MISSION esiRNA do przesiewania RNAi w komórkach ssaków

Podsumowanie

W niniejszej pracy wykorzystujemy ludzką bibliotekę esiRNA w badaniu wysokoprzepustowym w celu identyfikacji genów zaangażowanych w podział komórki. Przedstawiamy sposób przygotowania i przeprowadzenia przesiewu esiRNA, a także metodę analizy i walidacji uzyskanych wyników.

Streszczenie

Interferencja RNA (RNAi) jest podstawowym mechanizmem komórkowym służącym do kontroli ekspresji genów. RNAi jest indukowana przez krótkie dwuniciowe cząsteczki RNA, znane również jako małe interferujące RNA (siRNA). Krótkie dwuniciowe RNA powstają z dłuższych dwuniciowych prekursorów w wyniku aktywności Dicera, białka z rodziny endonukleaz RNazy III. Powstałe fragmenty są komponentami kompleksu wyciszającego indukowanego przez RNA (RISC), który kierują one do komplementarnego docelowego mRNA. RISC przecina docelowe mRNA, redukując tym samym ekspresję kodowanego białka^1,2,3. RNAi stała się potężną i powszechnie stosowaną metodą badawczą w studiach nad utratą funkcji genów w komórkach ssaków z wykorzystaniem małych interferujących RNA.

Obecnie dostępne są dwie główne metody produkcji małych interferujących RNA. Jedna z nich opiera się na syntezie chemicznej, natomiast metoda alternatywna wykorzystuje endonukleolityczne cięcie specyficznych dla celu długich dwuniciowych RNA przez RNazę III in vitro. W ten sposób powstaje zróżnicowana pula oligonukleotydów typu siRNA, znana również jako siRNA przygotowane przez endorybonukleazę lub esiRNA. Porównanie skuteczności siRNA pochodzenia chemicznego oraz esiRNA wykazuje, że oba te wyzwalacze są skuteczne w wyciszaniu genów docelowych. Różnice można jednak zauważyć przy porównaniu specyficzności. Wiele pojedynczych, syntetyzowanych chemicznie siRNA wywołuje wyraźne efekty poza celem (off-target), podczas gdy złożona mieszanina właściwa dla esiRNA prowadzi do bardziej specyficznego knockdownu¹⁰.

W niniejszym badaniu przedstawiamy projekt bibliotek esiRNA MISSION w skali całego genomu oraz ich zastosowanie w przesiewaniu RNAi, zilustrowane screeningiem zawartości DNA w celu identyfikacji genów zaangażowanych w progresję cyklu komórkowego. Pokazujemy, jak zoptymalizować protokół transfekcji oraz test w celu przeprowadzenia przesiewania wysokoprzepustowego. Demonstrujemy również, w jaki sposób można statystycznie ocenić duże zestawy danych, oraz przedstawiamy metody walidacji głównych wyników (primary hits). Na koniec wskazujemy potencjalne punkty wyjścia do dalszej charakterystyki funkcjonalnej zwalidowanych genów.

Protokół

1. Wysokiej jakości biblioteki MISSION esiRNA

1. Dla każdego genu zainteresowania wybierany jest najbardziej podatny i specyficzny region docelowy dla RNAi z wykorzystaniem algorytmu DEQOR (http://cluster-1.mpi-cbg.de/Deqor/deqor.html).⁴ DEQOR ocenia potencjał wyciszania wszystkich możliwych siRNA o długości 21 nukleotydów w docelowym mRNA w oparciu o najnowocześniejsze kryteria projektowe⁴. Dodatkowo każda potencjalna cząsteczka siRNA jest analizowana pod kątem możliwej reaktywności krzyżowej z innymi genami poprzez przeprowadzenie wyszukiwania BLAST w transkryptomie badanego organizmu. Program zapewnia tym samym analizę ogólnej jakości i zdolności do wyciszania krzyżowego potencjalnych esiRNA (o długości 300-600 bp).
2. Wybrany region cDNA genu docelowego jest amplifikowany metodą PCR przy użyciu specyficznych dla genu starterów flankowanych sekwencjami promotora polimerazy RNA bakteriofaga.
3. Każdy produkt PCR wykorzystany do produkcji MISSION esiRNA jest weryfikowany pod kątem tożsamości poprzez sekwencjonowanie oraz pod kątem czystości za pomocą analizy Caliper Labchip.
4. Długie dwuniciowe RNA jest transkrybowane z produktu PCR przez polimerazę RNA, a następnie następuje hybrydyzacja transkrybowanych nici.
5. esiRNA są przygotowywane poprzez ograniczone trawienie enzymatyczne długiego dwuniciowego RNA za pomocą RNaseIII, a następnie oczyszczane metodą chromatografii wymiany anionowej z wykorzystaniem kolumn spinowych Q-sepharose.
6. esiRNA są wytrącane i resuspenderowane w buforze TE. Wydajność jest mierzona za pomocą pomiarów absorbancji UV, a stężenie jest korygowane poprzez rozpuszczenie w odpowiedniej objętości buforu TE. Ogólna jakość produktu końcowego jest sprawdzana za pomocą analizy Caliper Labchip.

