w wielu skalach: wstępne wyniki pozwoliły zidentyfikować takie cechy jak terytoria chromosomowe, segregacja chromatyny otwartej i zamkniętej oraz struktura chromatyny w skali megabazy.

Streszczenie

Trójwymiarowe zwijanie się chromosomów prowadzi do kompartymentalizacji genomu i może zbliżać do siebie w przestrzeni odległe elementy funkcjonalne, takie jak promotory i enhancery 2-6. Zrozumienie zależności między organizacją chromosomów a aktywnością genomu pomoże w wyjaśnieniu procesów genomicznych, takich jak transkrypcja i replikacja. Jednak niewiele wiadomo o mechanizmach zwijania się chromosomów. Mikroskopia nie pozwala na jednoczesne rozróżnianie licznych loci lub ich obrazowanie z wysoką rozdzielczością. Do tej pory wykrywanie interakcji chromosomalnych przy użyciu metody uchwycenia konformacji chromosomów (3C) i jej późniejszych modyfikacji wymagało wyboru zestawu docelowych loci, co uniemożliwiało prowadzenie badań w skali całego genomu 7-10.

Opracowaliśmy metodę Hi-C, będącą rozszerzeniem techniki 3C, która umożliwia identyfikację oddziaływań dalekiego zasięgu w sposób nieobciążony w skali całego genomu. W metodzie Hi-C komórki są utrwalane formaldehydem, co powoduje powiązanie oddziałujących loci za pomocą kowalencyjnych mostków białkowo-DNA. Gdy DNA jest następnie fragmentowane za pomocą enzymu restrykcyjnego, loci te pozostają połączone. Podczas wypełniania nawisów 5' wbudowywany jest resztowy pierścień biotyny. Następnie przeprowadzana jest ligacja końców tępych w warunkach rozcieńczenia, które sprzyjają ligacji fragmentów DNA połączonych mostkami białkowymi. W rezultacie powstaje biblioteka produktów ligacji w skali całego genomu, odpowiadająca parom fragmentów, które pierwotnie znajdowały się w bliskim sąsiedztwie w jądrze komórkowym. Każdy produkt ligacji jest znakowany biotyną w miejscu złącza. Biblioteka jest poddawana fragmentacji mechanicznej, a złącza są wyodrębniane przy użyciu kulek z streptawidyną. Oczyszczone złącza mogą być następnie analizowane przy użyciu sekwenatora wysokoprzepustowego, co pozwala na stworzenie katalogu oddziałujących fragmentów.

Bezpośrednia analiza otrzymanej macierzy kontaktów ujawnia liczne cechy organizacji genomowej, takie jak obecność terytoriów chromosomowych oraz preferencyjne powiązania małych, bogatych w geny chromosomów. Analizę korelacyjną można zastosować do macierzy kontaktów, co wykazuje, że genom ludzki jest podzielony na dwa przedziały: przedział o mniejszej gęstości upakowania, zawierający otwartą, dostępną i aktywną chromatynę, oraz przedział o większej gęstości, zawierający zamknięte, niedostępne i nieaktywne regiony chromatyny. Wreszcie, analiza zespołowa macierzy kontaktów, w połączeniu z wyprowadzeniami teoretycznymi i symulacjami komputerowymi, wykazała, że w skali megabazy metoda Hi-C ujawnia cechy zgodne z konformacją fraktalnego globulu.

Protokół

Metoda ta została wykorzystana w badaniach opisanych w publikacji Lieberman-Aiden et al., Science 326, 289-293 (2009).

