Artykuł metodologiczny

Analiza dużych kompleksów białkowych za pomocą strukturalnej spektrometrii mas

DOI:

10.3791/1954

⸱

19 czerwca 2010

 ,  , 
1Department of Biological Chemistry, Weizmann Institute of Science

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Spektrometria mas okazała się cennym narzędziem do analizy dużych kompleksów białkowych. Metoda ta umożliwia wgląd w skład, stechiometrię i ogólną architekturę zespołów wielopodjednostkowych. W tym miejscu opisujemy krok po kroku, jak przeprowadzić analizę strukturalnej spektrometrii mas i scharakteryzować struktury makromolekularne.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Żywe komórki kontrolują i regulują swoje procesy biologiczne poprzez skoordynowane działanie dużej liczby białek, które łączą się w szereg dynamicznych, wielobiałkowych kompleksów1. Aby uzyskać mechanistyczne zrozumienie różnych procesów komórkowych, kluczowe jest określenie struktury takich kompleksów białkowych i ujawnienie, w jaki sposób ich organizacja strukturalna dyktuje ich funkcję. Wiele aspektów kompleksów wielobiałkowych jest jednak trudnych do scharakteryzowania ze względu na ich niejednorodny charakter, asymetryczną strukturę i dynamikę. W związku z tym potrzebne są nowe podejścia do badania trzeciorzędowych poziomów organizacji białek.

Jednym z nowych narzędzi biologii strukturalnej do analizy kompleksów makromolekularnych jest spektrometria mas (MS)2-5. Metoda ta dostarcza informacji na temat złożonego składu białek, stechiometrii podjednostek i topologii strukturalnej. Siła MS wynika z jego wysokiej czułości, a co za tym idzie, niskiego zapotrzebowania na próbkę, co umożliwia badanie kompleksów białkowych ulegających ekspresji na poziomach endogennych. Kolejną zaletą jest szybkość analizy, która pozwala na monitorowanie reakcji w czasie rzeczywistym. Co więcej, technika ta może jednocześnie mierzyć cechy oddzielnych populacji współistniejących w mieszaninie.

Tutaj opisujemy szczegółowy protokół zastosowania strukturalnego MS do analizy dużych zespołów białkowych. Zabieg rozpoczyna się od przygotowania pokrytych złotem kapilar do jonizacji elektrorozpylającej nanoprzepływem (nESI). Następnie kontynuuje przygotowanie próbki, kładąc nacisk na warunki buforowe, które powinny być z jednej strony zgodne z nESI, a z drugiej strony umożliwiać utrzymanie kompleksów w stanie nienaruszonym. Następnie wyjaśniamy krok po kroku, jak zoptymalizować warunki eksperymentalne dla pomiarów dużej masy i uzyskać widma MS i tandemowe MS. Na koniec przedstawiamy wykres przetwarzania i analiz danych, które następują. Zamiast próbować scharakteryzować każdy aspekt zespołów białkowych, protokół ten wprowadza podstawowe procedury MS, umożliwiając przeprowadzanie eksperymentów MS i MS/MS na kompleksach niekowalencyjnych. Ogólnie rzecz biorąc, naszym celem jest dostarczenie badaczom niezaznajomionym z dziedziną strukturalnego stwardnienia rozsianego wiedzy na temat głównych narzędzi eksperymentalnych.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Część 1: Przygotowanie pokrytych złotem kapilar do jonizacji elektronatrysku nanoprzepływowego

Analiza kompleksów niekowalencyjnych jest zwykle wykonywana za pomocą jonizacji elektronopryskowej nanoprzepływowej (nESI)6, przy użyciu szklanych lub kwarcowych kapilarn, które zostały podciągnięte do cienkiego końcówki (~1 μm średnicy wewnętrznej) i pokryte materiałem przewodzącym (zwykle złotem). Takie kapilary są dostępne w postaci gotowej do użycia ze źródeł komercyjnych (New Objective lub Proxeon); Jednak bardziej opłacalne może być przygotowanie ich we własnym zakresie:

