Artykuł metodologiczny

Analiza dużych kompleksów białkowych za pomocą strukturalnej spektrometrii mas

26.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/1954

⸱

19 czerwca 2010

 ,  , 
1Department of Biological Chemistry, Weizmann Institute of Science

W tym artykule

Podsumowanie

Spektrometria mas okazała się cennym narzędziem do analizy dużych kompleksów białkowych. Metoda ta umożliwia uzyskanie wglądu w skład, stechiometrię i ogólną architekturę wielopodjednostkowych kompleksów. W niniejszej pracy opisujemy krok po kroku, jak przeprowadzić strukturalną analizę spektrometryczną oraz scharakteryzować struktury makromolekularne.

Streszczenie

Żywe komórki kontrolują i regulują swoje procesy biologiczne poprzez skoordynowane działanie licznych białek, które łączą się w szereg dynamicznych, wielobiałkowych kompleksów1. Aby uzyskać mechanistyczne zrozumienie różnych procesów komórkowych, kluczowe jest określenie struktury takich kompleksów białkowych oraz ujawnienie, w jaki sposób ich organizacja strukturalna determinuje ich funkcję. Wiele aspektów kompleksów wielobiałkowych jest jednak trudnych do scharakteryzowania ze względu na ich heterogeniczną naturę, asymetryczną strukturę i dynamikę. W związku z tym konieczne jest opracowanie nowych podejść do badania trzeciego poziomu organizacji białek.

Jednym z rozwijających się narzędzi biologii strukturalnej do analizy kompleksów makromolekularnych jest spektrometria mas (MS)2-5. Metoda ta dostarcza informacji o złożonym składzie białkowym, stechiometrii podjednostek oraz topologii strukturalnej. Potencjał MS wynika z wysokiej czułości, a w konsekwencji z niewielkiego zapotrzebowania na próbkę, co umożliwia badanie kompleksów białkowych ekspresowanych na poziomach endogennych. Kolejną zaletą jest szybkość analizy, która pozwala na monitorowanie reakcji w czasie rzeczywistym. Ponadto technika ta umożliwia jednoczesny pomiar charakterystyk oddzielnych populacji współistniejących w mieszaninie.

W niniejszym opracowaniu opisujemy szczegółowy protokół zastosowania strukturalnej spektrometrii mas (MS) do analizy dużych kompleksów białkowych. Procedura rozpoczyna się od przygotowania kapilar powlekanych złotem do nanoprzepływowej jonizacji przez rozpylanie elektrospray (nESI). Następnie przechodzimy do przygotowania próbek, kładąc nacisk na warunki buforowe, które z jednej strony powinny być kompatybilne z nESI, a z drugiej umożliwiać zachowanie nienaruszonej struktury kompleksów. Następnie wyjaśniamy krok po kroku, jak optymalizować warunki eksperymentalne dla pomiarów wysokich mas oraz jak pozyskiwać widma MS i tandemowej spektrometrii mas (MS/MS). Na koniec przedstawiamy przebieg przetwarzania i analizy danych. Zamiast próbować scharakteryzować każdy aspekt kompleksów białkowych, niniejszy protokół wprowadza podstawowe procedury MS, umożliwiając przeprowadzanie eksperymentów MS i MS/MS na kompleksach niekowalencyjnych. Naszym ogólnym celem jest dostarczenie badaczom nieznającym dziedziny strukturalnej spektrometrii mas wiedzy o głównych narzędziach eksperymentalnych.

Protokół

Część 1: Przygotowanie kapilar powlekanych złotem do nanoflowowej jonizacji przez rozpylanie elektrostatyczne

Analizę kompleksów niekowalencyjnych przeprowadza się zazwyczaj za pomocą jonizacji z elektrorysu w przepływie nanoflow (nESI)6, wykorzystując kapilary szklane lub kwarcowe, które zostały wyciągnięte do cienkiej końcówki (~1 μm średnicy wewnętrznej) i pokryte materiałem przewodzącym (zazwyczaj złotem). Takie kapilary są dostępne w formie gotowej do użycia z komercyjnych źródeł (New Objective lub Proxeon); jednak bardziej ekonomiczne może być ich samodzielne przygotowanie w laboratorium:

