Opisujemy technikę przygotowania klarownych homogenatów kory mózgu człowieka, rozdziału białek metodą SDS-PAGE, odsłaniania antygenów oraz immunoblottingu z użyciem przeciwciała przeciwko peptydowi Aβ. Stosując ten protokół, konsekwentnie wykrywamy monomeryczne i multimeryczne Aβ w tkance korowej pobranej od ludzi z patologią choroby Alzheimera.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Detekcja multimerów Aβ w homogenatach tkanki kory mózgowej człowieka za pomocą SDS-PAGE/immunoblottingu z zastosowaniem odzyskiwania epitopu antygenu
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Uważa się, że anomalne fałdowanie i polimeryzacja peptydydu β-amyloidu (Aβ) inicjują kaskadę neurodegeneracyjną w patogenezie choroby Alzheimera1Aβ to głównie peptyd składający się z 40 lub 42 aminokwasów, który ma tendencję do samoagregacji w bogate w struktury β-kartki włókna amyloidowe, występujące w rdzeniach blaszek starczych w mózgu w chorobie Alzheimera. Coraz więcej dowodów sugeruje, że rozpuszczalne multimery Aβ o niskiej masie cząsteczkowej są bardziej toksyczne niż włóknisty amyloid Aβ2Identyfikacja i ilościowe oznaczenie niskocząsteczkowych oraz wysokocząsteczkowych gatunków multimerów Aβ w tkance mózgowej stanowią kluczowy cel badań nad chorobą Alzheimera, a zastosowane metody mogą być również wykorzystane do identyfikacji i charakterystyki toksycznych multimerów w innych proteopatiach3Naturalnie występujące multimery Aβ można wykryć za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym z SDS, a następnie immunoblottingu z wykorzystaniem przeciwciał specyficznych dla Aβ. Jednakże rozdzielenie i wykrycie multimerów Aβ wymaga zastosowania wysoce skoncentrowanych homogenatów kory mózgowej oraz odzyskiwania antygenu z membran nitrocelulozowych o małych porach. W niniejszej pracy opisujemy technikę przygotowania oczyszczonych homogenatów kory mózgowej człowieka, rozdzielania białek metodą SDS-PAGE oraz odzyskiwania epitopów antygenowych/western blottingu z użyciem przeciwciała 6E10 skierowanego przeciwko regionowi N-końcowemu peptydu Aβ. Stosując ten protokół, konsekwentnie wykrywamy monomery, dimery, trimery, tetramery oraz multimery o wyższej masie cząsteczkowej Aβ w tkance korowej pobranej od ludzi z patologią choroby Alzheimera.
Protokół
Część 1: Przygotowanie klarownych homogenatów tkankowych
- Poddać homogenizacji w homogenizatorze Douncea nieutrwaloną tkankę korową w czterokrotnej objętości lodowatego buforu (0,1M roztwór soli fosforanowo-buforowanej [bezwapniowy i bezmagnezowy] z dodatkiem 2x koktajlu inhibitorów proteaz [Santa Cruz]), wykonując około 30 równomiernych ruchów tłokiem (np. dodać 400μl buforu do 100mg tkanki).
- Wirować homogenaty przez 5 minut przy 3,000g (4°C). Ostrożnie zebrać klarowne nadosady i przechowywać alikwoty tych ekstraktów w temperaturze -80°C do momentu użycia.
- Oznaczyć całkowite stężenie białka (μg/μl) w klarownych homogenatach, stosując metodę kwasu bicinchoninowego (BCA) zgodnie z instrukcjami producenta (ThermoFisher).
Część 2: Przygotowanie próbek do SDS-PAGE
- W przypadku żelu Tricine 10-20% z 10 studzienkami (Invitrogen), maksymalna objętość, jaką można nałożyć do jednej studzienki, wynosi ~25μl. Całkowita objętość obejmuje 2x bufor do próbek SDS oraz 10x środek redukujący, zatem maksymalna objętość oczyszczonego homogenatu, jaką można nałożyć do jednej studzienki, to 10μl. Oczyszczone homogenaty kory 20% (w/v) powinny mieć całkowite stężenie białka powyżej 5 μg/μl, co pozwala na nałożenie 50μg całkowitego białka na studzienkę. Próbki o stężeniu białka poniżej 5mg/ml będą wymagały nałożenia mniejszej ilości całkowitego białka na studzienkę. Niemniej jednak, wysokie poziomy białka są optymalne dla wykrywania monomerów i agregatów Aβ (optymalna ilość to 50-60μg całkowitego białka).
