Wykorzystanie automatycznego licznika komórek w celu uproszczenia badań nad ekspresją genów: wyciszenie siRNA ekspresji genów zależnych od IL-4 w komórkach Namalwa

Podsumowanie

Niniejsza procedura opisuje szybki i prosty schemat postępowania w celu wprowadzenia siRNA do linii komórkowych trudnych do transfekcji oraz monitorowania ekspresji genów za pomocą real-time PCR. Zastosowanie automatycznego licznika komórek, wielodołkowej płyty do elektroporacji oraz automatycznej stacji elektroforezy pozwala na uzyskanie szybkich i wiarygodnych wyników bez konieczności stosowania kosztownych systemów robotycznych.

Streszczenie

Wykorzystanie wyciszania genów za pomocą siRNA pozostaje istotnym narzędziem w badaniach nad ekspresją genów. Badania z wykorzystaniem siRNA prowadzi się nie tylko w celu analizy efektów obniżenia ekspresji pojedynczych genów, ale także w celu badania szlaków sygnalizacyjnych i innych złożonych sieci oddziaływań. Analizy szlaków wymagają zarówno zastosowania odpowiednich modeli komórkowych, jak i metod powodujących mniejsze zaburzenia fizjologii komórki. Elektroporacja jest coraz częściej stosowana jako skuteczny sposób wprowadzania siRNA oraz innych kwasów nukleinowych do trudnych do transfekcji linii komórkowych i komórek pierwotnych, bez zmieniania badanego szlaku sygnalizacyjnego. Pomyślny eksperyment z siRNA składa się z wielu krytycznych etapów, a na kilku z nich istnieją sposoby na uproszczenie pracy przy jednoczesnej poprawie jakości danych. Aby pomóc w rozpoczęciu projektu wyciszania genów za pomocą siRNA, zaprezentujemy, jak przeprowadzić badanie szlaku – od zbierania i zliczania komórek przed elektroporacją, aż po analizę ekspresji genów metodą real-time PCR po transfekcji. W poniższym badaniu analizowana jest rola aktywatora transkrypcyjnego STAT6 w zależnej od IL-4 ekspresji genu CCL17 w linii komórkowej chłoniaka Burkitta (Namalwa). Zaprezentowane techniki są użyteczne w szerokim zakresie eksperymentów opartych na siRNA, zarówno w przypadku komórek adherentnych, jak i zawiesinowych. Pokażemy również, jak usprawnić zliczanie komórek za pomocą automatycznego licznika komórek TC10, jak przeprowadzić jednoczesną elektroporację wielu próbek przy użyciu systemu elektroporacji MXcell oraz jak równocześnie ocenić jakość i ilość RNA za pomocą automatycznego systemu elektroforezy Experion.

Protokół

1. Przygotowanie i liczenie komórek Namalwa

1. Usunąć komórki z kolby hodowlanej i odwirować je w celu uzyskania osadu. Odlać nadsącz i resuspendować komórki w znanej objętości PBS. Komórki użyte w tym protokole to komórki w zawiesinie. W przypadku stosowania komórek przylegających konieczna jest trypsynizacja przed zbieraniem.
2. Aby określić liczbę żywych komórek, zabarwić alikwot zawiesiny komórkowej, mieszając go w stosunku 1:1 z 0,4% roztworem błękitu trypanu, a następnie nanieść 10 μl mieszaniny na preparat do liczenia i włożyć go do automatycznego licznika komórek TC10 (Bio-Rad Laboratories, Inc).
3. Licznik komórek TC10 przeprowadzi automatyczne ustawienie ostrości, aby zapewnić jak najdokładniejszy pomiar, a następnie przystąpi do liczenia. Urządzenie automatycznie określa gęstość żywych komórek oraz całkowitą liczbę komórek w próbce.
4. Wybrać opcję podglądu obrazu, aby wyświetlić komórki na ekranie. Następnie wybrać kalkulator rozcieńczeń, aby licznik komórek TC10 automatycznie obliczył wymaganą objętość mieszaniny komórkowej.
5. W tym doświadczeniu wykorzystuje się łącznie trzy rodzaje siRNA: jedno kontrolne siRNA i dwa różne siRNA celujące w gen STAT6, oraz kontrolne komórki nietransfekowane. Wymaga to 3,6 ml zawiesiny o końcowym stężeniu 5 X 10⁶ komórek na ml.
6. Wprowadzić pożądane wartości stężenia i objętości końcowej do kalkulatora rozcieńczeń, który obliczy objętość potrzebnej zawiesiny komórkowej na podstawie liczby żywych komórek w danej próbce. Alternatywnie można wykonać obliczenia ręcznie. Następnie przenieść wymaganą objętość mieszaniny komórkowej do nowej probówki.
7. Odwirować mieszaniny komórkowe w celu osadzenia komórek i usunąć cały PBS. Resuspendować komórki w 3,6 ml buforu do elektroporacji Gene Pulser (Bio-Rad Laboratories). Przenieść alikwoty po 800 μl do probówek zawierających odpowiednie siRNA i delikatnie wymieszać. Komórki są teraz gotowe do elektroporacji.