I. Sieciowanie, trawienie, znakowanie końców DNA i ligacja końców tępych

  1. Hi-C rozpoczyna się od sieciowania komórek, co jest wspólnym elementem wszystkich metod opartych na 3C. Aby zacząć, należy wyhodować od 2 x 107 do 2,5 x 107 komórek ssaków (adherentnych lub w zawiesinie), a następnie poddać je sieciowaniu. (Szczegóły dotyczące sieciowania komórek znajdują się w: 11
  2. Komórki należy zlizować w 550 μl buforu lizującego (500 μl 10 mM Tris-HCl pH 8,0, 10 mM NaCl, 0,2% Igepal CA-630 oraz 50 μl inhibitorów proteaz) przy użyciu homogenizatora. Chromatynę wirować przy 5 000 rpm, a osad przemyć dwukrotnie 500 μl 1x NEBuffer 2.
  3. Chromatynę resuspendować w 1x NEBuffer 2, podzielić na 5 ponumerowanych probówek i dodać 1x NEBuffer 2 do uzyskania końcowej objętości 362 μl. Dodać 38 μl 1% SDS, dokładnie wymieszać i inkubować w 65 °C przez 10 minut. Bezpośrednio po inkubacji umieścić probówki ponownie na lodzie.
  4. SDS należy zneutralizować, dodając 44 μl Triton X-100, i dokładnie wymieszać. Chromatynę poddać trawieniu, dodając 400 jednostek HindIII, i inkubować w 37 °C przez noc, cały czas rotując probówki.
  5. Kolejne kroki są specyficzne dla metody Hi-C i obejmują znakowanie końców DNA biotyną oraz ligację końców tępych sieciowanych fragmentów. Ten etap umożliwi późniejsze oczyszczanie miejsc ligacji. Probówka 1 nie powinna być poddawana etapowi biotynylacji; należy ją zachować oddzielnie jako kontrolę 3C, aby upewnić się, że warunki trawienia i ligacji były optymalne.
  6. Aby dopełnić nawisy fragmentów restrykcyjnych i zaznaczyć końce DNA biotyną w pozostałych 4 probówkach, do probówek 2-5 należy dodać 1,5 μl 10 mM dATP, 1,5 μl 10 mM dGTP, 1,5 μl 10 mM dTTP, 37,5 μl 0,4 mM biotin-14-dCTP oraz 10 μl 5U/μl Klenow. Dokładnie wymieszać i inkubować przez 45 minut w 37°C.
  7. Umieścić probówki na lodzie. Aby zinaktywować enzymy, do probówek 1-5 dodać 86 μl 10% SDS. Inkubować probówki w 65°C przez dokładnie 30 minut, a następnie natychmiast przenieść je na lód.
  8. Ligację przeprowadza się w warunkach ekstremalnego rozcieńczenia, aby sprzyjać zdarzeniom ligacyjnym pomiędzy sieciowanymi fragmentami. Pracując na lodzie, dodać 7,61 ml mieszaniny ligacyjnej [745 μl 10% Triton X-100, 745 μl 10x buforu do ligacji (500 mM Tris-HCl pH 7,5, 100 mM MgCl2, 100 mM DTT), 80 μl 10 mg/ml BSA, 80 μl 100 mM ATP i 5,96 ml wody] do każdej z pięciu ponumerowanych probówek 15 ml. Przenieść każdą mieszaninę strawionej chromatyny do odpowiadającej jej probówki 15 ml.
  9. W przypadku standardowej ligacji 3C, do probówki 1 dodać 10 μl 1U/μl ligazy DNA T4. W przypadku ligacji końców tępych Hi-C, do probówek 2-5 dodać 50 μl 1U/μl ligazy DNA T4. Wymieszać poprzez odwracanie probówek i inkubować wszystkie 5 probówek przez 4 godziny w 16°C.
  10. Sieciowania są odwracane, a białka degradowane poprzez dodanie 50 μl 10 mg/ml proteinazy K do każdej probówki i inkubowanie ich przez noc w 65°C. Następnego dnia dodać dodatkowe 50 μl 10 mg/ml proteinazy K do każdej probówki i kontynuować inkubację w 65°C przez kolejne 2 godziny.
  11. Schłodzić mieszaniny reakcyjne do temperatury pokojowej i przenieść je do pięciu stożkowych probówek 50 ml. DNA w tych probówkach należy oczyścić, wykonując ekstrakcję fenolową. Dodać 10 ml fenolu pH 8,0 i wortexować przez 2 minuty. Wirować probówki przez 10 minut przy 3 500 rpm i ostrożnie przenieść jak największą ilość fazy wodnej do nowej probówki 50 ml.
  12. Powtórzyć ekstrakcję, używając fenolu pH 8,0:chloroformu (1:1), a następnie wytrącić DNA za pomocą etanolu. (Szczegóły dotyczące oczyszczania DNA znajdują się w: 11
  13. Po odwirowaniu wytrąconego etanolowo DNA, każdy osad DNA rozpuścić w 450 μl 1x TE (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA). Przenieść mieszaninę DNA do probówki wirówkowej 1,7 ml.
  14. Kolejną rundę oczyszczania przeprowadza się poprzez dwukrotną ekstrakcję fenol:chloroformową. Dodać 500 μl fenolu pH 8,0:chloroformu (1:1) i wortexować przez 1 minutę. Wirować probówki przez 5 minut przy 14 000 rpm i przenieść fazę wodną do nowej probówki. Po drugiej ekstrakcji wytrącić DNA, dodając 0,1x objętości NaOAc oraz 2x objętości 100% etanolu, a następnie inkubować przez 30 minut w -80 °C.
  15. Po odwirowaniu wytrąconego DNA, każdy osad DNA przemyć 70% etanolem i resuspendować w 25 μl 1x TE. Zdegradować ewentualne obecne RNA, dodając 1 μl 1 mg/ml RNazy A do każdej probówki i inkubując przez 30 minut w 37°C. Połączyć zawartości probówek 2-5 z Hi-C, nadal zachowując probówkę 1 oddzielnie jako kontrolę 3C.
  16. Jest to odpowiedni moment na sprawdzenie wydajności znakowania i ligacji Hi-C. Te kontrole są doskonałymi wskaźnikami tego, czy biblioteka Hi-C zostanie pomyślnie utworzona.
    1. Aby sprawdzić jakość i ilość bibliotek, nażelować 2 μl i 6 μl alikwoty rozcieńczeń 1:10 z obu bibliotek (3C i Hi-C) na 0,8% żelu agarozowym. (Patrz Rycina 2A)
    2. Wydajność znakowania i ligacji Hi-C weryfikuje się za pomocą testu trawienia PCR. Pomyślne dopełnienie i ligacja miejsca HindIII (AAGCTT) tworzy miejsce dla enzymu restrykcyjnego NheI (GCTAGC). Konkretny produkt ligacji powstały z dwóch pobliskich fragmentów restrykcyjnych jest amplifikowany metodą PCR (podobnie jak w 3C 11), używając 0,2 μl każdej biblioteki jako matrycy. Produkty PCR są następnie trawione przez HindIII, NheI lub oba enzymy. Po rozdzieleniu próbek na 2% żelu, względną liczbę zdarzeń ligacyjnych 3C i Hi-C można oszacować poprzez kwantyfikację intensywności prążków przeciętych i nieprzeciętych (Patrz Rycina 2B).
  17. Niektóre fragmenty nie zostaną zligowane: aby uniknąć ich późniejszego wyodrębnienia, należy usunąć biotynę z tych niezligowanych końców, wykorzystując aktywność egzonukleazy polimerazy DNA T4.
    1. Biotyna-14-dCTP na niezligowanych końcach DNA jest usuwana dzięki aktywności egzonukleazy polimerazy DNA T4. Wymieszać 5 μg biblioteki Hi-C z 1 μl 10 mg/ml BSA, 10 μl 10x NEBuffer 2, 1 μl 10 mM dATP, 1 μl 10 mM dGTP i 5 jednostkami polimerazy DNA T4 w całkowitej objętości 100 μl i inkubować mieszaninę w 12°C przez 2 godziny. Jeśli to możliwe, należy przeprowadzić kilka reakcji dla 5 μg.
    2. Reakcję zatrzymuje się przez dodanie 2 μl 0,5 M EDTA pH 8,0.
    3. W celu oczyszczenia DNA przeprowadza się ekstrakcję fenolem pH 8,0:chloroformem (1:1), a następnie wytrącanie etanolowe.
    4. Nadfiltr zostaje odrzucony, a osady DNA są resuspendowane i łączone w całkowitej objętości 100 μl wody.

