Wykorzystanie automatycznego licznika komórek w celu uproszczenia badań nad ekspresją genów: wyciszenie siRNA ekspresji genów zależnych od IL-4 w komórkach Namalwa

Podsumowanie

Niniejsza procedura opisuje szybki i prosty schemat postępowania w celu wprowadzenia siRNA do linii komórkowych trudnych do transfekcji oraz monitorowania ekspresji genów za pomocą real-time PCR. Zastosowanie automatycznego licznika komórek, wielodołkowej płyty do elektroporacji oraz automatycznej stacji elektroforezy pozwala na uzyskanie szybkich i wiarygodnych wyników bez konieczności stosowania kosztownych systemów robotycznych.

Streszczenie

Wykorzystanie wyciszania genów za pomocą siRNA pozostaje istotnym narzędziem w badaniach nad ekspresją genów. Badania z wykorzystaniem siRNA prowadzi się nie tylko w celu analizy efektów obniżenia ekspresji pojedynczych genów, ale także w celu badania szlaków sygnalizacyjnych i innych złożonych sieci oddziaływań. Analizy szlaków wymagają zarówno zastosowania odpowiednich modeli komórkowych, jak i metod powodujących mniejsze zaburzenia fizjologii komórki. Elektroporacja jest coraz częściej stosowana jako skuteczny sposób wprowadzania siRNA oraz innych kwasów nukleinowych do trudnych do transfekcji linii komórkowych i komórek pierwotnych, bez zmieniania badanego szlaku sygnalizacyjnego. Pomyślny eksperyment z siRNA składa się z wielu krytycznych etapów, a na kilku z nich istnieją sposoby na uproszczenie pracy przy jednoczesnej poprawie jakości danych. Aby pomóc w rozpoczęciu projektu wyciszania genów za pomocą siRNA, zaprezentujemy, jak przeprowadzić badanie szlaku – od zbierania i zliczania komórek przed elektroporacją, aż po analizę ekspresji genów metodą real-time PCR po transfekcji. W poniższym badaniu analizowana jest rola aktywatora transkrypcyjnego STAT6 w zależnej od IL-4 ekspresji genu CCL17 w linii komórkowej chłoniaka Burkitta (Namalwa). Zaprezentowane techniki są użyteczne w szerokim zakresie eksperymentów opartych na siRNA, zarówno w przypadku komórek adherentnych, jak i zawiesinowych. Pokażemy również, jak usprawnić zliczanie komórek za pomocą automatycznego licznika komórek TC10, jak przeprowadzić jednoczesną elektroporację wielu próbek przy użyciu systemu elektroporacji MXcell oraz jak równocześnie ocenić jakość i ilość RNA za pomocą automatycznego systemu elektroforezy Experion.

Protokół

1. Przygotowanie i liczenie komórek Namalwa

1. Wyjąć komórki z kolby hodowlanej i odwirować je w celu utworzenia osadu. Usunąć supernatant i resuspendować komórki w znanej objętości PBS. Komórki użyte w tym protokole to komórki w zawiesinie. W przypadku użycia komórek adherentnych konieczne jest przeprowadzenie trypsynizacji przed ich zebraniem.
2. Aby określić liczbę żywych komórek, zabarwić alikwot zawiesiny komórkowej, mieszając go w stosunku 1:1 z 0,4% roztworem błękitu trypanu, a następnie nanieść 10 μl mieszaniny na preparat do liczenia i włożyć go do automatycznego licznika komórek TC10 (Bio-Rad Laboratories, Inc).
3. Licznik komórek TC10 przeprowadzi autofocus w celu zapewnienia najdokładniejszego przeliczenia, a następnie przystąpi do liczenia. Urządzenie automatycznie określa gęstość żywych komórek oraz całkowitą liczbę komórek w próbce.
4. Wybrać opcję podglądu obrazu, aby wyświetlić komórki na ekranie. Następnie wybrać kalkulator rozcieńczeń, aby licznik TC10 automatycznie obliczył wymaganą objętość mieszaniny komórkowej.
5. W tym eksperymencie wykorzystuje się łącznie trzy siRNA: jedno kontrolne siRNA oraz dwa różne siRNA celujące w gen STAT6, plus kontrole nietransfekowane. Wymaga to 3,6 ml przy końcowej koncentracji 5 X 10⁶ komórek na ml.
6. Wprowadzić pożądane wartości koncentracji i objętości końcowej do kalkulatora rozcieńczeń, który obliczy objętość zawiesiny komórkowej niezbędną na podstawie liczby żywych komórek w danej próbce. Alternatywnie można wykonać obliczenia ręcznie. Następnie przenieść wymaganą objętość mieszaniny komórkowej do nowej probówki.
7. Odwirować mieszaniny komórkowe do uzyskania osadu i usunąć cały PBS. Resuspendować w 3,6 ml buforu do elektroporacji Gene Pulser (Bio-Rad Laboratories). Przenieść alikwoty o objętości 800 μl do probówek zawierających odpowiednie siRNA i delikatnie wymieszać. Komórki są teraz gotowe do elektroporacji.