  1. Przyklej dwa paski dwustronnej podkładki samoprzylepnej do dna szalki Petriego, w odległości 2 cm od siebie. Umieść szklany pręt (8 cm x 5 mm) na środku jednej z podkładek. Podkładka samoprzylepna utrzyma kapilary na miejscu, a szklany pręt będzie podtrzymywał przygotowane kapilary i zapobiegał pękaniu końcówek (ryc. 1).
  2. Stosować kapilary ze szkła borokrzemianowego o średnicy zewnętrznej 1,0 mm x 0,78 mm (używamy opakowań po 500 cienkościennych kapilar borokrzemianowych firmy Warner Instruments, nr kat. G100TF-4). Włóż jedną kapilę do ściągacza igieł (używamy modelu P-97 firmy Sutter Instrument Co.). Delikatnie zaciśnij kapilę na miejscu i wyreguluj jej położenie tak, aby leżała w środku włókna grzewczego ściągacza igieł. Dokręć zaciski delikatnie, aż kapilara będzie mocno trzymana na obu końcach.
  3. Pociągnij kapilę za pomocą predefiniowanego programu. Każde pociągnięcie kapilary spowoduje powstanie dwóch końcowych naczyń włosowatych w kształcie. Proces programowania ściągacza polega na próbach i błędach, aż do uzyskania akceptowalnego kształtu końcówki. Korzystamy z następującego programu: krok upał ciągnąć Vell Godzina 1 750 szt. - 15 Rozdział 80 cyfra arabska 700 szt. - 15 50 Rozdział 3 750 szt. 200 szt. 20 Rozdział 80
  4. Usuń wyciągnięte kapilary z instrumentu i sprawdź końcówki, odrzucając te, które są zdeformowane lub złamane. Użyj pęsety (my używamy pęsety pozycjonującej firmy C.K. Precision), aby umieścić naczynia włosowate na szalce Petriego. Podstawa kapilary powinna być przymocowana do podkładki samoprzylepnej, a górna część powinna opierać się o szklany pręt, końcówką skierowaną do góry.
  5. Gdy szalka Petriego jest pełna (około 80 naczyń włosowatych mieści się w naczyniu o średnicy 10 cm), włóż płytkę do złotej powleczonej napylarki (używamy modelu nr. EMS550, firmy EMS). Upewnij się, że zasilanie gazem jest dobrane zgodnie z instrukcjami producenta i aktywuj predefiniowany cykl powlekania (używamy ciśnienia argonu 4 psi, przy podciśnieniu 5 x 10-2 mbar, prądzie 45 mA i czasie powlekania 1 min, przez 3-6 cykli, aż naczynia włosowate będą równomiernie złote).

Część 2: Przygotowanie próbki

  1. Wymagane są niskie stężenia mikromolowe próbki (1 - 20 μM). W razie potrzeby zagęścić próbkę za pomocą odśrodkowych urządzeń ultrafiltracyjnych (np. Vivaspin firmy Sartorius lub NanoSep firmy Pall Corporation). Zaleca się, aby przed użyciem sprawdzić adsorpcję kompleksu białkowego na błonie urządzenia.
  2. Często oczyszczające lub roztwory spichrzające kompleksu białkowego nie są kompatybilne z nESI, do których można stosować tylko roztwory lotne. Dlatego konieczna jest wymiana bufora. Ten krytyczny krok, w którym usuwane są wszystkie ślady soli, cząsteczek buforowych lub innych nielotnych adduktów, takich jak glicerol, DTT lub EDTA, decyduje o jakości widm. Zwykle stosuje się wodny roztwór octanu amonu o stężeniu od 5 mM do 1 M i o pH 6-8. Wymianę buforu można przeprowadzić za pomocą kolumny filtracyjnej z żelem do mikrowirówek (np. kolumny chromatograficzne Micro Bio-Spin 6 firmy Bio-Rad). Ten krok można powtórzyć 1-3 razy przy minimalnym rozcieńczeniu (mniej niż współczynnik 1,3 na urządzenie5), aż do osiągnięcia maksymalnej wymiany. Jeśli wymagana jest zarówno wymiana zagęszczenia, jak i buforu, można je przeprowadzić razem, stosując ultrafiltrację odśrodkową (np. Vivaspin firmy Sartorius lub NanoSep firmy Pall Corporation).