II. Ścinanie i selekcja rozmiaru

  1. Aby biotynilowany DNA nadawał się do sekwencjonowania wysokoprzepustowego, należy go poddać fragmentacji do rozmiaru 300-500 pz za pomocą urządzenia Covaris S2 (cykl pracy 5, intensywność 5, cykle/burst 200, czas 60 s przez 4 cykle).
  2. W celu naprawy końców pociętego DNA należy dodać 14 μl 10x buforu do ligacji, 14 μl mieszaniny dNTP 2,5 mM, 5 μl polimerazy DNA T4, 5 μl polinukleotydowej kinazy T4, 1 μl polimerazy DNA Klenow oraz 1 μl wody. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
  3. Po inkubacji DNA należy oczyścić za pomocą kolumny Qiagen MinElute zgodnie z zaleceniami producenta. DNA należy eluować dwukrotnie za pomocą 15 μl 1x Tris-Low-EDTA (TLE: 10 mM Tris pH 8.0, 0.1 mM EDTA). Następnie do końców 3' naprawionego DNA należy dołączyć dATP, dodając 5 μl 10x NEBuffer2, 10 μl 1 mM dATP, 2 μl wody oraz 3 μl Klenow (exo-). Reakcję inkubować przez 30 minut w temperaturze 37°C.
  4. Aby inaktywować fragment Klenow, reakcje należy inkubować przez 20 minut w temperaturze 65°C, a następnie schłodzić na lodzie. Za pomocą speedvacu należy zredukować objętość reakcji do 20 μl.
  5. Następnie DNA należy nałożyć na żel agarozowy 1,5% z 1X TAE i prowadzić elektroforezę przez 3,5 godziny przy napięciu 80-90V. Po zabarwieniu żelu SYBR green, DNA należy zwizualizować na urządzeniu DarkReader. Należy wyciąć fragmenty DNA o rozmiarze od 300 do 500 par zasad i oczyścić je za pomocą zestawu do ekstrakcji z żelu Qiagen, używając 2-4 kolumn w zależności od masy żelu. DNA należy eluować za pomocą 50 μl 1x TLE.
  6. Należy połączyć eluaty z kolumn Qiaquick i uzupełnić objętość końcową do 300 μl za pomocą 1x TLE. Na koniec należy oznaczyć stężenie DNA testem Quant-iT przy użyciu fluorometru QuBit i obliczyć całkowitą ilość DNA.