  1. Przyklej dwa paski dwustronnej taśmy klejącej do dna szalki Petriego w odstępie 2 cm. W centrum jednego z pasków umieść pręcik szklany (8 cm x 5 mm). Taśma klejąca utrzyma kapilary na miejscu, a pręcik szklany będzie podtrzymywał przygotowane kapilary, zapobiegając złamaniu ich końcówek (Rysunek 1).
  2. Użyj kapilar z borokrzemianu szkła o średnicy zewnętrznej 1,0 mm i wewnętrznej 0,78 mm (stosujemy opakowania po 500 cienkościennych kapilar borokrzemianowych firmy Warner Instruments, nr kat. G100TF- 4). Wsuń jedną kapilarę do wyciągacza igieł (stosujemy model P-97 firmy Sutter Instrument Co.). Delikatnie zaciśnij kapilarę w uchwycie i dostosuj jej położenie tak, aby znajdowała się w centrum włókna grzejnego wyciągacza. Delikatnie dokręć zaciski, aż kapilara zostanie stabilnie unieruchomiona z obu końców.
  3. Wyciągnij kapilarę, korzystając z zdefiniowanego programu. Z każdej wyciągniętej kapilary powstaną dwie końcowe kapilary o odpowiednim kształcie. Programowanie wyciągacza odbywa się metodą prób i błędów, aż do uzyskania akceptowalnego kształtu końcówki. Stosujemy następujący program:
    KrokGrzanieWyciąganiePrędkośćCzas
    1750-1580
    2700-1550
    37502002080
  4. Wyjmij wyciągnięte kapilary z urządzenia i sprawdź końcówki, odrzucając wszystkie zdeformowane lub złamane. Użyj tępych pęset (stosujemy pęsety pozycjonujące firmy C.K. Precision), aby umieścić kapilary w szalce Petriego. Podstawa kapilary powinna być przytwierdzona do taśmy klejącej, a górna część powinna opierać się o pręcik szklany, z końcówką skierowaną do góry.
  5. Po zapełnieniu szalki Petriego (do szalki o średnicy 10 cm mieści się około 80 kapilar), włóż ją do napylacza złota (stosujemy model nr EMS550 firmy EMS). Upewnij się, że dopływ gazu został wybrany zgodnie z instrukcjami producenta, a następnie uruchom zdefiniowany cykl napylania (stosujemy ciśnienie argonu 4 psi, ciśnienie próżni 5 x 10-2 mbar, natężenie prądu 45 mA i czas napylania 1 min, przez 3-6 cykli, aż kapilary będą równomiernie złote).

Część 2: Przygotowanie próbek

  1. Wymagane są niskie mikromolarne stężenia próbki (1 - 20 μM). W razie potrzeby należy zagęścić próbkę przy użyciu urządzeń do ultrafiltracji odśrodkowej (np., Vivaspin firmy Sartorius lub NanoSep firmy Pall Corporation). Przed użyciem zaleca się zweryfikowanie adsorpcji kompleksu białkowego do membrany urządzenia.
  2. Często bufory oczyszczające lub roztwory do przechowywania kompleksu białkowego nie są kompatybilne z nESI, w której można stosować wyłącznie roztwory lotne. W związku z tym konieczna jest wymiana buforu. Ten krytyczny etap, podczas którego usuwane są wszelkie ślady soli, cząsteczek buforu lub innych nielotnych adductów, takich jak glicerol, DTT lub EDTA, determinuje jakość widm. Zazwyczaj stosuje się wodny roztwór octanu amonu o stężeniu od 5 mM do 1 M i pH w zakresie 6–8. Wymianę buforu można przeprowadzić przy użyciu mikrocentryfużkowej kolumny do filtracji żelowej (np., kolumny chromatograficzne Micro Bio-Spin 6 firmy Bio-Rad). Krok ten można powtórzyć 1–3 razy przy minimalnym rozcieńczeniu (poniżej współczynnika 1,3 na urządzenie5), aż do uzyskania maksymalnej wymiany. Jeśli wymagana jest zarówno wymiana stężenia, jak i buforu, można przeprowadzić te procesy jednocześnie, stosując ultrafiltrację odśrodkową (np. Vivaspin firmy Sartorius lub NanoSep firmy Pall Corporation).

