Izolacja dorosłych komórek macierzystych z miękkich tkanek układu mięśniowo-szkieletowego na podstawie szybkości przylegania komórek do kolby.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Izolowanie komórek macierzystych z miękkich tkanek mięśniowo-szkieletowych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Dorosłe komórki macierzyste od dawna są przedmiotem dyskusji w kontekście ich zastosowania w medycynie regeneracyjnej. Dorosłe komórki macierzyste wzbudziły ogromne zainteresowanie w leczeniu uszkodzonych i chorych tkanek ze względu na ich imponującą zdolność do różnicowania wieloliniowego oraz zdolność do samoodnowy. Co najważniejsze, cechy te sprawiły, że są one korzystne do zastosowania w terapiach autologicznego przeszczepiania komórek. Niniejszy protokół przybliży czytelnikom zmodyfikowaną technikę preplate, w której tkanki miękkie układu mięśniowo-szkieletowego, np. ścięgno i mięsień, są 1stenzymatycznie dysocjowane, a następnie umieszczone w kolbach powlekanych kolagenem z pożywką. Nadpływ, składający się z pożywki i pozostałych pływających komórek, jest codziennie przenoszony seryjnie do nowych kolb. Komórki macierzyste przylegają do kolb najwolniej, co zazwyczaj zajmuje 5-7 dni (przeniesienia seryjne lub wysiew wstępny). Dzięki zastosowaniu tej techniki, dorosłe komórki macierzyste obecne w tych tkankach mogą być łatwo pozyskiwane za pomocą dość nieinwazyjnych procedur.
Protokół
Ogólnie rzecz biorąc, pełna zmodyfikowana procedura preplatowania wymaga 1-2 dni przygotowania, 1 tygodnia przeprowadzenia procedury technicznej, 2-3 dni identyfikacji komórek metodą immunocytochemii oraz dodatkowych 2-3 tygodni ekspansji populacji komórek macierzystych. Wyposażenie niezbędne do hodowli komórek macierzystych jest analogiczne do stosowanego w innych systemach hodowli komórkowych i obejmuje wirówkę laboratoryjną, inkubator CO2, komorę z laminarnym przepływem powietrza do hodowli tkanek oraz mikroskop odwrócony wyposażony w moduł fluorescencyjny i kamerę cyfrową. Wyizolowane komórki macierzyste można również klonować i przechowywać długoterminowo w ciekłym azocie na potrzeby bieżących lub przyszłych badań 1,2. Wszystkie odczynniki i materiały użyte w tej procedurze muszą być sterylne i obsługiwane aseptycznie.
Krok 1: Przygotowanie
- Powlekanie kolagenem naczyń i kolb do hodowli tkankowej: kolagen typu I pochodzący ze skóry cielęcej (0,1 g w 1 litrze; Sigma-Aldrich). Wyposażenie plastikowe do powlekania obejmuje: kolby T-25, płytki 6- lub 12-dołkowe, szalki (60 i 100 mm, BD Falcon), zgodnie z wcześniejszym opisem 1,2. Delikatnie wstrząsać naczyniami co pół godziny przez 4 godziny, aby zapewnić równomierne powlekanie kolagenem. Następnie należy usunąć roztwór kolagenu. Powlekone naczynia pozostawia się do wyschnięcia w komorze do hodowli tkankowej przy włączonym świetle UV i wentylacji komory w celu zapewnienia sterylności, a na koniec zamyka się je lub przykrywa do późniejszego użycia.
- Przygotowanie pożywki do hodowli komórkowej: 400 mL DMEM (DMEM, high glucose; Invitrogen), 50 mL inaktywowanej ciepłem płodowej surowicy bydlęcej (FBS, Invitrogen), 50 mL surowicy konia (HS, Invitrogen) oraz 5 mL ekstraktu z zarodka kurczaka (CEE; Accurate Chemical Co.) należy przefiltrować próżniowo przy użyciu jednorazowego sterylnego systemu filtracyjnego 0,22-μm o pojemności 500 ml (Corning). Na koniec należy dodać sterylną sólę penicyliny/streptomyciny (Invitrogen) w stężeniu 100 Units/mL. Przygotowane roztwory można przechowywać w temperaturze 4°C przez co najmniej miesiąc. Roztwór ten służy do odrywania komórek od ścianek kolby podczas pasażowania kultur lub przygotowywania komórek do transplantacji.