III. Wyciąganie z biotyną i sekwencjonowanie par końcowych

  1. W tej części protokołu miejsca ligacji są oczyszczane z puli DNA, co umożliwia efektywną identyfikację oddziałujących fragmentów chromatyny za pomocą sekwencjonowania typu paired-end. Wszystkie kolejne etapy należy przeprowadzać w probówkach DNA LoBind.
  2. Przygotować kuleczki do wyciągania biotyny (biotin pull-down), płucząc 150 μl resuspenderowanych magnetycznych kuleczek streptawidynowych dwukrotnie 400 μl buforem Tween (TB: 5 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.5 mM EDTA, 1 M NaCl, 0.05% Tween).
    Płukania te oraz kolejne etapy płukania składają się z pięciu kroków:
    1. Dodanie buforu do kuleczek
    2. Przeniesienie mieszaniny do nowej probówki
    3. Rotacja próbki przez 3 minuty w temperaturze pokojowej
    4. Odzyskanie kuleczek przy użyciu magnetycznego koncentratora cząsteczek
    5. Usunięcie nadsączu
  3. Resuspenderować kuleczki w 300 μl 2x buforze No Tween (2x NTB: 10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA, 2 M NaCl) i połączyć z 300 μl DNA Hi-C. Pozostawić oznakowane biotyną DNA Hi-C do związania z kuleczkami streptawidynowymi, inkubując mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 15 minut w rotacji.
  4. Odzyskać kuleczki streptawidynowe związane z DNA za pomocą magnetycznego koncentratora cząsteczek i usunąć nadsącz. Płukać kuleczki w 400 μl 1x NTB (5 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.5 mM EDTA, 1 M NaCl), a następnie w 100 μl 1x buforze ligacyjnym. Resuspenderować kuleczki w 50 μl 1x buforze ligacyjnym i przenieść mieszaninę do nowej probówki.
  5. Aby przygotować DNA do sekwencjonowania Illumina Paired End, należy wziąć całkowitą ilość DNA użytą jako materiał wyjściowy do wyciągania biotyny, obliczoną wcześniej w kroku 2.6, i podzielić ją przez 20, aby oszacować ilość DNA Hi-C, które zostało wyciągnięte i jest dostępne do ligacji. Dodać 6 pikomoli adapterów Illumina Paired End na μg DNA Hi-C dostępnego do ligacji. Użyć 1200 jednostek ligazy T4 DNA w celu ligacji adapterów z DNA. Inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
  6. Usunąć niezlany adaptery Paired End, odzyskując kuleczki związane z DNA Hi-C i płucząc je dwukrotnie 400 μl 1x TB.
  7. Płukać kuleczki 200 μl 1x NTB, a następnie 200 μl i 50 μl 1x NEBuffer 2. Po ostatnim płukaniu resuspenderować kuleczki w 50 μl 1x NEBuffer 2 i przenieść do nowej probówki.
  8. Aby określić liczbę cykli niezbędnych do wygenerowania wystarczającej ilości produktu PCR do sekwencjonowania, należy przygotować cztery testowe reakcje PCR z 6, 9, 12 lub 15 cyklami. (Szczegóły amplifikacji PCR znajdują się w sekcji: 12). Określić optymalną liczbę cykli, przeprowadzając reakcje PCR na 5% żelu poliakrylamidowym i barwiąc go Sybr Green, upewniając się, że nie występują prążki niespecyficzne, a między 400-600 parami zasad widoczna jest smuga, co odpowiada długości produktów ciętych po ligacji z adapterami.
  9. Amplifikować pozostałe kuleczki streptawidynowe związane z biblioteką Hi-C w wielkoskalowej reakcji PCR z optymalną liczbą cykli. Połączyć produkty PCR z oddzielnych dołków i odzyskać kuleczki. Zachować 1% produktu PCR z wielkoskalowej reakcji do analizy na żelu, a pozostałą część produktu PCR oczyścić za pomocą kuleczek Ampure w objętości 1.8x zgodnie z zaleceniami producenta.
  10. Eluować DNA w 50 μl 1x buforze TLE i porównać 1% produktu PCR oczyszczonego kuleczkami Ampure z 1% alikwotem oryginalnego produktu PCR na 5% żelu poliakrylamidowym, aby upewnić się, że startery PCR zostały pomyślnie usunięte.
    1. Zalecamy również klonowanie 1 μl biblioteki Hi-C i analizę produktów około 100 klonów za pomocą sekwencjonowania metodą Sangera. Pozwoli to ocenić względną liczbę odczytów Hi-C możliwych do zmapowania w mieszaninie PCR. Typowe wyniki przedstawiono na rysunku 3B.
  11. Zsekwencjonować bibliotekę Hi-C za pomocą sekwencjonowania Illumina paired end. Każdy koniec zmapować niezależnie przy użyciu Maq (http://maq.sourceforge.net/), aby zidentyfikować oddziałujące fragmenty chromatyny.