Część 3: Kalibracja spektrometru mas do pomiarów wysokich mas

Większość eksperymentów prowadzonych na kompleksach wielobiałkowych wykonuje się przy użyciu instrumentu nano elektrospray quadrupole-time-of-flight (Q-ToF). Zaleca się stosowanie quadrupole mass filter ustawionego na niskie częstotliwości, aby umożliwić transmisję i analizę masy jonów o wysokich wartościach m/z 7,8. Rekomenduje się również dodanie do instrumentu wlotów gazu7,8 lub tulei9 w pierwszym przewodniku jonów, co pozwala na kontrolę ciśnienia w pierwszym stopniu próżni. To drugie umożliwia optymalizację transmisji oraz desolwatację bardzo dużych jonów7-9. Obecnie komercyjne instrumenty ESI-ToF i Q-ToF są dostępne od kilku producentów (np. Waters, SCIEX, Bruker lub Agilent), które można stosunkowo łatwo i tanio zmodyfikować do zastosowań w native MS7,8. Możliwe jest jednak wykorzystanie standardowych konfiguracji ToF lub QToF w instrumentach takich jak LCT lub QToF1 (Waters) do pozyskiwania widm mas dla kompleksów o masie do 1 MDa, bez konieczności wprowadzania modyfikacji sprzętowych5.

Protokół opisany poniżej został przeprowadzony na urządzeniu Synapt (Waters).

  1. Przygotować roztwór CsI o stężeniu 100 mg/ml w wodzie oczyszczonej. CsI jest wykorzystywany do kalibracji wysokich mas, ponieważ jednokrotnie naładowane klastry soli, (CsI)nCs+, obejmują szeroki zakres mas, od 393 m/z do wartości znacznie przekraczających 10 000 (Rysunek 2).
  2. Za pomocą pęsety o zaokrąglonych końcach wyjąć powlekaną kapilarę z szalki Petriego i nanieść 2μL roztworu CsI do kapilary, używając końcówki Eppendorf GeLoader.
  3. Włożyć kapilarę do uchwytu kapilarnego i ustawić ją w taki sposób, aby końcówka znajdowała się w odległości około 10 mm od krawędzi uchwytu.
  4. Przesunąć roztwór w stronę końcówki kapilary ręcznie lub za pomocą adaptera do wirowania (spin down).
  5. Umieścić kapilarę pod mikroskopem optycznym i przyciąć końcówkę, używając ostrej pęsety typu AA.
  6. Podłączyć uchwyt kapilarny do interfejsu nanoflow ES. Obrócić stół x-y-z do tyłu, aby uniknąć uszkodzenia kapilary, a następnie przesunąć stół do pozycji aktywnej. Kapilara powinna znajdować się w odległości 1 - 10 mm od otworu stożka.
  7. Przyłożyć napięcie kapilarne (1,050-1,400 V) i niskie ciśnienie nanoflow (0.00-0.03 bar) aż do zainicjowania rozpylania, a następnie spróbować zredukować ciśnienie nanoflow do wartości minimalnej.
  8. Zoptymalizować intensywność sygnału poprzez regulację położenia stołu x-y-z, napięcia kapilarnego, ciśnienia nanoflow oraz przepływu gazu desolwatacyjnego.
  9. Aby wykryć szeroki zakres mas serii piku CsI, należy zoptymalizować napięcia przyspieszające (stosujemy następujące parametry: kapilara 1.3-1.7 kV, stożek próbkowy 80-150 V, stożek ekstrakcyjny 1-3 V).
  10. W celu optymalizacji transmisji jonów o wysokiej masie, które wymagają łagodnych warunków desolwatacji, należy zwiększyć ciśnienie podtrzymujące w początkowym stopniu próżni, między źródłem a analizatorem. Można to osiągnąć poprzez ostrożne zmniejszenie przewodności linii próżni źródła do pompy scroll poprzez częściowe zamknięcie zaworu izolacyjnego (SpeediValve). Aby wyznaczyć punkt optymalny, czynność tę należy wykonywać monitorując wpływ na intensywność sygnału (zazwyczaj stosujemy 3.0-6.5 mBar).
  11. Zebrać około 30 skanów z prędkością 1 skan/sek, w zakresie m/z od 1,000 do 15,000 m/z.
  12. Po akwizycji skalibrować TOF, korzystając z odpowiedniej tabeli kalibracyjnej.

