Detekcja multimerów Aβ w homogenatach tkanki kory mózgowej człowieka za pomocą SDS-PAGE/immunoblottingu z zastosowaniem odzyskiwania epitopu antygenu

Podsumowanie

Opisujemy technikę przygotowania klarownych homogenatów kory mózgu człowieka, rozdziału białek metodą SDS-PAGE, odsłaniania antygenów oraz immunoblottingu z użyciem przeciwciała przeciwko peptydowi Aβ. Stosując ten protokół, konsekwentnie wykrywamy monomeryczne i multimeryczne Aβ w tkance korowej pobranej od ludzi z patologią choroby Alzheimera.

Streszczenie

Uważa się, że anomalne fałdowanie i polimeryzacja peptydydu β-amyloidu (Aβ) inicjują kaskadę neurodegeneracyjną w patogenezie choroby Alzheimera¹Aβ to głównie peptyd składający się z 40 lub 42 aminokwasów, który ma tendencję do samoagregacji w bogate w struktury β-kartki włókna amyloidowe, występujące w rdzeniach blaszek starczych w mózgu w chorobie Alzheimera. Coraz więcej dowodów sugeruje, że rozpuszczalne multimery Aβ o niskiej masie cząsteczkowej są bardziej toksyczne niż włóknisty amyloid Aβ²Identyfikacja i ilościowe oznaczenie niskocząsteczkowych oraz wysokocząsteczkowych gatunków multimerów Aβ w tkance mózgowej stanowią kluczowy cel badań nad chorobą Alzheimera, a zastosowane metody mogą być również wykorzystane do identyfikacji i charakterystyki toksycznych multimerów w innych proteopatiach³Naturalnie występujące multimery Aβ można wykryć za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym z SDS, a następnie immunoblottingu z wykorzystaniem przeciwciał specyficznych dla Aβ. Jednakże rozdzielenie i wykrycie multimerów Aβ wymaga zastosowania wysoce skoncentrowanych homogenatów kory mózgowej oraz odzyskiwania antygenu z membran nitrocelulozowych o małych porach. W niniejszej pracy opisujemy technikę przygotowania oczyszczonych homogenatów kory mózgowej człowieka, rozdzielania białek metodą SDS-PAGE oraz odzyskiwania epitopów antygenowych/western blottingu z użyciem przeciwciała 6E10 skierowanego przeciwko regionowi N-końcowemu peptydu Aβ. Stosując ten protokół, konsekwentnie wykrywamy monomery, dimery, trimery, tetramery oraz multimery o wyższej masie cząsteczkowej Aβ w tkance korowej pobranej od ludzi z patologią choroby Alzheimera.

Protokół

Część 1: Przygotowanie klarownych homogenatów tkankowych

1. Homogenizować nieutrwaloną tkankę korową za pomocą homogenizatora Dounce w czterokrotnej objętości lodowatego buforu (0,1M fosforanowy bufor solny [pozbawiony Ca++ i Mg++] oraz 2x koktajl inhibitorów proteaz [Santa Cruz]), wykonując około 30 równomiernych ruchów tłuczkiem (np. dodać 400μl buforu do 100mg tkanki).
2. Wirować homogenaty przez 5 minut przy 3,000g (4°C). Ostrożnie zebrać klarowne nadsączniki i przechowywać alikwoty tych ekstraktów w temperaturze -80°C do czasu użycia.
3. Oznaczyć całkowite stężenie białka (μg/μl) w klarownych homogenatach za pomocą testu kwasu bicinchononowego (BCA), zgodnie z instrukcjami producenta (ThermoFisher).

Część 2: Przygotowanie próbek do SDS-PAGE

1. W przypadku żelu Tricine 10-20% z 10 studzienkami (Invitrogen), maksymalna objętość, jaką można nanieść do jednej studzienki, wynosi ~25μl. Objętość całkowita obejmuje 2x bufor do próbek SDS oraz 10x czynnik redukujący, zatem maksymalna objętość oczyszczonego homogenatu, którą można nanieść do jednej studzienki, to 10μl. Oczyszczone homogenaty korowe 20% (w/v) powinny mieć całkowite stężenie białka powyżej 5 μg/μl, co pozwala na naniesienie 50μg białka całkowitego na studzienkę. Próbki o stężeniu białka poniżej 5mg/ml będą wymagały naniesienia mniejszej ilości białka całkowitego na studzienkę. Niemniej jednak, wysokie poziomy białka są optymalne dla wykrywania monomerów i agregatów Aβ (optymalna ilość to 50-60μg białka całkowitego).
   Zawsze należy nanosić taką samą ilość białka całkowitego do każdej studzienki.
2. Do każdego żelu należy nanieść do co najmniej jednej studzienki 10μl markera masy cząsteczkowej, takiego jak SeeBlue Plus2 (Invitrogen). Jako kontrolę pozytywną, w innej studzience należy przeprowadzić analizę 10-100ng syntetycznego peptydu Aβ40 lub Aβ42 (rozcieńczonego w 1xPBS).
3. Mieszaniny reakcyjne należy przygotować w lodzie, używając świeżo rozmrożonych, oczyszczonych homogenatów. Probówki należy wstrząsnąć w vortexie przez 5-10 sekund, podgrzać w suchym bloku grzejnym w temperaturze 100°C przez 5 minut, a następnie szybko odwirować wszystkie próbki, aby usunąć kondensat z zakrętki.