IV. Reprezentatywne wyniki Hi-C

  1. Poniższe wyniki są oczekiwane w przypadku poprawnego technicznie wykonania protokołu Hi-C i mogą być uznane za standardy kontroli jakości.
  2. Etapy kontroli jakości powinny wykazać, że biblioteki 3C i Hi-C tworzą dość wąskie prążki o wielkości powyżej 10 kb. Rozmycie DNA świadczy o niskiej wydajności ligacji. Zazwyczaj wydajność ligacji w bibliotece Hi-C jest nieco niższa w porównaniu z matrycą 3C (patrz Rycina 2A).
  3. Wydajność znakowania i ligacji w Hi-C można oszacować poprzez trawienie produktu PCR wygenerowanego przy użyciu starterów 3C. Połączenia 3C są cięte przez HindIII, a nie przez NheI. W przypadku połączeń Hi-C sytuacja jest odwrotna. Ten test trawienia PCR wykazuje, że 70% amplikonów Hi-C jest ciętych przez NheI, a nie przez HindIII, co potwierdza wydajne znakowanie miejsc ligacji (patrz Rycina 2B).
  4. Analiza zsekwencjonowanych odczytów powinna wykazać, że odczyty z oddziaływań wewnątrzchromosomalnych i międzychromosomalnych, zaznaczone niebieskimi i czerwonymi liniami, mapują się znacznie bliżej miejsc restrykcyjnych HindIII w porównaniu do losowo wygenerowanych odczytów, pokazanych na zielono (patrz Rycina 3A).
  5. W udanym eksperymencie 55% mapowalnych par odczytów reprezentuje oddziaływania międzychromosomalne. Piętnaście procent reprezentuje oddziaływania wewnątrzchromosomalne między fragmentami oddalonymi od siebie o mniej niż 20 kb, a 30% to pary odczytów wewnątrzchromosomalnych oddalonych o więcej niż 20 kb (patrz Rycina 3B). Rozkład ten można sprawdzić przed sekwencjonowaniem wysokoprzepustowym w ramach kontroli jakości; zazwyczaj wystarczające jest klonowanie i sekwencjonowanie metodą Sangera około 100 klonów.
  6. Oddziaływania chromatyny można zwizualizować w formie mapy ciepła (heatmap), gdzie osie x i y reprezentują loci w kolejności genomowej, a każdy piksel reprezentuje liczbę zaobserwowanych oddziaływań między nimi. Typowo fragmenty DNA, które znajdują się bardzo blisko siebie w liniowym genomie, wykazują tendencję do częstych oddziaływań między sobą. W mapach ciepła wewnątrzchromosomalnych przejawia się to jako wyraźna przekątna (patrz Rycina 4A).
  7. Poniższe wyniki przedstawiają różne sposoby analizy danych w celu ujawnienia różnych poziomów organizacji genomu. Wykres prawdopodobieństwa kontaktu w funkcji odległości genomowej (patrz Rycina 5A) pokazuje, że prawdopodobieństwo kontaktu maleje wraz z odległością genomową, aż do osiągnięcia plateau. Przy każdej odległości oddziaływania wewnątrzchromosomalne, pokazane linią ciągłą, są wzbogacone w stosunku do oddziaływań międzychromosomalnych, reprezentowanych przez linie przerywane. Wprost wskazuje to na obecność terytoriów chromosomowych.
  8. Obliczenie stosunku zaobserwowanej do oczekiwanej liczby kontaktów międzychromosomalnych między wszystkimi parami chromosomów ujawnia preferencyjne asocjacje między konkretnymi parami chromosomów. Małe, bogate w geny chromosomy oddziałują preferencyjnie ze sobą, co jest zaznaczone jasnoczerwonym kolorem (patrz Rycina 5B).
  9. Można również analizować poszczególne chromosomy. Surową mapę ciepła można skorygować za pomocą oczekiwanej mapy ciepła, aby uwzględnić odległość genomową między parami loci, co daje mapę ciepła wartości zaobserwowanej/oczekiwanej. Następnie można stworzyć macierz korelacji poprzez korelację wierszy i kolumn map ciepła zaobserwowanej/oczekiwanej. Analiza korelacji wykazuje, że genom ludzki dzieli się na dwa kompartmenty. Jest to zilustrowane wzorem w kratkę na mapach korelacji ciepła (patrz Rycina 4A-D). (Szczegóły analizy danych Hi-C znajdują się w: 1).
  10. Dzięki danym Hi-C uzyskano nową wiedzę na temat zwijania się chromatyny w skali megabaz. Klasyczny model kondensacji polimerów sugeruje, że chromatyna upakowuje się w globulę równowagową. Wykres prawdopodobieństwa kontaktu jako funkcji odległości ilustruje, że prawdopodobieństwo kontaktu skaluje się zgodnie z prawem potęgowym względem odległości genomowej, którego nachylenie wynosi około -1 (patrz Rycina 6A). Nie jest to zgodne z zachowaniem globuli równowagowej, ale odpowiada oczekiwaniom dla alternatywnej struktury znanej jako globula fraktalna (patrz Rycina 6B).
  11. Tutaj pokazano dwie struktury globularne. Kolorystyka odpowiada odległości od jednego z końców, przechodząc od niebieskiego przez cyjan, zielony, żółty, pomarańczowy aż do czerwonego (patrz Rycina 6C góra). W przeciwieństwie do globul równowagowych, globule fraktalne nie posiadają splątań. W globuli fraktalnej loci znajdujące się blisko siebie wzdłuż konturu mają tendencję do bycia blisko siebie w przestrzeni 3D, co prowadzi do powstawania bloków monochromatycznych (patrz Rycina 6C środek). Takich bloków nie stwierdza się w globuli równowagowej (patrz Rycina 6C dół).

Schemat edycji genu DNA; proces enzymu restrykcyjnego; analiza sekwencji; metoda znakowania biotyną.
Rysunek 1. Przegląd metody Hi-C. Komórki poddawane są sieciowaniu formaldehydem, co prowadzi do powstania wiązań kowalencyjnych między przestrzennie sąsiadującymi segmentami chromatyny (fragmenty DNA: ciemnoniebieskie, czerwone; białka, które mogą pośredniczyć w takich oddziaływaniach, przedstawiono w kolorze jasnoniebieskim i cyjanowym). Chromatynę trawi się enzymem restrykcyjnym (tutaj HindIII; miejsce restrykcyjne: linia przerywana, patrz wstawka). Powstałe lepkie końce są wypełniane nukleotydami, z których jeden jest biotynilowany (fioletowa kropka). Ligację przeprowadza się w warunkach ekstremalnego rozcieńczenia, co sprzyja wewnątrzmolekularnym zdarzeniom ligacyjnym; miejsce HindIII zostaje utracone, a utworzone zostaje miejsce NheI (wstawka). DNA jest oczyszczane i fragmentowane, a następnie zbiory biotynilowanych złączy są izolowane za pomocą kulek z streptawidyną. Oddziałujące fragmenty są identyfikowane poprzez sekwencjonowanie typu paired-end.