Część 4: Analiza MS nienaruszonych kompleksów białkowych

  1. Wprowadź próbkę zgodnie z opisem (Część 3, sekcje 2-5) i zainicjuj rozpylanie.
  2. Rozpocznij od wstępnej optymalizacji rozpylania (Część 3, sekcje 6-9), aż do momentu wykrycia sygnału. Dokładne położenie stanów ładunku zależy od białka; można je jednak przewidzieć, korzystając z zależności między masą jonu a średnim stanem ładunku, zgodnie z wzorem: (Zav)10: Zav = 0.0778√(m), gdzie m jest masą kompleksu w daltonach. Aby zapobiec dysocjacji kompleksu, nie należy podgrzewać źródła jonów: należy wyłączyć grzałkę lub utrzymywać temperaturę poniżej 40 °C.
  3. Zmieniaj położenie kapilary oraz napięcia stożka próbkowego (sample cone) i ekstraktora w celu maksymalizacji transmisji jonów, kontrolując wynikowe zmiany w widmach. Możliwym punktem wyjścia może być napięcie stożka 100 V, stożek ekstraktora: 1 V i napięcie kapilary 1,5 kV. Zoptymalizuj te parametry w połączeniu z ciśnieniem nanoflow.
  4. Aby poprawić desolwatację i usunąć resztkową wodę oraz składniki buforu, zwiększ napięcie polaryzujące (bias voltage) oraz ciśnienie gazu w komórce kolizyjnej. Krok ten należy przeprowadzić ostrożnie, aby zapobiec dysocjacji kompleksu. Typowe napięcia polaryzujące mieszczą się w zakresie 10-100 V, przy przepływie gazu w pułapce 1-10 ml/min (Rysunek 3). Ręczna regulacja ustawień RF i profilu kwadrupola może poprawić transmisję jonów o wysokiej masie.
  5. Dostrój energie kolizyjne pułapki (Trap) i transferu (Transfer). Często do transmisji jonów o wysokiej masie wymagane są wyższe napięcia (zazwyczaj w zakresie 10-30 V). Na tym etapie ważne jest unikanie dysocjacji kompleksu indukowanej kolizyjnie.
  6. Po uzyskaniu stabilnego sygnału zaleca się zmniejszenie ciśnienia nanoflow i napięcia kapilary do minimalnych wartości, przy jednoczesnym zachowaniu stabilnego rozpylania.