Część 3: Elektroforeza w żelu SDS-PAGE

1. Wymieszane w wirówce próbki nanieś na żel Tricine 10-20% w komorze elektroforetycznej XCell Sure Lock Mini-Cell Gelbox, stosując bufor do elektroforezy Tricine SDS, zgodnie z instrukcjami producenta (Invitrogen),
2. Elektroforezę prowadź przy stałym napięciu 125V przez około 90 minut. Kontynuuj proces do momentu, gdy prążek markera 4KDa znajdzie się około 1 cm od dolnej krawędzi żelu.

Część 4: Transfer białek z żeli na membrany

1. Ostrożnie wyjmij żele z plastikowej kasety i złóż kanapkę transferową wewnątrz modułu XCell II Blot, zgodnie z instrukcjami producenta (Invitrogen). Namocz wcześniej podkładki do transferu oraz membrany nitrocelulozowe 0,2μm w buforze transferowym Tris-glicyna (20% metanolu) i usuń wszelkie pęcherzyki powietrza z podkładek lub z zestawu papier filtracyjny/membrana.
2. W komorze XCell Gelbox napełnij wewnętrzną komorę buforem transferowym, a komorę zewnętrzną dIH₂O (długotrwała ekspozycja na metanol może prowadzić do zużycia plastikowej komory żelowej).
3. Przeprowadź transfer przez 2-3 godziny przy stałym natężeniu prądu 25mA.
4. Po zakończeniu transferu rozmontuj kanapkę, a żele umieść w dIH₂O, natomiast membrany w 1xPBS, oba rodzaje materiałów w kwadratowych plastikowych szalkach Petriego (lub innym odpowiednim pojemniku).
5. W celu wizualizacji wydajności transferu białek żele można zabarwić barwnikiem Simply Blue SafeStain (Invitrogen), a membrany barwnikiem Ponceau S Red (Sigma Aldrich), zgodnie z instrukcjami producenta. Barwienie to nie zakłóci procesu immunoblottingu. Jeśli barwienie wykaże niewystarczający transfer białek, należy zmodyfikować czas transferu określony w kroku 3.

Część 5. Odmaskowywanie antygenów i immunoblotting

1. Odsłanianie antygenów jest istotnym etapem ujawniania epitopów Aβ na membranie w celu umożliwienia wiązania przeciwciał podczas immunoblottingu. Wystarczy dowolny parowar, kuchenka mikrofalowa lub łaźnia wodna utrzymująca stałą temperaturę 100°C. Aby przeprowadzić odsłanianie antygenów w parowarze, należy termicznie zgrzać membranę w wytrzymałej plastikowej torebce Kapak wypełnionej 1xPBS w temperaturze pokojowej. Torebkę należy położyć płasko w rozgrzanym parowarze; gdy torebka zacznie pęcznieć, należy inkubować ją przez kolejne 15 minut. Przed wyjęciem membrany z torebki należy pozwolić jej powoli ostygnąć, aby zapobiec nadmiernemu pomarszczeniu.
2. W temperaturze pokojowej ostrożnie wyjmij membranę z torebki do parowania i płucz ją przez 5 minut w 1xPBS, a następnie przez 5 minut w TBS-T (bufor solny Tris-Buffered Saline, pH 8.0 z 0,05% Tween-20 [Sigma]) na potrząsaczu orbitalnym. Inkubuj membranę w roztworze blokującym (2,5% odtłuszczonego mleka w TBS-T) przez jedną godzinę przy ciągłym wstrząsaniu. Bez płukania przenieś membranę do naczynia lub plastikowej torebki zawierającej przeciwciało pierwszorzędowe rozcieńczone w roztworze blokującym (6E10 w rozcieńczeniu 1:1 000 [1μg/ml] do 1:5 000 [0.2μg/ml], Covance), unikając powstawania pęcherzyków powietrza. Inkubuj na potrząsaczu orbitalnym w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę, a następnie przez 24–48 godzin przy wstrząsaniu w 4°C (dłuższa inkubacja może zapewnić lepszy sygnał).
3. Płucz membranę przez 30 minut w TBS-T (jedno szybkie płukanie, a następnie 3 x 10-minutowe płukania).
4. Inkubuj membranę w przeciwciałach wtórnych sprzężonych z HRP (Amersham ECL sheep anti-mouse, GE Healthcare), rozcieńczonych 1:10 000 w roztworze blokującym, przez 90 minut na potrząsaczu w temperaturze pokojowej.
5. Płucz membranę przez 30 minut w TBS-T (jedno szybkie płukanie, a następnie 3 x 10-minutowe płukania).
6. Na potrząsaczu inkubuj membranę w świeżo przygotowanym odczynniku do elektrochemiluminescencji SuperSignal West Pico (ThermoFisher) przez 5 minut, odsącz nadmiar odczynnika na beztkanym papierze filtrującym i umieść membranę w kasecie do filmu, pomiędzy plastikowymi foliami ochronnymi. W razie potrzeby odsącz dodatkowy odczynnik SuperSignal za pomocą bezpyłowych chusteczek Kimwipes.
7. Naświetlaj film Kodak Biomax MR w odstępach od 30 sekund do 30 minut i wywołaj w wywoływaczu do filmów. Po 5 minutach prążki monomerów Aβ będą prawdopodobnie nasycone.
8. Membrany można poddać procesowi strippingu (po płukaniu w TBS-T) poprzez wstrząsanie w buforze strippingowym Restore Plus przez 30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie, w razie potrzeby, ponownie inkubować z innymi przeciwciałami.