Zawsze należy nakładać taką samą ilość całkowitego białka do każdej studzienki. - Dla każdego żelu należy nałożyć do co najmniej jednej studzienki 10μl markera masy cząsteczkowej, takiego jak SeeBlue Plus2 (Invitrogen). Jako kontrolę pozytywną, w innej studzience należy przeprowadzić analizę 10-100ng syntetycznego peptydu Aβ40 lub Aβ42 (rozcieńczonego w 1xPBS).
- Mieszaniny reakcyjne należy przygotować w lodzie, używając świeżo rozmrożonych, oczyszczonych homogenatów. Probówki należy wstrząsnąć w wortexie przez 5-10 sekund, podgrzać w bloku grzejnym w temperaturze 100°C przez 5 minut, a następnie szybko odwirować wszystkie próbki, aby usunąć kondensację z zakrętki.
Część 3: Elektroforeza w żelu SDS-PAGE
- a wymieszane w wortexie próbki nanieś na żel Tricine 10-20% w komorze XCell Sure Lock Mini-Cell Gelbox, stosując bufor do elektroforezy Tricine SDS, zgodnie z instrukcjami producenta (Invitrogen),
- elektroforezę prowadź przy stałym napięciu 125V przez około 90 minut. Kontynuuj proces, aż prążek markera 4KDa znajdzie się około 1 cm od dolnej krawędzi żelu.
Część 4: Przenoszenie białek z żeli na membrany
- Ostrożnie wyjmij żele z plastikowej kasety i złóż kanapkę transferową wewnątrz modułu XCell II Blot zgodnie z instrukcjami producenta (Invitrogen). Namocz wcześniej podkładki do transferu oraz membrany nitrocelulozowe 0.2μm w buforze transferowym Tris-Glycine (20% methanol), a następnie usuń wszelkie pęcherzyki powietrza z podkładek lub z układu papieru filtrowanego/membrany.
- W komorze XCell Gelbox napełnij wewnętrzną komorę buforem transferowym, a zewnętrzną komorę dIH2O (długotrwała ekspozycja na methanol może prowadzić do zużycia plastikowej komory żelowej).
- Przeprowadź transfer przez 2-3 godziny przy stałym natężeniu prądu 25mA.
- Po zakończeniu transferu rozdziel kanapkę, a żele umieść w dIH2O, natomiast membrany w 1xPBS, oba rodzaje próbek w kwadratowych plastikowych szalkach Petriego (lub innym odpowiednim pojemniku).
- Aby zwizualizować wydajność transferu białek, żele można barwić barwnikiem Simply Blue SafeStain (Invitrogen), a membrany barwnikiem Ponceau S Red (Sigma Aldrich), oba zgodnie z instrukcjami producenta. Barwienie to nie zakłóci procesu immunoblottingu. Jeśli barwienie wykaże niską wydajność transferu białek, należy zmodyfikować czas transferu określony w kroku 3.
Część 5. Odmaskowywanie epitopów antygenowych i immunoblotting
- Przywracanie antygenów jest istotnym etapem odsłaniania epitopów Aβ na błonie w celu umożliwienia wiązania przeciwciał podczas immunoblottingu. Wystarczy dowolny parowar, kuchenka mikrofalowa lub łaźnia wodna utrzymująca stałą temperaturę 100°C. Aby przeprowadzić przywracanie antygenów w parowarze, należy zgrzać termicznie błonę w wytrzymałej plastikowej torebce Kapak wypełnionej 1xPBS w temperaturze pokojowej. Torebkę należy ułożyć płasko w wstępnie podgrzanym parowarze; gdy torebka zacznie się rozszerzać, inkubować przez dodatkowe 15 minut. Przed wyjęciem błony z torebki należy pozwolić jej powoli ostygnąć, aby zapobiec nadmiernemu marszczeniu.