2. Elektroporacja komórek w płytkach 96-dołkowych

1. Płyta do elektroporacji z 96 dołkami pozwala na jednoczesną elektroporację powtórzeń dla wszystkich czterech wariantów traktowania.
2. Przenieś 150 μl zawiesiny komórkowej do odpowiednich dołków płyty do elektroporacji z 96 dołkami.
3. Włóż płytę do komory płyty do elektroporacji MXcell i zamknij pokrywę.
4. Przeprowadź elektroporację, korzystając z ustawień zoptymalizowanych dla danej linii komórkowej i stosowanego buforu. Komórki te są elektroporowane przy użyciu fali o wykładniczym spadku napięcia z nastawami urządzenia: 250 V, 350 μF i opornością 1000 Ω.
5. Po zakończeniu elektroporacji delikatnie pipetuj zawartość każdego dołka w górę i w dół, aby wymieszać zawiesinę, a następnie przenieś komórki na płytkę do hodowli tkankowej zawierającą uprzednio ogrzane medium. Komórki Namalwa są hodowane w pożywce RPMI (Life Technologies) uzupełnionej o 7,5% FCS i 1% pirogronianu.
6. Próbki kontrolne, które nie zostały poddane elektroporacji, pobiera się z pozostałej zawiesiny komórkowej i dodaje do naczyń hodowlanych z uprzednio ogrzanym medium hodowlanym w sposób identyczny jak w przypadku komórek elektroporowanych.
7. Inkubuj komórki przez noc w temperaturze 37°C przy 5% CO₂.
8. Po 24 h jedną grupę komórek indukowano rekombinowanym IL-4 (R&D Systems) w końcowym stężeniu 10 ng/ml. Druga grupa komórek kontrolnych otrzymuje jedynie dodatkowe medium. Wszystkie komórki są inkubowane przez kolejne 24 h w temperaturze 37°C i 5% CO₂.

3. Izolacja i kontrola RNA

1. Po łącznie 48 hr hodowli należy policzyć komórki w każdej studzience, a następnie przenieść jedną porcję z każdej studzience do probówki do mikrocentryfugi w celu ekstrakcji RNA, a drugą porcję zamrozić do analizy western blotting lub innych analiz białek.
2. Próbki należy odwirować, abyt stworzyć osad komórkowy, a następnie usunąć i wylać nadsącz z każdej probówki.
3. Następnie należy przystąpić do ekstrakcji RNA. Zazwyczaj stosujemy zestaw do izolacji całkowitego RNA Aurum (Bio-Rad) zgodnie z dołączonym protokołem.
4. Podczas monitorowania wyciszania genów za pomocą siRNA szczególnie ważne jest zweryfikowanie jakości RNA, ponieważ zdegradowane RNA dostarczy mylących wyników. Stosunek 260/280 nie wskazuje na integralność RNA, dlatego ważne jest rozdzielenie próbek w żelu lub za pomocą urządzenia mikrofluidycznego, aby potwierdzić, że RNA nie uległo degradacji.
5. Aby ocenić zarówno jakość, jak i ilość w jednym kroku, próbki te zostaną przeanalizowane przy użyciu automatycznego systemu elektroforezy Experion (Bio-Rad).
6. Najpierw należy podgrzać próbki. Następnie przygotować, załadować i wymieszać w wirówce chip RNA Experion. Włożyć chip do stacji elektroforezy Experion i uruchomić analizę.
7. Po zakończeniu analizy oprogramowanie Experion automatycznie wyświetli wyniki w formie elektroferogramu, tabeli wyników (zawierającej stężenie RNA, stosunek rybosomalny oraz wskaźnik jakości RNA – RQI) oraz wirtualnego żelu (wyglądającego podobnie do tradycyjnego żelu RNA). Próbki całkowitego RNA wysokiej jakości będą zazwyczaj charakteryzować się wartością RQI w zakresie 8-10.