Część 3: Kalibracja spektrometru mas do pomiarów dużych mas

Większość eksperymentów przeprowadzanych na kompleksach wielobiałkowych jest przeprowadzana przy użyciu instrumentu Q-ToF (kwadrupolowego czasu przelotu) z nano elektrorozpylaczem. Zaleca się stosowanie kwadrupolowego filtra masowego dostosowanego do niskich częstotliwości, umożliwiającego transmisję i analizę masową jonów o wysokich wartościach m/z 7,8. Zaleca się również, aby wloty gazu7,8 lub tuleje9 były dodane do przyrządu w pierwszym przewodniku jonów, aby umożliwić kontrolę ciśnienia w pierwszym podciśnieniu stage. Ten ostatni umożliwia optymalizację transmisji i desolwatację bardzo dużych jonów7-9. Obecnie komercyjne instrumenty ESI-ToF i Q-ToF są dostępne u kilku producentów (na przykład Waters, SCIEX, Bruker lub Agilent), które można stosunkowo łatwo i tanio modyfikować do natywnych aplikacji MS7,8. Możliwe jest jednak użycie standardowych konfiguracji ToF lub QToF na instrumentach takich jak LCT lub QToF1 (Waters) w celu uzyskania widm masowych dla kompleksów do 1 MDa, bez konieczności modyfikacji sprzętowych5.

Protokół opisany poniżej został przeprowadzony na instrumencie Synapt (Waters).

  1. Przygotować 100 mg/ml roztworu CsI w oczyszczonej wodzie. CsI jest używany do kalibracji o wysokiej masie, ponieważ pojedynczo naładowane klastry soli (CsI)nCs+ rozciągają się w szerokim zakresie mas, od 393 m/z do znacznie ponad 10 000 (rysunek 2).
  2. Za pomocą pęsety weź pokrytą kapilę z szalki Petriego i załaduj 2 μl roztworu CsI do kapilary za pomocą końcówki Eppendorf GeLoader.
  3. Włóż kapilę do uchwytu kapilary i wyreguluj kapilarę w taki sposób, aby końcówka znajdowała się około 10 mm od krawędzi uchwytu.
  4. Przesuń roztwór w kierunku końcówki kapilary ręcznie lub za pomocą adaptera do obracania w dół.
  5. Umieść kapilę pod mikroskopem optycznym i przytnij końcówkę za pomocą ostrej pęsety typu AA.
  6. Podłącz uchwyt kapilarny do interfejsu nanoflow ES. Obróć stolik x-y-z do tyłu, aby uniknąć uszkodzenia kapilary, i popchnij stolik do pozycji aktywnej. Kapila powinna być umieszczona w odległości 1 - 10 mm od otworu stożka.
  7. Zastosuj napięcie kapilarne (1,050-1,400 V) i niskie ciśnienie nanoprzepływu (0,00-0,03 bara), aż rozpocznie się natryskiwanie, a następnie spróbuj zmniejszyć ciśnienie nanoprzepływu do minimalnej wartości.
  8. Zoptymalizuj intensywność sygnału, dostosowując położenie stolika x-y-z, napięcie kapilarne, ciśnienie nanoprzepływu i przepływ gazu do desolwatacji.
  9. Aby wykryć szeroki zakres masowy serii pików CsI, należy zoptymalizować napięcia przyspieszające (stosujemy następujące parametry: kapilara 1,3-1,7 kV, stożek próbki 80-150 V, stożek ekstrakcyjny 1-3 V).
  10. Aby zoptymalizować transmisję jonów o dużej masie, które wymagają łagodnych warunków desolwatacji, należy zwiększyć ciśnienie wsteczne w początkowym etapie próżni, między źródłem a analizatorem. Można to osiągnąć poprzez ostrożne zmniejszenie przewodności przewodu podciśnienia źródłowego do pompy spiralnej, poprzez częściowe zamknięcie zaworu odcinającego (SpeediValve). W celu zdefiniowania optymalnego punktu, to ostatnie należy wykonać przy jednoczesnym monitorowaniu wpływu na natężenie sygnału (zwykle stosujemy 3,0-6,5 mBar).
  11. Zbierz około 30 skanów z prędkością 1 skanu/s, w zakresie m/z od 1 000 do 15 000 m/z.
  12. Po pobraniu należy skalibrować TOF, korzystając z odpowiedniej tabeli kalibracyjnej.