Część 5: Tandemowa spektrometria mas: dysocjacja kompleksów białkowych

  1. Po uzyskaniu optymalnego i stabilnego sygnału należy wybrać jon prekursorowy. Ustaw centrum masy oraz szerokość izolacji (zazwyczaj stosujemy rozdzielczość LM na poziomie 12 oraz rozdzielczość HM w zakresie od 13 do 15). Aby wykryć produkty dysocjacji o wysokiej masie i niskim ładunku, należy zastosować szeroki zakres mas. Zaleca się ustawienie zakresu m/z na poziomie maksymalnym, a następnie zredukowanie go do pożądanych wartości. Sugerujemy również nałożenie na siebie widm MS i MS/MS w celu walidacji izolacji wybranego jonu prekursorowego.
  2. Aby przeprowadzić analizę MS/MS, należy zdysocjować jon prekursorowy poprzez zwiększenie energii kolizyjnej (CE) oraz ciśnienia w komorze kolizyjnej. Zwiększaj stopniowo energię CE w pułapce (Trap) lub w komorze transferowej (Transfer) w krokach 10-20 V i podnieś ciśnienie gazu kolizyjnego do poziomu 0-5 ml/min (wartości typowe). Monitoruj zmiany w widmach, aż do osiągnięcia optymalnych warunków aktywacji. Wysoka energia aktywacji może indukować dysocjację jednej lub więcej podjednostek z nienaruszonego kompleksu, co pozwala wyjaśnić powinowactwa oddziaływań różnych podjednostek. Zazwyczaj stosujemy argon jako gaz kolizyjny w komorach Trap/Transfer, choć zgłaszano korzyści z użycia cięższych gazów (np. Xe lub SF6); są one jednak znacznie droższe11 (Rycina 3).
  3. Zaleca się wybór więcej niż jednego stanu ładunku do analizy MS/MS. W przypadku nakładania się komponentów, pozyskanie zestawu widm tandemowych MS pomoże w rozdzieleniu serii ładunków różnych populacji. Ponadto stany o wyższym ładunku dysocjują łatwiej w porównaniu do stanów o niższym ładunku12.
  4. Oprócz charakteryzacji nienaruszonego kompleksu sugeruje się, że w łagodnych warunkach denaturujących powstaną mniejsze subkompleksy w roztworze. Analizy MS i MS/MS subkompleksów stanowią podstawę do zdefiniowania architektury podjednostek kompleksu13. Aby uzyskać częściową dysrupcję oddziaływań podjednostka-podjednostka, należy stopniowo dodawać rozpuszczalniki organiczne (np. metanol, izopropanol lub acetonitryl) do stężenia 50% lub zmienić pH roztworu poprzez dodanie amoniaku lub kwasu mrówkowego (do stężenia 4%).
  5. Aby wyznaczyć masy poszczególnych podjednostek tworzących kompleks, ważne jest pozyskanie widma w warunkach denaturujących. Można to przeprowadzić przy użyciu Zip-Tip C4 (Millipore) z zastosowaniem stosunku wody do acetonitrylu 25:75 oraz 1% kwasu mrówkowego jako rozpuszczalnika do elucji.

Część 6: Przetwarzanie i analiza danych

  1. Dane są analizowane offline za pomocą programów do analizy widmowej widm MS. Zazwyczaj korzystamy z programu MassLynx (Waters).
  2. W przypadku widm obejmujących szeroki zakres m/z zalecamy stosowanie różnych schematów wygładzania i parametrów centroidowania dla regionów wysokich i niskich m/z, aby odzwierciedlić różnice w rozdzielczości pików w tych obszarach.
  3. Do identyfikacji serii ładunków oraz obliczania stanów ładunku i mas można zastosować funkcję „manual find” w programie MassLynx. W przypadku złożonych widm masowych z nakładającymi się komponentami łatwiejsze może okazać się ręczne obliczanie mas.
  4. Aby ułatwić procesy przypisywania, można użyć dodatkowego oprogramowania; na przykład: MaxEnt do dekonwolucji widm14, SOMMS do dopasowania i symulacji pików15 oraz SUMMIT do określania składu i stechiometrii subkompleksów białkowych oraz generowania sieci oddziaływań białkowych13,16,17.

Część 7: Reprezentatywne wyniki

Metoda chromatografii TLC; konfiguracja komory wywoławczej pokazująca rozmieszczenie płytek; rozdzielenie związków.
Rysunek 1. Przygotowywanie kapilar do nano-elektronadzezowania pokrytych złotem.
A. Przytwierdź dwa dwustronne paski samoprzylepne do szalki Petriego w odstępie 2 cm. Aby podeprzeć przygotowane kapilary, umieść pręcik szklany (8 cm x 5 mm) w centrum jednego z pasków. B. Przyklej tępe końce przygotowanych kapilar do paska samoprzylepnego, opierając ich końcówki o pręcik szklany. C. Po wypełnieniu szalki Petriego przygotowanymi kapilarami, pokryj je złotem, aż na zewnętrznej powierzchni kapilar zostanie równomiernie osadzona cienka warstwa złota.