Elektroforeza w żelu agarozowym porównująca trawienie DNA w metodach 3C i Hi-C z użyciem enzymów HindIII i NheI.
Rysunek 2. Kontrole jakości biblioteki Hi-C. (A) Rosnące ilości kontroli 3C oraz biblioteki Hi-C rozdzielono w 0,8% żelu agarozowym. Obie biblioteki migrują jako dość wąski prążek większy niż 10 kb. Typowa wydajność ligacji w bibliotece Hi-C jest nieco niższa niż w matrycy 3C, co objawia się rozmyciem (smear) w ścieżkach Hi-C. (B) Kontrola trawienia PCR. Złącze ligacyjne utworzone przez dwa sąsiednie fragmenty jest amplifikowane przy użyciu standardowych warunków PCR dla 3C. Produkty ligacji Hi-C można odróżnić od produktów otrzymanych w konwencjonalnym 3C poprzez trawienie miejsca ligacji. Złącza Hi-C są cięte przez NheI, a nie przez HindIII; w przypadku złączy 3C sytuacja jest odwrotna. 70% amplikonów Hi-C zostało przeciętych przez NheI, co potwierdza wydajne znakowanie złącza ligacyjnego. W celu zapewnienia wiarygodnej kwantyfikacji przeprowadzono dwa powtórzenia.

Analiza danych Hi-C; Wykres liniowy i wykres słupkowy; Porównanie rozkładu odczytów; Badanie genomiczne.
Rycina 3. Kontrola jakości odczytów Hi-C. (A) Odczyty z fragmentów odpowiadających zarówno oddziaływaniom wewnątrzchromosomalnym (niebieski), jak i międzychromosomalnym (czerwony) mapują się znacznie bliżej miejsc restrykcyjnych HindIII w porównaniu do odczytów wygenerowanych losowo (zielony). Krzywe dla odczytów wewnątrzchromosomalnych oraz międzychromosomalnych gwałtownie opadają wraz ze wzrostem odległości od miejsca HindIII, aż do osiągnięcia plateau na dystansie ~500 bp. Odpowiada to maksymalnej wielkości fragmentu użytego do sekwencjonowania. (B) Typowo 55% mapowalnych par odczytów reprezentuje oddziaływania międzychromosomalne. Piętnaście procent reprezentuje oddziaływania wewnątrzchromosomalne między fragmentami oddalonymi od siebie o mniej niż 20 kb, a 30% to pary odczytów wewnątrzchromosomalnych oddalonych o więcej niż 20 kb. Rozkład ten można zbadać przed sekwencjonowaniem wysokoprzepustowym w ramach kontroli jakości; zazwyczaj wystarczające jest klonowanie i sekwencjonowanie metodą Sangera około 100 klonów.

Analiza oddziaływań chromosomu 14 z mapami ciepła wartości obserwowanych, oczekiwanych, stosunków oraz korelacji Pearsona.
Rycina 4. Analiza korelacji wykazuje, że jądro komórkowe jest podzielone na dwa przedziały. (A) Mapa ciepła odpowiadająca oddziaływaniom wewnątrzchromosomalnym na chromosomie 14. Każdy piksel reprezentuje wszystkie oddziaływania między locus o wielkości 1 Mb a innym locus o wielkości 1 Mb; intensywność odpowiada całkowitej liczbie odczytów (zakres: 0-200 odczytów). Znaczniki pojawiają się co 10 Mb. Mapa ciepła wykazuje podstrukturę w postaci intensywnej przekątnej i konstelacji dużych bloków. (Chromosom 14 jest akrocentryczny; ramię krótkie nie jest pokazane). Wykorzystując zestaw danych Hi-C do obliczenia średniego prawdopodobieństwa kontaktu dla pary loci w określonej odległości genomowej, utworzono macierz oczekiwań (B), odpowiadającą temu, co zaobserwowano by przy braku struktur dalekiego zasięgu. Iloraz tych dwóch macierzy stanowi macierz obserwowanych/oczekiwanych wartości (C), w której deficyt zaznaczono kolorem niebieskim, a wzbogacenie kolorem czerwonym [zakres: 0,2 (niebieski) do 5 (czerwony)]. Wzór blokowy staje się bardziej wyraźny. Macierz korelacji (D) ilustruje korelację [zakres: -1 (niebieski) do 1 (czerwony)] między profilami oddziaływań wewnątrzchromosomalnych dla każdej pary loci wzdłuż chromosomu 14. Wyrazisty wzór w kratkę wskazuje na obecność dwóch przedziałów w obrębie chromosomu.