Część 4: Analiza MS nienaruszonych kompleksów białkowych

  1. Załaduj próbkę zgodnie z opisem (część 3, sekcje 2-5) i rozpocznij natryskiwanie.
  2. Zacznij od wstępnej optymalizacji natrysku (część 3, sekcje 6-9), aż do momentu wykrycia sygnału. Dokładne położenie stanów ładunku jest zależne od białka; jednak można to przewidzieć, wykorzystując zależność między masą jonów a średnim stanem ładunku, a więc: (Zav)10: Zav = 0,0778√(m) , w którym m jest masą kompleksu w daltonach. Aby zapobiec złożonej dysocjacji, nie podgrzewaj źródła jonów: wyłącz grzałkę lub utrzymuj temperaturę poniżej 40 °C.
  3. Zmieniaj położenie kapilary, stożek próbki i napięcia ekstraktora, aby zmaksymalizować transmisję jonów, i sprawdź wynikającą z tego zmianę widma. Możliwym punktem wyjścia może być napięcie stożka 100 V; stożek wyciągowy: 1 V; napięcie kapilarne 1,5 kV. Zoptymalizuj te parametry w połączeniu z ciśnieniem nanoprzepływu.
  4. Aby poprawić desolwatację i usunąć resztki wody i składniki buforowe, zwiększ napięcie polaryzacji i ciśnienie gazu w komórce zderzeniowej. Ten krok należy wykonać ostrożnie, aby zapobiec dysocjacji kompleksu. Typowe napięcia polaryzacji mieszczą się w zakresie 10-100 V, przy przepływie gazu pułapki 1-10 ml/min (ilustracja 3). Ręczna regulacja ustawienia RF i profilu kwadrupolowego może poprawić transmisję jonów o dużej masie.
  5. Dostosuj energie kolizji pułapek i transferów. Często do przesyłu jonów o dużej masie wymagane są wyższe napięcia (zwykle w zakresie 10-30 V). W tym momencie ważne jest, aby uniknąć dysocjacji kompleksu spowodowanej kolizją.
  6. Po osiągnięciu stabilnego sygnału zaleca się obniżenie ciśnienia nanoprzepływu i napięcia kapilarnego do minimalnych wartości, przy jednoczesnym utrzymaniu stabilnego rozpylania.