2. Wybór linii komórkowej i optymalizacja transfekcji do badań przesiewowych

1. Przeprowadzić miareczkowanie ilości esiRNA (stosując Eg5 jako kontrolę pozytywną oraz lucyferazę renilli jako kontrolę negatywną) oraz zwiększających się ilości odczynnika do transfekcji na płytce 384-dołkowej, dodać komórki i inkubować przez 48 godzin. Eg5 jest białkiem motorowym z rodziny kinezyn, niezbędnym do montażu dwubiegunowego wrzeciona podziałowego, a jego wyczerpanie prowadzi do zatrzymania mitozy. Powtórzyć tę procedurę dla różnych odczynników do transfekcji i linii komórkowych. W niniejszym protokole zastosowano komórki HeLa hodowane zgodnie ze standardowymi procedurami oraz oligofectamine (Invitrogen) jako odczynnik do transfekcji.
2. W celu wyboru optymalnych warunków transfekcji, za pomocą mikroskopii świetlnej policzyć komórki transfekowane esiRNA przeciwko Eg5 wykazujące zatrzymanie mitozy (okrągły kształt) oraz całkowitą liczbę komórek transfekowanych esiRNA przeciwko lucyferazie renilli (RLUC). Wybrać warunki charakteryzujące się najniższą toksycznością dla RLUC i najbardziej wyraźnym fenotypem dla Eg5.
   Alternatywna metoda optymalizacji warunków transfekcji wykorzystuje stabilną linię komórkową wykazującą ekspresję EGFP (lub innego odpowiedniego genu reporterowego) pod kontrolą konstytutywnego promotora aktywnego. Po transfekcji esiRNA przeciwko EGFP (lub innemu genowi reporterowemu) oraz RLUC (lub innego odpowiedniego esiRNA kontroli negatywnej), zmierzyć wydajność wyciszania (knock-down) oraz toksyczność, np. za pomocą fluorescencyjnego sortowania komórek (FACS). Należy upewnić się, że zastosowane esiRNA dla EGFP jest w pełni komplementarne do docelowego mRNA.