- Podgrzewanie roztworów do izolacji komórek: następujące odczynniki należy podgrzać do 37°C przed użyciem do izolacji komórek: zbuforowany roztwór soli Hanksa (HBSS, Invitrogen); 0,2% (masa/objętość) kolagenazy typu XI (Sigma-Aldrich), ze średnią aktywnością 3 200 jednostek trawienia kolagenu na mL HBSS; dyspazę 2,4 units/1mL (Invitrogen); 0,5% (masa/objętość) trypsynę (Invitrogen).
- Sterylizacja sprzętu chirurgicznego w ramach przygotowań: procedura chirurgiczna wymaga sterylnych narzędzi chirurgicznych, w tym: pęset o różnych rozmiarach, mikronożyczek, nożyczek irydowych i/lub ostrzy skalpela. Dodatkowo: polipropylenowe probówki do wirowania o pojemności 15 i 50 mL (BD Falcon); sitko do komórek (rozmiar oczek 70 m) (BD Falcon); igły o rozmiarach 18, 23 i 27 G (BD PrecisionGlide) oraz sterylne strzykawki 10- lub 20-ml (BD).
Krok 2: Biopsje tkanek, izolacja i dysocjacja mechaniczna1-4
Biopsje tkanek wykonuje się pod sterylną komorą z laminarnym przepływem powietrza; obejmują one świeżo pobrane ścięgna i mięśnie szkieletowe uzyskane z piszczeli lub mięśnia płaszczowatego kończyny tylnej myszy typu dzikiego (samice C57BL/6J, w wieku 4-5 tygodni lub młodsze, Jackson Laboratory). Następnie z próbek biopsji usuwa się wszelką widoczną tkankę łączną, naczynia krwionośne oraz tkankę tłuszczową. Tkanki ścięgna i mięśnia są następnie starannie identyfikowane pod chirurgicznym mikroskopem dissectingowym w celu usunięcia resztek skóry i kości, a następnie umieszczane w naczyniu zawierającym zimny (4°C) HBSS (uzupełniony o 5 % FBS). Wyizolowane tkanki umieszcza się osobno na pokrytych kolagenem płytkach zawierających zimny HBSS, po czym rozdrabnia się je (<1x1 mm3) do postaci grubej zawiesiny za pomocą mikronożyczek i/lub ostrzy skalpela.
Krok 3: Trawienie enzymatyczne tkanek:
Rozdrobnioną tkankę poddaje się następnie dysocjacji enzymatycznej w serii etapów2,4,5
- Przenieść rozdrobnione zawiesiny tkankowe do oddzielnych probówek 15-ml i wirować przy ~3500 rpm w temperaturze 4 °C przez 5 mins.
- Odlać nadosad, przemyć HBSS i powtórzyć wirowanie.
- Odlać nadosad, a następnie poddać zawiesiny trawieniu, dodając 10 ml podgrzanej wcześniej 0,2% kolagenazy typu XI (Sigma). Inkubować przez 60 mins w 37 °C, stale i delikatnie kołysząc probówkami. Alternatywnie mieszać ręcznie co 10 min.
- Odwirować i resuspender zawiesiny w 10 ml roztworu dispazy (2,4 Units/mL, Gibco). Inkubować przez 45 mins w 37 °C, mieszając ręcznie lub delikatnie kołysząc co 10 min.
- Odwirować i resuspender zawiesiny w 10 ml 0,2% roztworu trypsyny w HBSS. Czas inkubacji zależy od stopnia uwalniania pojedynczych komórek z tkanek, co można kontrolować, obserwując zawiesinę pod mikroskopem. Nie zaleca się przekraczania 30 mins w 37 °C, odwracając probówki lub delikatnie kołysząc nimi co 10 min.