Część 5: Tandemowa spektrometria mas: dysocjujące kompleksy białkowe

  1. Po uzyskaniu optymalnego i stabilnego sygnału należy wybrać jon prekursorowy. Ustawia środek masy i szerokość izolacji (zazwyczaj używamy rozdzielczości LM 12 i rozdzielczości HM od 13 do 15). Użyj szerokiego zakresu mas do wykrywania produktów dysocjacji o wysokiej masie/niskim ładunku. Zaleca się ustawienie zakresu m/z na maksymalny poziom, a następnie zmniejszenie go do żądanych wartości. Ponadto sugerujemy nałożenie widm MS i MS/MS w celu walidacji izolacji wybranego jonu prekursorowego.
  2. Aby wykonać MS / MS, należy zdysocjować jon prekursorowy poprzez zwiększenie energii zderzenia (CE) i ciśnienia na ogniwo zderzeniowe. Stopniowo zwiększaj pułapkę lub transfer CE, w krokach co 10-20 V, i podnieś ciśnienie gazu zderzeniowego do 0-5 ml/min (typowe wartości). Monitoruj zmiany widm aż do osiągnięcia optymalnych warunków aktywacji. Wysoka energia aktywacji może indukować dysocjację jednej lub więcej podjednostek od nienaruszonego kompleksu i wyjaśniać powinowactwa interakcji różnych podjednostek. Zazwyczaj używamy argonu jako gazu zderzeniowego w komórkach pułapki/transferu, chociaż odnotowano korzyści z używania cięższego gazu (np. Xe lub SF6); gazy te są jednak znaczniedroższe 11 (rys. 3).
  3. Zaleca się wybranie więcej niż jednego stanu naładowania do analizy MS/MS. W przypadku nakładających się na siebie składników, uzyskanie zestawu tandemowych widm MS pomoże w rozdzieleniu serii ładunków różnych populacji. Co więcej, stany o wyższym ładunku będą się łatwiej dysocjować w porównaniu ze stanami o niższym naładowaniu12.
  4. Oprócz scharakteryzowania nienaruszonego kompleksu, sugeruje się, że mniejsze podkompleksy w roztworze będą generowane w łagodnych warunkach denaturacji. Analizy MS i MS/MS podkompleksów stanowią podstawę do zdefiniowania architektury podjednostek kompleksu13. W celu częściowego przerwania oddziaływań podjednostka-podjednostka należy stopniowo dodawać rozpuszczalniki organiczne (np. metanol, izopropanol lub acetonitryl) do stężenia 50% lub zmienić pH roztworu przez dodanie amoniaku lub kwasu mrówkowego (do stężenia 4%).
  5. Aby określić masy poszczególnych podjednostek składających się na kompleks, ważne jest uzyskanie widma w warunkach denaturacji. Można to przeprowadzić za pomocą Zip-Tip C4 (Millipore) o stosunku wody do acetonitrylu 25:75, z 1% kwasem mrówkowym jako rozpuszczalnikiem elucyjnym.

Część 6: Przetwarzanie i analiza danych

  1. Dane są analizowane w trybie offline, przy użyciu programów do analizy spektralnej dla widm MS. Zwykle korzystamy z programu MassLynx (Waters).
  2. W przypadku widm, które obejmują szeroki zakres m/z, zalecamy zastosowanie różnych schematów parametrów wygładzania i centroidów dla wysokich i niskich obszarów m/z, aby odzwierciedlić różnicę w rozdzielczości szczytowej tych obszarów.
  3. Aby zidentyfikować serie ładunków i obliczyć stany i masy ładunków, można zastosować funkcję "ręcznego wyszukiwania" MassLynx. W przypadku złożonych widm masowych z nakładającymi się na siebie składnikami, ręczne obliczanie mas może być łatwiejsze.
  4. Aby ułatwić te procesy przypisywania, można użyć dodatkowego oprogramowania, na przykład: MaxEnt do dekonwolucji widm14, SOMMS do dopasowania pików i symulacji15 oraz SUMMIT do przypisywania składu i stechiometrii podkompleksów białkowych oraz generowania sieci interakcji białkowych13,16,17.

Część 7: Reprezentatywne wyniki

figure-protocol-1
Rysunek 1. Przygotowanie pokrytych złotem naczyń włosowatych nano-elektronatryskowych.
ZA. Przymocuj dwa dwustronne paski samoprzylepne do szalki Petriego w odległości 2 cm od siebie. Aby podeprzeć przygotowane kapilary, umieść szklany pręt (8 cm x 5 mm) na środku jednej z podkładek. Ur. Przyklej koniec przygotowanych naczynek do podkładki klejącej i oprzyj końcówkę na szklanym pręcie. C. Gdy szalka Petriego zostanie wypełniona przygotowanymi naczyniami włosowatymi, pokryj je złotem, aż cienka warstwa złota równomiernie osadzi się na zewnętrznej powierzchni naczyń włosowatych.