3. Przygotowanie przesiewania pierwotnego^5,6

1. Zoptymalizuj dokładność pipetowania dla wszystkich użytych komponentów na zautomatyzowanej stacji pipetującej (np. Aquarius, Tecan i WellMate, Matrix). Ponieważ parametry pipetowania zmieniają się w zależności od rodzaju roztworu, objętości i typu płytki, optymalizację tę należy powtórzyć oddzielnie dla każdego etapu. Jeśli to możliwe, stację pipetującą należy umieścić pod dygestorium z laminarnym przepływem powietrza, aby uniknąć kontaminacji. Wszystkie użyte komponenty powinny zostać zdezynfekowane przed użyciem poprzez autoklawowanie, jeśli jest to możliwe, lub spryskanie 75% etanolem. Zoptymalizuj protokoły płukania tak, aby wykluczyć kontaminację krzyżową między dołkami. Szczegółowe informacje dotyczące optymalizacji automatycznego pipetowania nie mogą zostać podane ze względu na ograniczenia miejsca i zależą w dużej mierze od wykorzystywanej stacji pipetującej. W celu uzyskania dalszych informacji należy zapoznać się z protokołem producenta.
2. Przeprowadź transfekcję komórek w formacie 384-dołkowym, stosując zoptymalizowane warunki opisane powyżej, z użyciem esiRNA dla Eg5 oraz RLUC. Zastosuj naprzemienny wzór dla esiRNA Eg5 i RLUC, obejmujący całą płytkę.
3. Po 48-godzinnej inkubacji utrwal komórki zimnym 100% etanolem, rehydratuj w PBS przez 15 minut, a następnie barw przez 25 minut w PBS zawierającym 1 μg/ml DAPI i 100 μg/ml RNazy A (Qiagen). Na koniec przepłucz PBS i przechowuj w temperaturze 4°C.
4. Zmierz intensywność fluorescencji DAPI za pomocą mikroskopii, np. w systemie Olympus ScanR. Wygeneruj histogram, nanosząc intensywność DAPI względem liczby komórek, i oceń rozkład cyklu komórkowego, obliczając procent komórek o zawartości DNA 2N dla fazy G1; < 2N > 4N dla fazy S; 4N dla fazy G2/M oraz > 4N dla aneuploidii/poliploidii.
5. Oceń homogeniczność wyników na całej płytce. Jeśli wyniki różnią się znacząco, konieczna jest dalsza optymalizacja w celu wykluczenia efektów pozycyjnych. Częstym problemem przy stosowaniu płytek wielodołkowych jest zwiększone parowanie w dołkach brzeżnych podczas czasu inkubacji. Prowadzi to do powstania różnych warunków eksperymentalnych w różnych dołkach, co często przekłada się na efekty specyficzne dla pozycji na płytce. Z tego powodu w przypadku screeningu zalecamy pozostawienie wszystkich dołków brzeżnych pustymi. Aby dodatkowo zminimalizować parowanie, należy upewnić się, że w inkubatorach utrzymywana jest wysoka wilgotność. Rutynowo stosujemy również bariery przeciwwparowe, takie jak przepuszczalna taśma uszczelniająca Corning (Corning Breathable Sealing Tape), która blokuje parowanie. Należy również wziąć pod uwagę inne źródła efektów pozycyjnych, np. zmienność techniczną systemu odczytu (mikroskop, czytnik płytek itp.) lub zmienność w obsłudze cieczy (gradienty, niejednorodność roztworów itp.).
6. Różnice statystyczne między kontrolami pozytywnymi i negatywnymi stanowią miarę istotności zastosowanego testu. Przed rozpoczęciem właściwego screeningu należy ustanowić dużą różnicę między kontrolą negatywną (lub szumem tła; kontrolą mock) a próbką. Dobrą miarą istotności statystycznej jest czynnik Z (Z-factor). Czynnik Z oblicza się zgodnie z równaniem:
   Z = 1- (3 SD_[próbka] + 3 SD_[mock]) * (|Av_[próbka] - Av_[mock]|)^-1; gdzie SD: odchylenie standardowe; Av: średnia. Wartość czynnika Z w zakresie 1 > Z > 0,5 wskazuje na statystycznie istotne oddzielenie kontroli negatywnych (i szumu) od kontroli pozytywnych⁷.

4. Przesiewanie pierwotne

1. Przygotować płytki hodowlane z 384 dołkami do transfekcji esiRNA, wykorzystując zoptymalizowane warunki opisane powyżej. W tym przypadku stosuje się 15ng esiRNA na dołek, rozpuszczone w 5μl buforu TE. Co najmniej osiem pozycji kontrolnych na płytce należy wypełnić odpowiednimi kontrolami pozytywnymi i negatywnymi dla badanego procesu biologicznego (tutaj: Eg5 i RLUC). Aby uniknąć efektów brzeżnych, dołki krawędziowe wypełnia się wyłącznie 5μl buforu TE.
2. Do każdego dołka dodać 5μl OptiMEM (Invitrogen) zawierającego 0,2μl Oligofectamine, wymieszać i inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
3. Dodać zawiesinę komórkową do mieszaniny transfekcyjnej (tutaj: 40μl zawiesiny komórek HeLa o stężeniu 25 komórek/μl; co odpowiada 1000 komórek na dołek) i inkubować przez 72 godziny.
4. Zmierzyć zawartość DNA za pomocą mikroskopu automatycznego (Olympus ScanR, patrz wyżej). Ocenić wyniki za pomocą statystyki Z-score w celu wyłonienia trafień (hitów): wartości Z-score oblicza się dla wszystkich badanych esiRNA, przyjmując sygnał z kontroli negatywnej jako punkt odniesienia. Należy zauważyć, że Z-score nie jest tym samym, co Z-factor. Z-score stanowi statystyczną miarę istotności wartości próbek w porównaniu z kontrolą (mock). Oblicza się go zgodnie z równaniem:
   Z = (value_[Sample] - average_[mock]) * standard-deviation_[mock]^-1.
   Do wyłonienia trafień należy zastosować próg odcięcia. Typowo stosuje się kryterium istotności takie jak: 2 < Z < -2, jednak w zależności od jakości zbioru danych, badanego procesu biologicznego lub po prostu zakresu przesiewu, mogą być stosowane różne progi. Oprócz dość prostej statystyki Z-score można stosować również bardziej rozbudowane metody oceny matematycznej (wstęp do szerokiej dziedziny statystycznej oceny danych z przesiewów można znaleźć w pracy Malo et al.⁸).