- Odwirować otrzymane komórki i resuspender osad komórkowy w 10 ml Pożywki do Proliferacji (PM).
- Rozdzielić zawiesinę komórkową, przepuszczając ekstrakt przez serię igieł. Komórki należy przepuścić 2 razy przez igłę 18G, następnie 23G i na koniec 27G.
- Przepuścić ekstrakt komórkowy przez sitko komórkowe 70-μm.
Krok 4: Preplating w celu wyizolowania różnych populacji komórek na podstawie szybkości adhezji komórkowej1-3
- Odwirować i resuspendować osady komórkowe w podłożu do proliferacji (Proliferation Medium).
- Wysiać mieszaniny komórek do kolby T-25 pokrytej kolagenem (lub naczynia 60 mm) i oznaczyć ją jako PP1. Pod mikroskopem w zawiesinie komórkowej powinna być widoczna duża liczba refrakcyjnych jąder oraz inne szczątki.
- Inkubować w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze z 5% CO2 przez 2 godziny.
- Przenieść komórki nieprzylegające do nowej kolby T-25 pokrytej kolagenem (lub naczynia 60 mm) i oznaczyć ją jako PP2. Do naczynia oznaczonego jako PP1 dodać 5 ml PM. Komórki przylegające wczesnym etapie, które przytwierdzają się do kolby, to w większości miofibroblasty3.
- Wrócić kolby do inkubatora na kolejne 24 godziny, przenieść komórki nieprzylegające do nowej kolby T-25 pokrytej kolagenem (lub naczynia) i oznaczyć ją jako PP3. Do naczynia oznaczonego jako PP2 dodać 5 ml podłoża do proliferacji (Proliferation Medium). Komórki przylegające, które przytwierdzają się do tej kolby, to w większości fibroblasty2,3.
- Wrócić kolby do inkubatora i powtarzać procedurę co 24 godziny, aż do uzyskania populacji PP6. Hodować każdą grupę zawieszonych komórek, pozwalając im na proliferację i regularnie badając je pod mikroskopem odwróconym. PP3-PP4 to w większości mioblasty, natomiast komórki satelitarne mięśni często obserwuje się głównie w PP5 2.
- Większość powoli przylegających komórek zazwyczaj przytwierdza się do etapu PP6. Na tym etapie komórki wydają się małe, okrągłe, lekko refrakcyjne i występują w bardzo małej liczbie; są one uznawane za populację komórek macierzystych 1,2.
Krok 5: Identyfikacja i ekspansja wyizolowanych komórek macierzystych
- Izolowane komórki PP6 występują w bardzo niewielkiej liczbie i muszą być utrzymywane w bogatym w FBS Medium do Proliferacji (20% FBS w DMEM), które należy wymieniać codziennie. Większość komórek obecnych w kulturze PP6 obumiera podczas kolejnych 1-2 tygodni hodowli, jednak po dodatkowych 1-2 tygodniach ekspansji zazwyczaj tworzy się duża, zdrowa populacja PP6. Komórki macierzyste izolowane z myszy wykazują wysoką ekspresję antygenu komórek macierzystych 1 (Sca1), CD34, fetal liver kinase 1 (Flk1) oraz innych markerów komórek macierzystych1,2,6,7, co można zwizualizować za pomocą barwienia immunocytochemicznego. Komórki macierzyste te wykazują również wielokierunkowe zdolności różnicowania3,6,8.