figure-protocol-2
Rysunek 2. Kalibracja wysokiej masy przy użyciu jonów jodku cezu.
Duże i monisotopowe klastry CsI sprawiły, że jest to związek z wyboru do kalibracji spektrometrów mas do analizy dużych mas. Seria równomiernie rozmieszczonych szczytów rozciąga się w szerokim zakresie, od m/z 393 do ponad 10 000. Są one przypisane do pojedynczo naładowanych klastrów soli o ogólnym składzie (CsI)nCs+. Dodatkowe sygnały pomiędzy głównymi szczytami są powodowane przez podwójnie i potrójnie naładowane gatunki szeregowe; [(CsI)nCs2]2+ i [(CsI)nCs3]3+, odpowiednio. Zwiększenie ciśnienia w początkowym etapie próżni jest niezbędne do wykrycia klastrów o dużej masie. Wpływ ciśnienia na piki o dużej masie pokazano na panelach A. oraz B. z odczytami ciśnienia wynoszącymi odpowiednio 1,2 i 5,3. C. Rozszerzenie widma masowego pokazane w B.

figure-protocol-3
Rysunek 3. Widma masowe lektyny pentamerycznej z elektrorozpylania nanoprzepływowego.
ZA. Spektrometria mas kompleksu wariantu lektyny (wyprowadzonego z Lib1-B7 przez ewolucję ukierunkowaną18) daje rozkład stanu ładunku między 3 000 a 5 000 m/z; Jednak ze względu na nieodpowiednią desolwatację jonów piki są szerokie. Porównanie paneli A. i B. pokazuje wpływ zwiększenia napięcia polaryzacji z 4 V (A.) do 15 V (B.) na szerokość piku. Ten wzrost przyspieszających warunków powoduje usuwanie resztkowej wody i składników buforowych, co daje widmo o wysokiej rozdzielczości. Zmierzona masa (60,240 ± 38 Da) odpowiada kompleksowi pentamerycznemu. C. Stan naładowania +15 został następnie wybrany do tandemowej analizy MS (zacieniowany na szaro w panelu B). D. Wzrost energii zderzenia powoduje uwolnienie silnie naładowanego monomeru, którego centrum znajduje się na wysokości 1 664 m/z, oraz pozbawionego kompleksu tetramerycznego w zakresie 5 000–8 000 m/z. Wszystkie widma uzyskano z próbki zawierającej 20 μM roztworu w 0,5 M octanie amonu.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby uzyskać widma wysokiej jakości, należy zwrócić uwagę na etapy przygotowania próbki, które obejmują zagęszczenie próbki i wymianę buforu. Nadmiernie rozcieńczone próbki dadzą niski sygnał, podczas gdy próbki o wysokim stężeniu mogą być raczej lepkie i blokować igłę do elektrorozpylania. Ponadto dodatki do roztworów, takie jak sole, glicerol, detergenty, jony metali i środki redukujące (DTT lub β-merkaptoetanol), mają tendencję do przylegania do zewnętrznej powierzchni białek i powodują poszerzenie pików. Dlatego, aby osiągnąć dobrze rozdzielone piki, składniki te powinny być dodawane w możliwie najniższych stężeniach.

Kolejnym kluczowym parametrem jest położenie kapilary nanoprzepływowej względem otworu spektrometru masowego. Znalezienie "słodkiego miejsca" może być wyzwaniem dla niedoświadczonych użytkowników; Niemniej jednak znacząco wpływa na jakość widm. Ważne jest również, aby zbadać kapilarnę nanoprzepływu przed rozpoczęciem rozpylania. Wielkość kropli jest funkcją średnicy końcówki, która powinna wynosić ~1 μm. Małe kropelki prowadzą do bardziej wydajnej jonizacji, a zatem byłyby korzystne. Ważne jest również, aby sprawdzić, czy w kapilarze nie ma pęcherzyków powietrza, które mogłyby blokować przepływ, oraz czy złota powłoka nie jest usuwana z kapilary podczas akwizycji; Jeśli tak, dodatkowo przytnij końcówkę. Należy pamiętać, że nadmierna ilość próbki zwiększy możliwość optymalizacji warunków MS, takich jak napięcie kapilarne, napięcia przyspieszające, ciśnienie i energia zderzenia.