2. Elektroporacja komórek w płytkach 96-dołkowych

1. Płyta do elektroporacji z 96 studniami umożliwia jednoczesną elektroporację powtórzeń dla wszystkich czterech wariantów traktowania.
2. Przenieś 150 μl zawiesiny komórkowej do odpowiednich studni płyty do elektroporacji z 96 studniami.
3. Włóż płytę do komory urządzenia MXcell do elektroporacji i zamknij pokrywę.
4. Przeprowadź elektroporację, stosując ustawienia zoptymalizowane dla danej linii komórkowej i używanego buforu. Komórki te poddawano elektroporacji z użyciem fali o wykładniczym spadku przy parametrach urządzenia: 250 V, 350 μF i oporności 1000 Ω.
5. Po zakończeniu elektroporacji delikatnie pipetuj zawartość każdej studni w górę i w dół w celu wymieszania, a następnie przenieś komórki na płytkę do hodowli tkankowej zawierającą uprzednio ogrzaną pożywkę. Komórki Namalwa hodowano w pożywce RPMI (Life Technologies) uzupełnionej o 7,5% FCS i 1% piwianu.
6. Próbki kontrolne, które nie zostały poddane elektroporacji, pobiera się z pozostałej zawiesiny komórkowej i dodaje do naczyń hodowlanych z uprzednio ogrzaną pożywką w sposób identyczny jak w przypadku komórek elektroporowanych.
7. Inkubuj komórki przez noc w temperaturze 37°C w atmosferze 5% CO₂.
8. Po 24 h jedną grupę komórek indukowano rekombinacyjną IL-4 (R&D Systems) w końcowym stężeniu 10 ng/ml. Druga grupa komórek kontrolnych otrzymała jedynie dodatkową pożywkę. Wszystkie komórki inkubowano przez kolejne 24 h w temperaturze 37°C i 5% CO₂.

3. Izolacja i kontrola RNA

1. Po całkowitym czasie wzrostu wynoszącym 48 hr, należy policzyć komórki w każdej studni, a następnie przenieść jedną porcję z każdej studni do probówki do mikrocentryfugi w celu ekstrakcji RNA oraz zamrozić drugą porcję do western blottingu lub innej analizy białek.
2. Próbki należy odwirować, abyt utworzyć pellet komórkowy, a następnie usunąć i wylać nadsącz z każdej probówki.
3. Następnie należy przystąpić do ekstrakcji RNA. Zazwyczaj stosujemy zestaw Aurum total RNA (Bio-Rad) zgodnie z załączonym protokołem.
4. Podczas monitorowania wyciszania genów za pomocą siRNA szczególnie ważne jest zweryfikowanie jakości RNA, ponieważ zdegradowane RNA doprowadzi do błędnych wyników. Stosunek 260/280 nie wskazuje na integralność RNA, dlatego istotne jest przeprowadzenie analizy próbek na żelu lub urządzeniu mikroprzepływowym, aby potwierdzić, że RNA nie uległo degradacji.
5. Aby ocenić jakość i ilość w jednym kroku, próbki te zostaną przeanalizowane przy użyciu zautomatyzowanego systemu elektroforetycznego Experion (Bio-Rad).
6. Najpierw należy podgrzać próbki. Następnie przygotować, nałożyć próbki i wymieszać na wirówce chip RNA Experion. Włożyć chip do stacji elektroforetycznej Experion i uruchomić analizę.
7. Po zakończeniu analizy oprogramowanie Experion automatycznie wyświetli wyniki w formie elektroferogramu, tabeli wyników (zawierającej stężenie RNA, stosunek rybosomalny oraz wskaźnik jakości RNA RQI) oraz wirtualnego żelu (który wygląda podobnie do tradycyjnego żelu RNA). Próbki całkowitego RNA wysokiej jakości zazwyczaj mają RQI w zakresie 8-10.