Wykresy prawdopodobieństwa kontaktu; wewnątrzchromosomalne vs. międzychromosomalne; macierz interakcji chromosomów ludzkich.
Rysunek 5. Obecność i organizacja terytoriów chromosomowych. (A) Prawdopodobieństwo kontaktu maleje w funkcji odległości genomowej na chromosomie 1, osiągając ostatecznie plateau przy ~90Mb (kolor niebieski). Poziom kontaktów międzychromosomalnych (czarne kreski) różni się dla różnych par chromosomów; loci na chromosomie 1 najczęściej oddziałują z loci na chromosomie 10 (zielone kreski), a najrzadziej z loci na chromosomie 21 (czerwone kreski). Interakcje międzychromosomalne są uboższe w porównaniu do interakcji wewnątrzchromosomalnych. (B) Obserwowana/oczekiwana liczba kontaktów międzychromosomalnych pomiędzy wszystkimi parami chromosomów. Kolor czerwony oznacza wzbogacenie, a niebieski ubożenie [zakres: 0,5 (niebieski) do 2 (czerwony)]. Małe, bogate w geny chromosomy mają tendencję do częstszych wzajemnych interakcji.

Fałdowanie polimeru; wykres log-log; prawdopodobieństwo kontaktu w funkcji odległości; modele fraktalne i równowagowe.
Rysunek 6. Lokalne upakowanie chromatyny jest zgodne z zachowaniem globularu fraktalnego. (A) Prawdopodobieństwo kontaktu jako funkcja odległości genomicznej, uśrednione dla całego genomu (kolor niebieski). Wyraźne skalowanie potęgowe widoczne jest między 500kb a 7Mb (obszar zacieniowany) z nachyleniem wynoszącym -1,08 (dopasowanie pokazane na kolor niebieski/cyjan). (B) Wyniki symulacji dla prawdopodobieństwa kontaktu w funkcji odległości dla globularów równowagowych (kolor czerwony) i fraktalnych (kolor niebieski). Nachylenie dla globularu fraktalnego wynosi niemal -1 (kolor niebieski/cyjan), co potwierdza naszą nową prognozę teoretyczną 1. Nachylenie dla globularu równowagowego wynosi -3/2, co jest zgodne z wcześniejszymi oczekiwaniami teoretycznymi. Nachylenie dla globularu fraktalnego ściśle przypomina nachylenie zaobserwowane w wynikach Hi-C, podczas gdy nachylenie dla globularu równowagowego nie występuje w danych Hi-C. (C) Góra: Rozfałdowany łańcuch polimerowy o długości 4000 monomerów. Kolorystyka odpowiada odległości od jednego końca, przechodząc od niebieskiego, przez cyjan, zielony, żółty, pomarańczowy, aż do czerwonego. Środek: Typowy przykład globularu fraktalnego wybranego z naszego zespołu. Globulary fraktalne nie posiadają splotów. Loci znajdujące się blisko siebie wzdłuż konturu mają tendencję do bycia blisko siebie w 3D, co prowadzi do obecności dużych monochromatycznych bloków widocznych na powierzchni i w przekroju. Dół: Globular równowagowy. Struktura jest silnie splątana; loci znajdujące się blisko siebie wzdłuż konturu (podobny kolor) nie muszą znajdować się blisko siebie w 3D.

Dyskusja

Przedstawiamy metodę badania trójwymiarowej architektury genomu poprzez mapowanie oddziaływań chromatyny w sposób bezstronny i w skali całego genomu. Najbardziej krytycznym krokiem eksperymentalnym – który odróżnia tę technologię od wcześniejszych prac – jest wbudowanie nukleotydów znakowanych biotyną na końcach restrykcyjnych fragmentów po sieciowaniu, przed ligacją końców tępych. Pomyślne wykonanie tego kroku umożliwia głębokie sekwencjonowanie wszystkich miejsc ligacji, co nadaje metodzie Hi-C jej zakres i precyzję.

Liczba odczytów ostatecznie determinuje rozdzielczość map interakcji. W tym przypadku przedstawiono mapę interakcji ludzkiego genomu o rozdzielczości 1 Mb, wykorzystując ~30 milionów odczytów możliwych do dopasowania. Aby zwiększyć ogólną rozdzielczość o współczynnik n, liczbę odczytów należy zwiększyć o współczynnik n2.

Technikę Hi-C można łatwo łączyć z innymi metodami, takimi jak hybrydyzacyjnay wychwyt po generowaniu biblioteki (w celu ukierunkowania na konkretne fragmenty genomu) oraz immunoprecypitacja chromatyny po ligacji (w celu zbadania środowiska chromatyny w regionach związanych ze specyficznymi białkami).

Oświadczenia

Wniosek o patent tymczasowy na metodę Hi-C (nr 61/100,151) jest w trakcie rozpatrywania.

Podziękowania

Dziękujemy A. Kosmrlj za dyskusje i kod; A. P. Aiden, X. R. Bao, M. Brenner, D. Galas, W. Gosper, A. Jaffer, A. Melnikov, A. Miele, G. Giannoukos, C. Nusbaum, A. J. M. Walhout, L. Wood oraz K. Zeldovich za dyskusje; a L. Gaffney i B. Wong za pomoc w wizualizacji.

