Mysi model bioluminescencyjnych guzów wątroby

Podsumowanie

Niniejszy artykuł opisuje procedurę indukcji ortotopowych bioluminescencyjnych guzów wątroby u myszy oraz późniejszą analizę wzrostu guza ograniczonego do wątroby przy użyciu obrazowania luminescencyjnego całego ciała żywych zwierząt.

Streszczenie

Niniejszy film opisuje sposób wywoływania przerzutów do wątroby w modelu mysim, które mogą być następnie analizowane za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego. W celu wywołania zlokalizowanego guza wątroby komórki nowotworowe są podawane bezpośrednio do wątroby poprzez mobilizację śledziony i jej podział na dwie części, przy zachowaniu nienaruszonego szypuły naczyniowej dla każdej z połówek śledziony. Komórki raka płuc Lewisa, które konstytutywnie wykazują ekspresję genu lucyferazy świetlikowej (luc1), są inokulowane do jednej z połówek śledziony, która następnie zostaje wycięta po 10 minutach. Druga połowa śledziony pozostaje nienaruszona i zostaje wprowadzona z powrotem do jamy brzusznej. Wzrost guza w wątrobie można monitorować za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego z wykorzystaniem systemu obrazowania całego ciała IVIS. Ilościowe obrazowanie wzrostu guza za pomocą systemu IVIS zapewnia precyzyjną kwantyfikację żywych komórek nowotworowych. Śmierć komórek nowotworowych i nekroza wywołana leczeniem farmakologicznym są wcześnie sygnalizowane przez redukcję sygnału bioluminescencyjnego. Model mysi ten pozwala na badanie mechanizmów leżących u podstaw przeżycia i wzrostu przerzutowych komórek nowotworowych oraz może być wykorzystany do oceny metod terapeutycznych w przerzutach do wątroby.

Protokół

Wstęp

Wątroba często jest pierwszym miejscem przerzutów i może być jedynym obszarem rozprzestrzenienia się choroby u 30-40% pacjentów w stadium zaawansowanym. Jednak opcje leczenia przerzutowych guzów wątroby są nieliczne; jedynie niewielka część pacjentów kwalifikuje się do resekcji, a tylko 23% wykazuje znaczącą odpowiedź na chemioterapeutyki. Badania przedkliniczne w tej dziedzinie były ograniczone przez brak odpowiedniego modelu mysiego do badania izolowanej choroby wątroby. Opisujemy metodę podziału śledziony, która może być wykorzystana do wiarygodnego indukowania jednolitych, rozproszonych przerzutów do wątroby. Resekcja połowy śledziony pozwala uniknąć konsekwencji wzrostu guza w tym narządzie, natomiast druga połowa śledziony zostaje zachowana z nienaruszoną krążeniem wrotnym, aby utrzymać immunoprotekcyjne właściwości śledziony. Opisany przez nas model jest stosunkowo prosty w wykonaniu i może być przeprowadzony szybko poprzez jedno cięcie. Bioluminescencyjne właściwości linii komórek nowotworowych umożliwiają dokładną kwantyfikację odpowiedzi na leczenie bez konieczności uśmiercania zwierząt.

Protokół

I. Przygotowanie komórek

1. Komórki raka płuca Lewisa hoduje się w zmodyfikowanej pożywce podstawowej Dulbecco (DMEM) uzupełnionej o 10% płodowej surowicy cielęcej w temperaturze 37°C i 5% CO₂, a następnie zbiera się metodą trypsynizacji w fazie subkonfluencji.
2. Komórki przeliczono za pomocą urządzenia Nucleocounter (Chemo-metec, Dania), a następnie przygotowano zawiesinę pojedynczych komórek o stężeniu 1 X 10⁶ komórek w 200 μl w pożywce bezsurowiczej.

II. Przygotowanie myszy

Uwaga: Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez komisję etyki University College Cork. W naszym laboratorium stosujemy środki znieczulające do podania wstrzykniętego w celu znieczulenia myszy; alternatywnie można zastosować środki znieczulające do podania wziewnego, aby uzyskać ten sam efekt. Wykorzystany przez nas szczep myszy to bezwłosy szczep MF1 nu/nu pozyskany z Harlan Laboratories (Oxfordshire, Anglia). W eksperymencie uwzględniono samice myszy MF1 nu/nu o masie 16-22 g i wieku 6-8 tygodni. Można również stosować inne szczepy, takie jak C57 i Balb/c, z odpowiednimi liniami komórek nowotworowych.