Część 6: Reprezentatywny immunoblot:

Ryciny 1a-c. Clarified homogenaty zawierające 50μg całkowitego białka od 7 ludzkich dawców są analizowane pod kątem obecności multimerów Aβ i APP. Immunoblotting z użyciem przeciwciała 6E10 wykazuje monomery, dimery, trimery, tetramery Aβ oraz APP (górny prążek) we wszystkich przypadkach choroby Alzheimera, a także liczne multimery Aβ o wyższej masie cząsteczkowej w 2 przypadkach AD. Syntetyczne Aβ40 potwierdza tożsamość prążków o niższej masie cząsteczkowej. AD: choroba Alzheimera, DLB: otępienie z ciałami Lewy’ego, ND: człowiek bez otępienia. (a) 30-minutowa ekspozycja filmu, (b) 5-minutowa ekspozycja filmu, (c) 30-sekundowa ekspozycja filmu.

Dyskusja

Pomimo znaczenia agregacji Aβ w patogenezie choroby Alzheimera^1,4,5, niewiele badań opisało lub określiło ilościowo rozkład różnorodnych multimerów Aβ w próbkach tkanki kory mózgowej człowieka². Powszechnie stosowane techniki immunohistochemiczne nie pozwalają na rozróżnienie poszczególnych gatunków multimerów Aβ w utrwalonej tkance kory. W homogenatach nieutrwalonej tkanki kory multimery Aβ mogą zostać rozdzielone i ocenione biochemicznie przy użyciu elektroforezy w żelu oraz metod detekcji opartyc...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Tabletki z kompletnym koktajlem inhibitorów proteaz	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	Sc-29130	1 tabletka w 25ml buforu
Zestaw do oznaczania białek BCA	Thermo Fisher Scientific, Inc.	23225
Zestaw XCell SureLock Mini-Cell i moduł do transferu XCell II Blot Kit CE Mark	Invitrogen	EI0002
Bufor do próbek Novex Tricine SDS (2X)	Invitrogen	LC1676
Reduktor do próbek NuPAGE (10X)	Invitrogen	NP0004
Marker wielkości białek SeeBlue Plus2 Pre-Stained Standard	Invitrogen	LC5925
Żel Novex 10-20% Tricine 1,0 mm, 10 studni	Invitrogen	EC6625BOX
Membrany nitrocelulozowe, rozmiar porów 0,2 μm	Invitrogen	LC2000
Bufor do elektroforezy Novex Tricine SDS (10X)	Invitrogen	LC1675
Bufor do transferu Novex Tris-Glycine (25X)	Invitrogen	LC3675
SimplyBlue SafeStain	Invitrogen	LC6060	Nie zakłóca barwienia immunocytochemicznego
Roztwór barwiący ATX Ponceau S Red	Sigma-Aldrich	09276	Nie zakłóca barwienia immunocytochemicznego
Plastikowe woreczki na próbki Kapak zamykane termicznie	Fisher Scientific	0181225AA
Mysie przeciwciało monoklonalne 6E10 przeciwko Aβ(1-16)	Covance	SIG-39320	Rozcieńczać 1:1 000 do 1:5 000 dla WB
Tween 20	Sigma-Aldrich	P2287
ECL Mouse IgG, HRP-Linked Whole Aβ (od owcy)	GE Healthcare	NA931-1ML	Rozcieńczać 1:10 000
Substrat chemiluminescencyjny SuperSignal West Pico	Thermo Fisher Scientific, Inc.	34077
Film Kodak Biomax MR	Carestream Health	870 1302