4. PCR w czasie rzeczywistym

1. Po zweryfikowaniu jakości RNA należy przystąpić do reakcji cDNA. W tym eksperymencie zastosowano mieszankę iScript one-step RT-PCR mix (Bio-Rad), aby połączyć syntezę cDNA i real-time PCR w jednej reakcji.
2. Należy przygotować master mix zawierający wszystkie komponenty reakcji z wyjątkiem matryc RNA dla każdego zestawu starterów, a następnie rozdzielić go do płytki PCR.
3. Po rozcieńczeniu RNA do jednolitego stężenia, należy dodać próbki RNA do odpowiednich dołków. Każdą reakcję wykonuje się w trzech powtórzeniach.
4. Płytkę należy szczelnie zamknąć i umieścić w systemie real-time PCR CFX384 (Bio-Rad). Następnie należy wybrać odpowiedni protokół i rozpocząć pomiar.
5. Po zakończeniu pomiaru poziom ekspresji genów określa się poprzez porównanie ekspresji genu badanego, znormalizowanej względem genu referencyjnego w komórkach elektroporowanych eksperymentalnym siRNA, z analogową normalizacją w komórkach elektroporowanych kontrolnym siRNA.

5. Analiza wyciszenia siRNA

1. Ekspresję CCL17 monitorowano za pomocą ilościowej analizy PCR w czasie rzeczywistym, aby zbadać rolę aktywatora transkrypcyjnego STAT6 w indukcji CCL17 zależnej od IL-4. W tym eksperymencie jako gen referencyjny wykorzystano GAPDH. W analogiczny sposób można zastosować inne geny referencyjne lub zestaw wielu genów referencyjnych.
2. Oprogramowanie CFX Manager automatycznie znormalizowało ekspresję CCL17 względem ekspresji genu referencyjnego z tej samej próbki i automatycznie porównało wynikowe wartości znormalizowane z grupami kontrolnymi poprzez proste wybranie GAPDH jako „reference” oraz grupy kontrolnej (kontrolne siRNA bez indukcji IL-4) jako „control” w oknie ustawień eksperymentu oprogramowania CFX Manager.
3. Bez indukcji IL-4 transkrypcja CCL17 pozostała na niskim, konstytutywnym poziomie, porównywalnym z grupą kontrolną.
4. Komórki indukowane IL-4 z zachowaną prawidłową ścieżką sygnałową STAT6 (tj. grupy kontrolne siRNA lub komórki nieprzetransfekowane) wykazały 8-10 krotny wzrost ekspresji CCL17.
5. Komórki indukowane IL-4, w których ekspresja STAT6 została zahamowana poprzez wprowadzenie siRNA przeciwko STAT6, wykazały jedynie około 2-krotnie wyższą ekspresję CCL17 niż komórki nieindukowane, co potwierdza rolę STAT6 w indukcji ekspresji CCL17 przez IL-4.

6. Reprezentatywne wyniki

Rysunek 1. Przegląd szlaku sygnalizacyjnego IL-4.
A) Wiązanie IL-4 do swojego receptora prowadzi do dimeryzacji i aktywacji STAT6. Aktywowany STAT6 przemieszcza się do jądra komórkowego i aktywuje transkrypcję genów docelowych, takich jak CCL17.
B) Bez indukcji IL-4 transkrypcja CCL17 pozostanie na niskim, konstytutywnym poziomie.
C) Po wyciszeniu genu STAT6 za pomocą siRNA, podanie IL-4 powinno prowadzić do niewielkiego lub żadnego wzrostu ekspresji CCL17.

Rysunek 2. Indukcja CCL17 przez IL4 mierzona w różnych warunkach za pomocą ilościowej PCR w czasie rzeczywistym.
A) Próbki hodowane bez IL-4 wykazywały niski konstytutywny poziom ekspresji, niezależnie od ekspresji genów.
B) Jak pokazano na kolor zielony i niebieski, próbki kontrolne zareagowały prawidłowo na leczenie IL-4, wykazując 8-10 krotny wzrost indukcji CCL17. Jednakże komórki przetransfekowane siRNA skierowanymi przeciwko STAT6, pokazane na kolor czerwony i różowy, wykazały zmniejszoną ekspresję CCL17 w odpowiedzi na IL-4, co potwierdza tezę, że STAT6 odgrywa rolę w indukowanej przez IL-4 ekspresji CCL17.

Dyskusja

W niniejszym artykule zaprezentowano sposób elektroporacji siRNA do trudnej do transfekcji linii komórkowej w zawiesinie oraz metodę monitorowania ekspresji genów w tych komórkach. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby dążyć do maksymalnej spójności warunków dla wszystkich próbek.