Wyniki spektrometrii mas, wykres widma m/z, analiza klastrów cezu, detekcja wzorców jonowych.
Rycina 2. Kalibracja wysokich mas przy użyciu jonów jodku cezu.
Duże i monizotopowe klastry CsI sprawiły, że związek ten stał się preferowanym wyborem do kalibracji spektrometrów mas w analizach wysokich mas. Seria równomiernie rozmieszczonych pików rozciąga się w szerokim zakresie, od m/z 393 do wartości znacznie przekraczających 10 000. Są one przypisane do jednokrotnie naładowanych klastrów soli o ogólnym składzie (CsI)nCs+. Dodatkowe sygnały pomiędzy głównymi pikami są powodowane przez dwu- i trzykrotnie naładowane gatunki z tej serii; odpowiednio [(CsI)nCs2]2+ oraz [(CsI)nCs3]3+. Zwiększenie ciśnienia na wstępnym etapie próżni jest niezbędne do detekcji klastrów o wysokiej masie. Wpływ ciśnienia na piki wysokich mas przedstawiono na panelach A. i B przy odczytach ciśnienia wynoszących odpowiednio 1,2 i 5,3. C. Powiększenie widma mas pokazanego na panelu B.

Chromatografia spektrometrii mas, stany ładunku, wyniki elektroforezy, schemat analizy białek.
Rycina 3. Widma masowe nanoprądowej elektrorozpylnej spektrometrii mas pentamerycznej lektyny.
A. Spektrometria mas kompleksu wariantu lektyny (pochodzącego z Lib1-B7 w wyniku ewolucji kierowanej18) daje rozkłady stanów ładunku między 3 000 a 5 000 m/z; jednak ze względu na niewystarczającą desolwatację jonów piki są szerokie. Porównanie paneli A. i B. pokazuje wpływ zwiększenia napięcia polaryzującego z 4 V (A.) do 15 V (B.) na szerokość piku. Ten wzrost warunków przyspieszania powoduje usunięcie resztkowej wody i składników buforu, co daje widmo o wysokiej rozdzielczości. Zmierzona masa (60 240 ± 38 Da) odpowiada kompleksowi pentamerycznemu. C. Do analizy tandemowej MS wybrano następnie stan ładunku +15 (zaznaczony na szaro w panelu B.) D. Zwiększenie energii kolizyjnej powoduje uwolnienie silnie naładowanego monomeru, z centrum przy 1 664 m/z, oraz pozbawionego części składników kompleksu tetramerycznego w zakresie 5 000–8 000 m/z. Wszystkie widma uzyskano z próbki zawierającej 20 μM roztworu w 0,5 M octanie amonu.

Dyskusja

Aby uzyskać widma wysokiej jakości, należy zwrócić uwagę na etapy przygotowania próbek, które obejmują ich zagęszczanie oraz wymianę buforu. Próbki zbyt rozcieńczone spowodują niski sygnał, natomiast próbki o wysokim stężeniu mogą być dość lepkie i blokować igłę elektrosprayu. Co więcej, dodatki do roztworów, takie jak sole, glicerol, detergenty, jony metali i środki redukujące (DTT lub β-merkaptoetanol), mają tendencję do przylegania do zewnętrznej powierzchni białek, co powoduje poszerzenie pików. Dlatego też, aby uzyskać dobrze rozdzielone piki, składniki te należy dodawać w możliwie najniższych stężeniach.

Kolejnym kluczowym parametrem jest położenie kapilary nanofprzepływowej względem otworu spektrometru mas. Znalezienie "sweet spot" może być trudne dla niewprawnych użytkowników, niemniej jednak ma ono znaczący wpływ na jakość widm. Przed rozpoczęciem rozpylania należy również sprawdzić kapilarę nanofprzepływową. Wielkość kropli zależy od średnicy końcówki, która powinna wynosić ~1 μm. Małe krople prowadzą do bardziej wydajnej jonizacji, co jest zatem korzystne. Ważne jest również upewnienie się, że w kapilarze nie ma pęcherzyków powietrza, które mogłyby zablokować przepływ, oraz że powłoka złota nie została zerwana z kapilary podczas pomiaru; w takim przypadku należy dodatkowo przyciąć końcówkę. Należy pamiętać, że zbyt duża ilość próbki zwiększy możliwości optymalizacji warunków MS, takich jak napięcie kapilary, napięcia przyspieszające, ciśnienie i energia kolizyjna.