Ogólnie rzecz biorąc, procedury opisane w protokole zostały wykorzystane do określenia składu, stechiometrii i architektury licznych kompleksów białkowych (patrz przeglądy 2,3,4). Analiza dużych kompleksów MDa, takich jak rybosom19 i wysoce uporządkowane kapsydy wirusa20-22, w definiowaniu wiązania substratu z maszynami molekularnymi23-25 lub charakterystyka sieci interakcji podjednostek26,17,16,17,27,28 służą jako tylko kilka przykładów wartości tego podejścia.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują członkom grupy Sharon za ich krytyczną recenzję i za ich wkład w powstanie manuskryptu. Jesteśmy wdzięczni za wsparcie Programów Morasha i Bikura, Izraelskiej Fundacji Naukowej (granty nr 1823/07 i 378/08), Centrum Badań Biomembranowych im. Josefa Cohna Minerva, Chais Family Fellows Program for New Scientists, Fundacji Abrahama i Sonii Rochlinów; Wolfson Family Charitable Trust (Fundusz Charytatywny Rodziny Wolfsonów); Centrum Struktury i Składania Biomolekularnego im. Helen i Miltona A. Kimmelmanów; posiadłość Szlomo i Sabine Beirzwinsky; Meil de Botton Aynsley i Karen Siem, Wielka Brytania. Jesteśmy wdzięczni Danowi Tawfikowi i Itamarowi Yadidowi za udostępnienie nam próbki wariantu lektyny.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1-2 μ L Objętośćna kapilatę
1-20 μ StężenieM Na złożony
bufor lotny Aquanos, taki jak octan amonu przy pH = 6-8Zazwyczaj 5 mM-1 M
Detergent (minimalny)Klastry cząsteczek detergentu wytwarzają szerokie i nierozdzielcze piki
Glicerol (minimalny, do 5%)Przylega niespecyficznie do białek, w wyniku czego obserwuje
się szerokie pikiRozpuszczalniki organiczne (do 50%)Może denaturować kompleksy białkowe
Kwasy (do 4%)Denaturowane kompleksy białkowe
Sole (minimalne)Addukty soli prowadzą do szerokich i nierozdzielonych pików
DTT (minimalny)1-2 i mu; M może być obecne
Czynniki chelatujące (minimalne)Powyżej 250 μ M prowadzą do rozległego tworzenia przywodzeń