- W temperaturze pokojowej ostrożnie wyjąć błonę z torebki do parowania i płukać ją przez 5 minut w 1xPBS, a następnie przez 5 minut w TBS-T (bufor solny Tris, pH 8.0 z 0.05% Tween-20 [Sigma]) na wytrząsarce orbitalnej. Inkubować błonę w roztworze blokującym (2.5% odtłuszczonego mleka w TBS-T) przez jedną godzinę przy wytrząsaniu. Bez płukania przenieść błonę do naczynia lub plastikowej torebki zawierającej przeciwciało pierwszorzędowe rozcieńczone w roztworze blokującym (6E10 w rozcieńczeniu 1:1,000 [1μg/ml] lub 1:5,000 [0.2μg/ml], Covance), unikając pęcherzyków powietrza. Inkubować na wytrząsarce orbitalnej w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę, a następnie przez 24-48 godzin przy wytrząsaniu w 4°C (dłuższa inkubacja może zapewnić lepszy sygnał).
- Płukać błonę przez 30 minut w TBS-T (jedno szybkie płukanie, a następnie 3 x 10-minutowe płukania).
- Inkubować błonę w przeciwciałach drugorzędowych sprzężonych z HRP (Amersham ECL sheep anti-mouse, GE Healthcare), rozcieńczonych 1:10,000 w roztworze blokującym, przez 90 minut na wytrząsarce w temperaturze pokojowej.
- Płukać błonę przez 30 minut w TBS-T (jedno szybkie płukanie, a następnie 3 x 10-minutowe płukania).
- Na wytrząsarce inkubować błonę w świeżo przygotowanym odczynniku do elektrochemiluminescencji SuperSignal West Pico (ThermoFisher) przez 5 minut, odsączyć nadmiar odczynnika na bezpyłowym papierze filtrującym i umieścić błonę w kasecie do filmu, pomiędzy plastikowymi foliami ochronnymi. W razie potrzeby odsączyć dodatkowy odczynnik SuperSignal za pomocą bezpyłowych chusteczek Kimwipes.
- Naświetlać na film Kodak Biomax MR w odstępach od 30 sekund do 30 minut i wywołać w wywoływaczu do filmów. Po 5 minutach prążki monomerów Aβ będą prawdopodobnie nasycone.
- Błony można poddać procesowi strippingu (po płukaniu w TBS-T) poprzez wytrząsanie w buforze do strippingu Restore Plus przez 30 minut w temperaturze pokojowej i w razie potrzeby ponownie inkubować z dodatkowymi przeciwciałami.
Część 6: Reprezentatywny immunoblot:
Ryciny 1a-c. Klarowane homogenaty zawierające 50μg całkowitego białka od 7 ludzkich dawców zostały przeanalizowane pod kątem obecności multimerów Aβ oraz APP. Immunoblotting z użyciem przeciwciała 6E10 ujawnił monomery, dimery, trimery, tetramery Aβ oraz APP (górny prążek) we wszystkich przypadkach choroby Alzheimera, a także liczne multimery Aβ o wyższej masie cząsteczkowej w 2 przypadkach AD. Syntetyczne Aβ40 potwierdziło tożsamość prążków o niższej masie cząsteczkowej. AD: choroba Alzheimera, DLB: otępienie z ciałami Lewy’ego, ND: człowiek bez otępienia. (a) 30-minutowa ekspozycja filmu, (b) 5-minutowa ekspozycja filmu, (c) 30-sekundowa ekspozycja filmu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Pomimo znaczenia agregacji Aβ w patogenezie choroby Alzheimera1,4,5, niewiele badań opisało lub określiło ilościowo rozkład różnorodnych multimerów Aβ w próbkach tkanki kory mózgowej człowieka2. Powszechnie stosowane techniki immunohistochemiczne nie pozwalają na rozróżnienie poszczególnych gatunków multimerów Aβ w utrwalonej tkance kory. W homogenatach nieutrwalonej tkanki kory multimery Aβ mogą zostać rozdzielone i ocenione biochemicznie przy użyciu elektroforezy w żelu oraz metod detekcji opartyc...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Podziękowania