1. Znieczulenie podano drogą domięśniową w formie zastrzyku otrzewnowego, wstrzykując 100ul roztworu zawierającego 1,5 mg ketaminy i 300 ug ksylazyny.
2. Głębokość znieczulenia oceniono za pomocą testu ucisku palca u nogi. W odpowiedzi na ucisk nie powinien wystąpić odruch wycofania.
3. Znieczuloną mysz odpowiednio ułożono i przymocowano taśmą do podkładki grzewczej.
4. Brzuch przygotowano przy użyciu 10% roztworu betadyny.
5. Brzuch oraz miejsce operacyjne odizolowano w sposób sterylny.

III. Nacięcie brzucha

1. W skórze wykonuje się niewielkie nacięcie podżebrowe.
2. Nacięcie rozszerza się do 2-3 cm.
3. Mięśnie ściany brzusznej zostają rozcięte, a następnie uzyskuje się dostęp do jamy otrzewnowej.

IV. Ekspozycja i podział śledziony

1. Śledzionę mobilizuje się i ostrożnie wysuwa na wcześniej przygotowaną sterylną gazę.
2. W połowie ciała śledziony zawiązuje się dwie ligatury z nici vicryl 4-0.
3. Śledzionę przecina się pomiędzy dwiema ligaturami, tworząc dwie półśledziony.

V. Iniekcja komórek do połowy śledziony

1. Do jednej części śledziony wstrzyknięto 100 μL zawiesiny komórek za pomocą igły 27 G.
2. Pozostawiono komórki nowotworowe na dziesięć minut, aby mogły przedostać się do wątroby, co zapewnia wystarczający czas na dotarcie większości wstrzykniętych komórek do organu docelowego.

VI. Wycięcie połowy śledziony, zamknięcie jamy brzusznej i rekonwalescencja

1. Wycinana jest wstrzyknięta połowa śledziony.
2. Drugą połowę śledziony wprowadza się z powrotem do jamy brzusznej.
3. Warstwę mięśniową zamyka się szwem 4-0 PDS, stosując prosty szew ciągły.
4. Skórę brzucha zamyka się szwem 4-0 Prolene, stosując szwy przerywane.
5. Podaje się bolus płynów oraz pooperacyjną analgezję w postaci Carpofenu (5 mg/kg) poprzez wstrzyknięcie d.o. (dojamy brzusznej) przez 24 h po operacji.
6. Pozostawia się mysz do wybudzenia z anestezji.

VII. Bioluminescencyjne obrazowanie całego ciała w systemie IVIS

1. Myszy poddaje się znieczuleniu za pomocą środka znieczulającego w formie wstrzykiwalnej.
2. Substrat lucyferyny podaje się poprzez wstrzyknięcie do jamy otrzewnej na dziesięć minut przed obrazowaniem.
3. Myszy umieszcza się na platformie i obrazuje przez 3 min przy użyciu systemu obrazowania całego ciała IVIS.
4. Luminescencję wątroby można zmierzyć, wykorzystując narzędzie do wyznaczania obszaru zainteresowania (ROI).

VIII. Odsłanianie wątroby myszy

1. Myszą podaje się znieczulenie za pomocą środka znieczulającego w formie zastrzyku.
2. Poprzez nacięcie brzuszne w kształcie dachu umożliwiono wizualizację rozproszonych przerzutów do wątroby in vivo.
3. Mysz zostaje poddana eutanazji poprzez zwichnięcie karku, a wątroba może zostać wycięta do dalszych analiz.

Rycina 1. Świeżo wycięte wątroby mysie nieleczone oraz z naciekiem guzowym.

Rysunek 2. Kinetyka wzrostu guza wątroby wykazana w obrazowaniu całego ciała IVIS.

Dyskusja

Opracowanie wiarygodnych modeli in vivo do badania przerzutów do wątroby staje się coraz ważniejsze w związku z pojawieniem się nowych strategii terapeutycznych. Aby precyzyjnie badać nowe strategie, modele zwierzęce powinny być stosunkowo łatwe do wykonania, prowadzić do powstania znacznej liczby przerzutów, obejmować wszystkie etapy kaskady przerzutniczej oraz posiadać system reporterowy umożliwiający wykrywanie i liczenie ograniczonej liczby komórek przerzutowych. Opisana metoda dzielenia śledziony (split-spl...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
DMEM	Sigma-Aldrich	D6429
PBS	Sigma-Aldrich	D8537
Ketamina	Vétoquinol
Ksylazyna	Vétoquinol
Karprofen	Vétoquinol
Videne	Ecolab
Szew Vicryl 4-0	Ethicon Inc.
Szew PDS 4-0	Ethicon Inc.
Szew Prolene 4-0	Ethicon Inc.
Lucyferyna Firefly	Biosynth International, Inc