4. PCR w czasie rzeczywistym

1. Po zweryfikowaniu jakości RNA należy przystąpić do reakcji cDNA. W tym eksperymencie zastosowano mieszaninę iScript one-step RT-PCR mix (Bio-Rad), aby połączyć syntezę cDNA i PCR w czasie rzeczywistym w jednej reakcji.
2. Należy przygotować mieszaninę główną (master mix) zawierającą wszystkie komponenty reakcyjne z wyjątkiem matryc RNA dla każdego zestawu starterów, a następnie rozdzielić ją do płytek PCR.
3. Po rozcieńczeniu RNA do jednolitego stężenia należy dodać próbki RNA do odpowiednich dołków. Każdą reakcję wykonuje się w trzech powtórzeniach.
4. Płytkę należy szczelnie zamknąć i umieścić w systemie PCR w czasie rzeczywistym CFX384 (Bio-Rad). Należy wybrać odpowiedni protokół i rozpocząć bieg.
5. Po zakończeniu biegu poziom ekspresji genów określa się poprzez porównanie ekspresji badanego genu znormalizowanej względem genu referencyjnego w komórkach elektroporowanych eksperymentalnym siRNA do analogowej normalizacji w komórkach elektroporowanych kontrolnym siRNA.

5. Analiza wyciszenia siRNA

1. Ekspresję CCL17 monitorowano za pomocą ilościowej reakcji PCR w czasie rzeczywistym, aby zbadać rolę aktywatora transkrypcyjnego STAT6 w indukowanej przez IL-4 ekspresji CCL17. W tym eksperymencie jako gen referencyjny wykorzystano GAPDH. W ten sam sposób można zastosować inne geny referencyjne lub kilka genów referencyjnych jednocześnie.
2. Oprogramowanie CFX Manager automatycznie znormalizowało ekspresję CCL17 względem ekspresji genu referencyjnego z tej samej próbki i automatycznie porównało otrzymane znormalizowane wartości z grupami kontrolnymi poprzez proste wybranie GAPDH jako „reference” oraz grupy kontrolnej (kontrolne siRNA bez indukcji IL-4) jako „control” w oknie ustawień eksperymentu oprogramowania CFX Manager.
3. Bez indukcji IL-4 transkrypcja CCL17 utrzymywała się na niskim, konstytutywnym poziomie porównywalnym z grupą kontrolną.
4. Komórki indukowane IL-4 z zachowaną prawidłową ścieżką STAT6 (tj. grupy z kontrolnym siRNA lub nieprzefekowane grupy kontrolne) wykazały 8–10 krotny wzrost ekspresji CCL17.
5. Komórki indukowane IL-4, w których ekspresja STAT6 została zahamowana poprzez wprowadzenie siRNA przeciwko STAT6, wykazały jedynie około 2-krotnie wyższą ekspresję CCL17 niż komórki nieindukowane, co potwierdza rolę STAT6 w indukowanej przez IL-4 ekspresji CCL17.

6. Reprezentatywne wyniki

Rycina 1. Przegląd szlaku sygnalizacyjnego IL-4.
A) Wiązanie IL-4 do jego receptora prowadzi do dimeryzacji i aktywacji STAT6. Aktywowany STAT6 przemieszcza się do jądra i aktywuje transkrypcję swoich genów docelowych, takich jak CCL17.
B) Bez indukcji IL-4 transkrypcja CCL17 pozostanie na niskim poziomie konstytutywnym.
C) Po wyciszeniu genu STAT6 za pomocą siRNA traktowanie IL-4 powinno prowadzić do niewielkiego lub żadnego wzrostu ekspresji CCL17.

Rysunek 2. Indukcja CCL17 przez IL4 mierzona w różnych warunkach za pomocą ilościowej reakcji PCR w czasie rzeczywistym.
A) Próbki hodowane bez IL-4 wykazywały niski konstytutywny poziom ekspresji, niezależnie od ekspresji genów.
B) Jak pokazano na kolor zielony i niebieski, próbki kontrolne zareagowały prawidłowo na leczenie IL-4, wykazując 8-10 krotny wzrost indukcji CCL17. Jednakże komórki transfektowane siRNA skierowanymi przeciwko STAT6, pokazane na kolor czerwony i różowy, wykazywały obniżoną ekspresję CCL17 w odpowiedzi na IL-4, co potwierdza tezę, że STAT6 odgrywa rolę w indukowanej przez IL-4 ekspresji CCL17.

Dyskusja

W niniejszym artykule zaprezentowano sposób elektroporacji siRNA do trudnej do transfekcji linii komórkowej w zawiesinie oraz metodę monitorowania ekspresji genów w tych komórkach. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby dążyć do maksymalnej spójności warunków dla wszystkich próbek.