Serdeczne podziękowania kierujemy do Elaine Pranski oraz Carolyn Suwyn za doskonałą pomoc techniczną, a także do Harry'ego LeVine'a III, M. Paula Murphy'ego i Marli Gearing za ważne rozmowy. Finansowanie zapewniły granty RR-00165, PO1AG026423, P50AG025688, AG030539, fundacja Woodruff Foundation oraz Komitet Badawczy Uniwersytetu Emory.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Tabletki z kompletnym koktajlem inhibitorów proteaz | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | Sc-29130 | 1 tabletka w 25ml buforu |
| Zestaw do oznaczania białek BCA | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 23225 | |
| Zestaw XCell SureLock Mini-Cell i moduł do transferu XCell II Blot Kit CE Mark | Invitrogen | EI0002 | |
| Bufor do próbek Novex Tricine SDS (2X) | Invitrogen | LC1676 | |
| Reduktor do próbek NuPAGE (10X) | Invitrogen | NP0004 | |
| Marker wielkości białek SeeBlue Plus2 Pre-Stained Standard | Invitrogen | LC5925 | |
| Żel Novex 10-20% Tricine 1,0 mm, 10 studni | Invitrogen | EC6625BOX | |
| Membrany nitrocelulozowe, rozmiar porów 0,2 μm | Invitrogen | LC2000 | |
| Bufor do elektroforezy Novex Tricine SDS (10X) | Invitrogen | LC1675 | |
| Bufor do transferu Novex Tris-Glycine (25X) | Invitrogen | LC3675 | |
| SimplyBlue SafeStain | Invitrogen | LC6060 | Nie zakłóca barwienia immunocytochemicznego |
| Roztwór barwiący ATX Ponceau S Red | Sigma-Aldrich | 09276 | Nie zakłóca barwienia immunocytochemicznego |
| Plastikowe woreczki na próbki Kapak zamykane termicznie | Fisher Scientific | 0181225AA | |
| Mysie przeciwciało monoklonalne 6E10 przeciwko Aβ(1-16) | Covance | SIG-39320 | Rozcieńczać 1:1 000 do 1:5 000 dla WB |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P2287 | |
| ECL Mouse IgG, HRP-Linked Whole Aβ (od owcy) | GE Healthcare | NA931-1ML | Rozcieńczać 1:10 000 |
| Substrat chemiluminescencyjny SuperSignal West Pico | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 34077 | |
| Film Kodak Biomax MR | Carestream Health | 870 1302 |
Bibliografia
- Hardy, J., Selkoe, D. J. The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease: progress and problems on the road to therapeutics. Science. 297, 353-356 (2002).
- Haass, C., Selkoe, D. J. Soluble protein oligomers in neurodegeneration: lessons from the Alzheimer's amyloid beta-peptide. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 8, 101-112 (2007).
- Walker, L. C., LeVine, H. The cerebral proteopathies. Neurobiol. Aging. 21, 559-561 (2000).
- Selkoe, D. J. Aging, amyloid, and Alzheimer's disease: a perspective in honor. of Carl Cotman. Neurochem. Res. 28, 1705-1713 (2003).
- Walsh, D. M., Selkoe, D. J. Abeta oligomers - a decade of discovery. J. Neurochem. 101, 1172-1184 (2007).
- Swerdlow, P. S., Finley, D., Varshavsky, A. Enhancement of immunoblot sensitivity by heating of hydrated filters. Anal. Biochem. 156, 147-153 (1986).
- Ida, N., Hartmann, T., Pantel, J., Schröder, J., Zerfass, R., Förstl, H., Sandbrink, R., Masters, C. L., Beyreuther, K. Analysis of hetergeneous A4 peptides in human cerebrospinal fuid and blood by a newly developed sensitive Western blot assay. J. Biol. Chem. 271, 22908-22914 (1996).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