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Alberts, B. The cell as a collection of protein machines: preparing the next generation of molecular biologists. Cell. 92 (3), 291-294 (1998).
  2. Benesch, J. L., Ruotolo, B. T., Simmons, D. A., Robinson, C. V. Protein complexes in the gas phase: technology for structural genomics and proteomics. Chem Rev. 107 (8), 3544-3567 (2007).
  3. Heck, A. J. Native mass spectrometry: a bridge between interactomics and structural biology. Nat Methods. 5 (11), 927-933 (2008).
  4. Sharon, M., Robinson, C. V. The role of mass spectrometry in structure elucidation of dynamic protein complexes. Annu Rev Biochem. 76, 167-193 (2007).
  5. Hernandez, H., Robinson, C. V. Determining the stoichiometry and interactions of macromolecular assemblies from mass spectrometry. Nat Protoc. 2 (3), 715-726 (2007).
  6. Wilm, M., Mann, M. Analytical properties of the nanoelectrospray ion source. Analytical Chemistry. 68 (1), 1-8 (1996).
  7. Sobott, F. A tandem mass spectrometer for improved transmission and analysis of large macromolecular assemblies. Anal Chem. 74 (6), 1402-1407 (2002).
  8. van den Heuvel, R. H. Improving the performance of a quadrupole time-of-flight instrument for macromolecular mass spectrometry. Anal Chem. 78 (21), 7473-7483 (2006).
  9. Chernushevich, I. V., Thomson, B. A. Collisional cooling of large ions in electrospray mass spectrometry. Anal Chem. 76 (6), 1754-1760 (2004).
  10. Mora, dela, J, Electrospray ionization of large multiply charged species proceeds via Dole s charged residue model. Anal Chim Acta. 406, 93-104 (2000).
  11. Lorenzen, K. Optimizing macromolecular tandem mass spectrometry of large non-covalent complexes using heavy collision gases. Int J Mass Spectrom. 268, 198-206 (2007).
  12. Benesch, J. L. Quadrupole-time-of-flight mass spectrometer modified for higher-energy dissociation reduces protein assemblies to peptide fragments. Anal Chem. 81 (3), 1270-1274 (2009).
  13. Taverner, T. Subunit architecture of intact protein complexes from mass spectrometry and homology modeling. Acc Chem Res. 41 (5), 617-627 (2008).
  14. Ferrige, A. G., Seddon, M. J., Skilling, J., Ordsmith, N. The application of MaxEnt to high resolution mass spectrometry. Mass Spectrom. 6, 765-770 (1992).
  15. van Breukelen, B., Barendregt, A., Heck, A. J., van den Heuvel, R. H. Resolving stoichiometries and oligomeric states of glutamate synthase protein complexes with curve fitting and simulation of electrospray mass spectra. Rapid Commun Mass Spectrom. 20 (16), 2490-2496 (2006).
  16. Sharon, M. Symmetrical modularity of the COP9 signalosome complex suggests its multifunctionality. Structure. 17 (1), 31-40 (2009).
  17. Hernandez, H. Subunit architecture of multimeric complexes isolated directly from cells. EMBO Rep. 7 (6), 605-610 (2006).
  18. Yadid, I., Tawfik, D. S. Reconstruction of functional beta-propeller lectins via homo-oligomeric assembly of shorter fragments. J Mol Biol. 365 (1), 10-17 (2007).
  19. Videler, H. Mass spectrometry of intact ribosomes. FEBS Lett. 579 (4), 943-947 (2005).
  20. Uetrecht, C. High-resolution mass spectrometry of viral assemblies: molecular composition and stability of dimorphic hepatitis B virus capsids. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (27), 9216-9220 (2008).
  21. Uetrecht, C. Stability and shape of hepatitis B virus capsids in vacuo. Angew Chem Int Ed Engl. 47 (33), 6247-6251 (2008).
  22. Morton, V. L., Stockley, P. G., Stonehouse, N. J., Ashcroft, A. E. Insights into virus capsid assembly from non-covalent mass spectrometry. Mass Spectrom Rev. 27 (6), 575-595 (2008).
  23. Sharon, M. 20S proteasomes have the potential to keep substrates in store for continual degradation. J Biol Chem. 281 (14), 9569-9575 (2006).
  24. van Duijn, E., Heck, A. J., Vies, S. M. vander Inter-ring communication allows the GroEL chaperonin complex to distinguish between different substrates. Protein Sci. 16 (5), 956-965 (2007).
  25. van Duijn, E. Tandem mass spectrometry of intact GroEL-substrate complexes reveals substrate-specific conformational changes in the trans ring. J Am Chem Soc. 128 (14), 4694-4702 (2006).
  26. Synowsky, S. A., van Wijk, M., Raijmakers, R., Heck, A. J. Comparative multiplexed mass spectrometric analyses of endogenously expressed yeast nuclear and cytoplasmic exosomes. J Mol Biol. 385 (4), 1300-1313 (2009).
  27. Sharon, M. Structural organization of the 19S proteasome lid: insights from MS of intact complexes. PLoS Biol. 4 (8), e267-e267 (2006).
  28. Zhou, M. Mass spectrometry reveals modularity and a complete subunit interaction map of the eukaryotic translation factor eIF3. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (47), 18139-18144 (2008).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Structural Mass SpectrometryProtein Complex AnalysisNanoflow Electrospray IonizationGold Coated CapillariesCesium Iodide CalibrationTandem Mass SpectrometryHigh Mass MeasurementsNon Covalent ComplexesBuffer Exchange ProtocolCollision Induced Dissociation

Powiązane artykuły