5. Przesiew sekundarny i walidacja trafień

1. Po przesiewaniu pierwotnym przeprowadza się przesiewanie wtórne, aby wyeliminować wyniki fałszywie dodatnie wynikające z błędów eksperymentalnych lub efektów pozacelowych. W przypadku wybranych trafień należy powtórzyć tę samą procedurę, która była stosowana w przesiewaniu pierwotnym, zwiększając liczbę powtórzeń (3-5), co pozwoli na lepszą ocenę statystyczną.
2. W przypadku zweryfikowanych trafień należy zastosować wtórne, niezakładające się esiRNA (lub inny niezakładający się wyzwalacz wyciszania) przeciwko celom zidentyfikowanym w przesiewaniach wstępnych. Należy zastosować ten sam test i sposób odczytu wyników, co w przesiewaniu pierwotnym.
3. Ostatecznie wybrane geny można zwalidować za pomocą międzygatunkowego ratunku RNAi (cross-species RNAi rescue)⁹. W tym celu do komórek stabilnie transfekuje się bakteryjny sztuczny chromosom (BAC) kodujący np. ortolog genu mysiego. Konstrukcje BAC zachowują gen w jego kontekście genomicznym i umożliwiają ekspresję bliską fizjologicznej. RNAi przeciwko endogennemu ludzkiemu genowi nie zmieni ekspresji transgenu mysiego, co doprowadzi do odwrócenia (ratunku) fenotypu RNAi. Ratunek RNAi stanowi obecnie złoty standard weryfikacji fenotypów RNAi.
4. Na koniec zwalidowane kandydaty bada się bardziej szczegółowo, aby ostatecznie uzyskać zrozumienie mechanistyczne. W wielu przypadkach w tych eksperymentach można wykorzystać RNAi, np. w wtórnych, bardziej rozbudowanych testach.

Dyskusja

Interferencja RNA stała się standardową techniką badania fenotypów utraty funkcji. Wielkoskalowe kolekcje mediatorów RNAi są dostępne u różnych dostawców i stanowią łatwą, kosztowo efektywną oraz szybką metodę wyciszania genów. Otworzyło to drogę do systematycznego screeningu kluczowych czynników w wielu procesach biologicznych, umożliwiając spojrzenie w skali całego genomu na szeroki zakres różnych gatunków i typów komórek.

Wysokie wskaźniki wyników fałszywie dodatnich i fałszywie ujemnych stanowią powszechny problem w badaniach przesiewowych RNAi. Aby rozwiązać ten problem, podjęto znaczne wysiłki w celu poprawy skuteczności, a w szczególności specyficzności czynników wyzwalających wyciszanie. Ważnym odkryciem było to, że pula różnych siRNA celujących w ten sam transkrypt znacznie zwiększa specyficzność względem celu. Ponieważ endoribonukleaza wytwarza bardzo złożoną pulę różnych siRNA, esiRNA są czynnikami wyzwalającymi o wysokiej specyficzności względem celu, co zmniejsza odsetek wyników fałszywie dodatnich w badaniach przesiewowych RNAi. Wykazano również, że esiRNA pozwalają na efektywne wyciszenie ekspresji genów (knockdown), co redukuje także wskaźnik wyników fałszywie ujemnych.

Ponieważ przesiewy RNAi są wymagające pod względem technicznym, ich rutynowe przeprowadzanie prawdopodobnie pozostanie przez pewien czas wyzwaniem. Jednakże, wraz z udoskonalaniem odczynników i aparatury oraz dzieleniem się doświadczeniem przez coraz więcej laboratoriów, przewiduje się, że zastosowanie przesiewów RNAi w nowoczesnej biologii wzrośnie w przyszłości.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
MISSION esiRNA	Sigma-Aldrich		Aby uzyskać dodatkowe informacje, prosimy o kontakt: rnai@sial.com
Wellmate	Thermo Fisher Scientific, Inc.
Przepuszczalna taśma uszczelniająca	Corning	Breathable Sealing Tape, Sterile (Produkt nr 3345)
OptiMEM	Invitrogen
Etanol	Sigma-Aldrich	E7023	200 proof (bezwodny), do biologii molekularnej
Fosforanowo-buforowana sól fizjologiczna	Sigma-Aldrich	P5493	BioReagent, koncentrat 10x, odpowiedni do hodowli komórkowych, do biologii molekularnej
4′,6-Diamidyno-2-fenyloindol dihydrochlorowodorek	Sigma-Aldrich	D8417	Proszek, BioReagent, odpowiedni do hodowli komórkowych, >98% (HPLC i TLC)
Rybonukleaza A z trzustki bydlęcej	Sigma-Aldrich	R6513	Do biologii molekularnej, ≥70 jednostek Kunitza/mg białka, proszek liofilizowany
Roztwór buforu Tris-EDTA	Sigma-Aldrich	T9285	100 x, do biologii molekularnej