Ogólnie rzecz biorąc, procedury wyjaśnione w protokole były wykorzystywane do określania składu, stechiometrii i architektury licznych kompleksów białkowych (patrz przeglądy 2,3,4). Przykłady wartości tego podejścia obejmują analizę dużych kompleksów o masie rzędu MDa, takich jak rybosom19 i wysoce uporządkowane kapsydy wirusowe20-22, określanie wiązania substratów w maszynach molekularnych23-25 oraz charakteryzację sieci oddziaływań podjednostek26,17,16,17,27,28.

Oświadczenia

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Autorzy dziękują członkom grupy Sharon za krytyczną recenzję oraz wkład w przygotowanie rękopisu. Jesteśmy wdzięczni za wsparcie programów Morasha i Bikura, Izraelskiej Fundacji Naukowej (granty nr 1823/07 i 378/08), Centrum Badań nad Biomembranami im. Josefa Cohna Minerva, programu stypendialnego Chais Family Fellows for New Scientists, Fundacji Abrahama i Sonii Rochlin, charytatywnego funduszu Wolfson Family Charitable Trust, Centrum Struktury i Montażu Biomolekularnego im. Helen i Miltona A. Kimmelmana, spadkobiercom Shlomo i Sabine Beirzwinsky, Meil de Botton Aynsley oraz Karen Siem z Wielkiej Brytanii. Dziękujemy Danowi Tawfikowi i Itamarowi Yadidowi za udostępnienie próbki wariantu lektyny.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Objętość 1-2 μLNa kapilarę
Stężenie 1-20 μMNa kompleks
Wodny bufor lotny, taki jak octan amonu przy pH= 6- 8Zazwyczaj 5 mM-1 M
Detergent (Minimalny)Klastry cząsteczek detergentu powodują powstawanie szerokich i nierozdzielonych pików
Glicerol (Minimalny, do 5%)Wiąże się niespecyficznie z białkami, co w konsekwencji prowadzi do obserwacji szerokich pików
Rozpuszczalniki organiczne (Do 50%)Mogą denaturować kompleksy białkowe
Kwasy (Do 4%)Denaturują kompleksy białkowe
Sole (Minimalne)Addukty solne prowadzą do powstawania szerokich i nierozdzielonych pików
DTT (Minimalny)Może występować w stężeniu 1-2 μM
Czynniki chelatujące (Minimalne)Stężenia powyżej 250 μM prowadzą do intensywnego tworzenia adduktów