Wsparcie finansowe zapewnili: Fannie and John Hertz Foundation (stypendium dla doktorantów), National Defense Science and Engineering (stypendium dla doktorantów), NSF (stypendium dla doktorantów), National Space Biomedical Research Institute oraz National Human Genome Research Institute (NHGRI) w ramach grantu nr T32 HG002295 (E.L.); i2b2 (Informatics for Integrating Biology and the Bedside), finansowany przez NIH Center for Biomedical Computing w Brigham and Women s Hospital (L.A.M.); NHGRI w ramach grantu nr HG003143 oraz Keck Foundation (wyróżnienie dla wybitnych młodych naukowców) (J.D.). Surowe i zmapowane dane z sekwencjonowania Hi-C zostały zdeponowane w bazie danych GEO (www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/), numer dostępu GSE18199. Dodatkowe wizualizacje są dostępne pod adresem http://hic.umassmed.edu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Inhibitory proteazSigma-AldrichP8340-5mlKrok 1.2
biotyna-14-dCTPInvitrogen19518-018Krok 1.6
KlenowNew England BiolabsM0210Kroki 1.6 i 2.2
T4 DNA ligazaInvitrogen15224Krok 1.9
T4 DNA polimerazaNew England BiolabsM0203Kroki 1.17 i 2.2
10x bufor ligacyjnyNew England BiolabsB0202Kroki 2.2 i 3.4
T4 PNKNew England BiolabsM0201Krok 2.2
Klenow (exo-)New England BiolabsM0212Krok 2.3
Kule Dynabeads MyOne Streptavin C1Invitrogen650.01Krok 3.2
T4 DNA ligaza HCEnzymaticsL603-HC-LKrok 3.5
Phusion HF mastermixNew England BiolabsF531Krok 3.8
Kule AmpureBeckman Coulter Inc.A2915Krok 3.9

Bibliografia

  1. Lieberman-Aiden, E., Van Berkum, N. L., Williams, L., Imakaev, M., Ragoczy, T., Telling, A., Amit, I., Lajoie, B. R., Sabo, P. J., Dorschner, M. O., Sandstrom, R., Bernstein, B., Bender, M. A., Groudine, M., Gnirke, A., Stamatoyannopoulos, J., Mirny, L. A., Lander, E. S., Dekker, J. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science. 326, 289-293 (2009).
  2. Kosak, S. T., Groudine, M. Form follows function: the genomic organization of cellular differentiation. Genes and Dev. 18, 1371-1384 (2004).
  3. Misteli, T. Beyond the sequence: cellular organization of genome function. Cell. 128, 787-800 (2007).
  4. Dekker, J. Gene Regulation in the Third Dimension. Science. 319, 1793-1794 (2008).
  5. Cremer, T., Cremer, C. Chromosome territories, nuclear architecture and gene regulation in mammalian cells. Nat Rev Genet. 2, 292-301 (2001).
  6. Sexton, T., Schober, H., Fraser, P., Gasser, S. M. Gene regulation through nuclear organization. Nat Struct and Mol Biol. 14, 1049-1055 (2007).
  7. Dekker, J., Rippe, K., Dekker, M., Kleckner, N. Capturing Chromosome Conformation. Science. 295, 1306-1311 (2002).
  8. Zhao, Z., Tavoosidana, G., Sjölinder, M., Göndör, A., Mariano, P., Wang, S., Kanduri, C., Lezcano, M., Sandhu, K. S., Singh, U., Pant, V., Tiwari, V., Kurukuti, S., Ohlsson, R. Circular chromosome conformation capture (4C) uncovers extensive networks of epigenetically regulated intra- and interchromosomal interactions. Nat Genet. 38, 1341-1347 (2006).
  9. Simonis, M., Klous, P., Splinter, E., Moshkin, Y., Willemsen, R., de Wit, E., van Steensel, B., de Laat, W. Nuclear organization of active and inactive chromatin domains uncovered by chromosome conformation capture-on-chip (4C) uncovers extensive networks of epigenetically regulated intra- and interchromosomal interactions. Nat Genet. 38, 1348-1354 (2006).
  10. Dostie, J., Richmond, T. A., Arnaout, R. A., Selzer, R. R., Lee, W. L., Honan, T. A., Rubio, E. D., Krumm, A., Lamb, J., Nusbaum, C., Green, R. D., Dekker, J. Chromosome Conformation Capture Carbon Copy (5C): A massively parallel solution for mapping interactions between genomic elements. Genome Res. 16, 1299-1309 (2006).
  11. Miele, A., Dekker, J. Mapping Cis- and Trans Chromatin Interaction Networks Using Chromosome Conformation Capture (3C). Methods Mol Biol. 464, 105-121 (2009).
  12. Maccallum, I., Przybylski, D., Gnerre, S., Burton, J., Shlyakhter, I., Gnirke, A., Malek, J., McKernan, K., Ranade, S., Shea, T. P., Williams, L., Young, S., Nusbaum, C., Jaffe, D. B. ALLPATHS 2: small genomes assembled accurately and with high continuity from short paired reads. Genome Biol . 10, R103-R103 (2009).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Metoda Hi Cwychwyt konformacji chromosom winterakcje w obr bie ca ego genomutrawienie enzymami restrykcyjnymiwbudowywanie reszt biotynylowanychligacja ko c w t pychoczyszczanie na kulkach z streptawidynsekwencjonowanie wysokoprzepustoweanaliza macierzy kontakt wkonformacja fraktalnego globulki
Hi-C: Metoda badania trójwymiarowej architektury genomów.
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.