Bibliografia

  1. Alberts, B. The cell as a collection of protein machines: preparing the next generation of molecular biologists. Cell. 92 (3), 291-294 (1998).
  2. Benesch, J. L., Ruotolo, B. T., Simmons, D. A., Robinson, C. V. Protein complexes in the gas phase: technology for structural genomics and proteomics. Chem Rev. 107 (8), 3544-3567 (2007).
  3. Heck, A. J. Native mass spectrometry: a bridge between interactomics and structural biology. Nat Methods. 5 (11), 927-933 (2008).
  4. Sharon, M., Robinson, C. V. The role of mass spectrometry in structure elucidation of dynamic protein complexes. Annu Rev Biochem. 76, 167-193 (2007).
  5. Hernandez, H., Robinson, C. V. Determining the stoichiometry and interactions of macromolecular assemblies from mass spectrometry. Nat Protoc. 2 (3), 715-726 (2007).
  6. Wilm, M., Mann, M. Analytical properties of the nanoelectrospray ion source. Analytical Chemistry. 68 (1), 1-8 (1996).
  7. Sobott, F. A tandem mass spectrometer for improved transmission and analysis of large macromolecular assemblies. Anal Chem. 74 (6), 1402-1407 (2002).
  8. van den Heuvel, R. H. Improving the performance of a quadrupole time-of-flight instrument for macromolecular mass spectrometry. Anal Chem. 78 (21), 7473-7483 (2006).
  9. Chernushevich, I. V., Thomson, B. A. Collisional cooling of large ions in electrospray mass spectrometry. Anal Chem. 76 (6), 1754-1760 (2004).
  10. Mora, dela, J, Electrospray ionization of large multiply charged species proceeds via Dole s charged residue model. Anal Chim Acta. 406, 93-104 (2000).
  11. Lorenzen, K. Optimizing macromolecular tandem mass spectrometry of large non-covalent complexes using heavy collision gases. Int J Mass Spectrom. 268, 198-206 (2007).
  12. Benesch, J. L. Quadrupole-time-of-flight mass spectrometer modified for higher-energy dissociation reduces protein assemblies to peptide fragments. Anal Chem. 81 (3), 1270-1274 (2009).
  13. Taverner, T. Subunit architecture of intact protein complexes from mass spectrometry and homology modeling. Acc Chem Res. 41 (5), 617-627 (2008).
  14. Ferrige, A. G., Seddon, M. J., Skilling, J., Ordsmith, N. The application of MaxEnt to high resolution mass spectrometry. Mass Spectrom. 6, 765-770 (1992).
  15. van Breukelen, B., Barendregt, A., Heck, A. J., van den Heuvel, R. H. Resolving stoichiometries and oligomeric states of glutamate synthase protein complexes with curve fitting and simulation of electrospray mass spectra. Rapid Commun Mass Spectrom. 20 (16), 2490-2496 (2006).
  16. Sharon, M. Symmetrical modularity of the COP9 signalosome complex suggests its multifunctionality. Structure. 17 (1), 31-40 (2009).
  17. Hernandez, H. Subunit architecture of multimeric complexes isolated directly from cells. EMBO Rep. 7 (6), 605-610 (2006).
  18. Yadid, I., Tawfik, D. S. Reconstruction of functional beta-propeller lectins via homo-oligomeric assembly of shorter fragments. J Mol Biol. 365 (1), 10-17 (2007).
  19. Videler, H. Mass spectrometry of intact ribosomes. FEBS Lett. 579 (4), 943-947 (2005).
  20. Uetrecht, C. High-resolution mass spectrometry of viral assemblies: molecular composition and stability of dimorphic hepatitis B virus capsids. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (27), 9216-9220 (2008).
  21. Uetrecht, C. Stability and shape of hepatitis B virus capsids in vacuo. Angew Chem Int Ed Engl. 47 (33), 6247-6251 (2008).
  22. Morton, V. L., Stockley, P. G., Stonehouse, N. J., Ashcroft, A. E. Insights into virus capsid assembly from non-covalent mass spectrometry. Mass Spectrom Rev. 27 (6), 575-595 (2008).
  23. Sharon, M. 20S proteasomes have the potential to keep substrates in store for continual degradation. J Biol Chem. 281 (14), 9569-9575 (2006).
  24. van Duijn, E., Heck, A. J., Vies, S. M. vander Inter-ring communication allows the GroEL chaperonin complex to distinguish between different substrates. Protein Sci. 16 (5), 956-965 (2007).
  25. van Duijn, E. Tandem mass spectrometry of intact GroEL-substrate complexes reveals substrate-specific conformational changes in the trans ring. J Am Chem Soc. 128 (14), 4694-4702 (2006).
  26. Synowsky, S. A., van Wijk, M., Raijmakers, R., Heck, A. J. Comparative multiplexed mass spectrometric analyses of endogenously expressed yeast nuclear and cytoplasmic exosomes. J Mol Biol. 385 (4), 1300-1313 (2009).
  27. Sharon, M. Structural organization of the 19S proteasome lid: insights from MS of intact complexes. PLoS Biol. 4 (8), e267-e267 (2006).
  28. Zhou, M. Mass spectrometry reveals modularity and a complete subunit interaction map of the eukaryotic translation factor eIF3. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (47), 18139-18144 (2008).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Analiza kompleksów białkowychnanoflowowa jonizacja z rozpylaniem elektrolitycznymkapilary powlekane złotemkalibracja jodkiem cezutandemowa spektrometria maspomiary wysokich maskompleksy niekowalencyjneprotokół wymiany buforudysocjacja indukowana zderzeniami
Analiza dużych kompleksów białkowych za pomocą strukturalnej spektrometrii mas
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.