- Izolowane komórki są utrzymywane i powielane przy niskiej gęstości komórkowej w kulturze (płytki 12-dołkowe przy 50-100 komórkach/dołku lub <20-30% konfluencji w kolbie lub płytce), aby uniknąć różnicowania 1,2. Podczas ekspansji bardzo niewielu komórek tworzy klony, a te sklonowane komórki macierzyste mogą przechodzić długotrwałą proliferację (LTP) na potrzeby innych badań kompetencji. Sklonowane komórki macierzyste można również przechowywać w ciekłym azocie, stosując ogólne procedury przechowywania komórek, np. w medium PM z 10% DMSO. Należy przygotować kilka zapasowych linii komórek macierzystych o niskim numerze pasażu do dalszych badań pomocniczych.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Uznano, że niektóre tkanki dorosłych zawierają liczne komórki macierzyste. W ciągu ostatnich kilku lat badań komórki macierzyste wykryto w miękkich tkankach mięśniowo-szkieletowych, w tym w mięśniach szkieletowych i ścięgnach. Niniejszy protokół szczegółowo opisuje procedurę, znaną jako zmodyfikowana technika preplatowania (modified preplate technique), która była z powodzeniem stosowana w naszym laboratorium do izolowania dorosłych komórek macierzystych ze ścięgien i mięśni szkieletowych. Stosując opisaną powyżej zmodyf...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Autorzy wyrażają ogromną wdzięczność pani Haiying Pan i panu Ianowi Bellayrowi za pomoc techniczną przy izolacji komórek do niniejszych filmów oraz panu Kyle'owi Holdenowi i panu Jonathanowi Lucasowi za pomoc w edycji slajdów. Serdeczne podziękowania kierujemy do następujących osób, które w ostatnich latach brały udział w opracowywaniu zmodyfikowanych technik przedsiewania (preplate): drów Burhan Gharaibeh, BaoHong Cao, Deasy Bridget, Thomas R. Payne, Aiping Lu, Hairong Peng, Hideki Oshima, Bo Zeng, Xiaodong Mu, Kimimasa Tobita, Ron Jankowski, Makato Ikezawa. Jesteśmy wdzięczni za pomoc techniczną Jamesowi H. Cumminsowi, Ryanowi Pruchnicowi, Josephowi Fedusce, Rebeccy C. Schugar, Haiying Pan oraz Jessice Tebbets. Autor chciałby również podziękować za wsparcie finansowe tej pracy Muscular Dystrophy Association (MDA), National Institutes of Health (NIH), Department of Defense (DOD), Children's Hospital of Pittsburgh of UPMC, Department of Orthopaedic Surgery oraz University of Pittsburgh.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| DMEM | Invitrogen | #11995-073 | |
| FBS | Invitrogen | #10437-028 | |
| Surowica końska inaktywowana termicznie | Invitrogen | #26050-088 | |
| Ekstrakt z zarodka kurczego | Accurate Chemical | #CE650T-10 | |
| 100U ml penicylina/streptomycyna | Invitrogen | #15140-122 | |
| PBS Dulbecco | Invitrogen | #14190-250 | |
| Zbuforowany roztwór soli Hanksa | Invitrogen | #24020-117 | |
| Kolagenaza typu XI 0.2%(wt/vol) | Sigma-Aldrich | #C7657 | |
| Dispaza 2.4U ml | Invitrogen | #17105-041 | |
| Trypsyna-EDTA 0.5%(wt/vol) (10x; 5g liter trypsyny (1:250) | Invitrogen | #15400-054 | |
| Kolagen do powlekania kolby: kolagen typu I pochodzący ze skóry cielęcej 0.1 g liter | Sigma-Aldrich | #C-9791 | |
| DMSO | Sigma | #D-2650 |
Bibliografia
- Gharaibeh, B. Isolation of a slowly adhering cell fraction containing stem cells from murine skeletal muscle by the preplate technique. Nat Protoc. 3, 1501-1509 (2008).
- Qu-Petersen, Z. Identification of a novel population of muscle stem cells in mice: potential for muscle regeneration. J Cell Biol. 157, 851-864 (2002).
- Li, Y. &, Huard, J. Differentiation of muscle-derived cells into myofibroblasts in injured skeletal muscle. Am J Pathol. 161, 895-907 (2002).
- Watt, D. J., Lambert, K., Morgan, J. E., Partridge, T. A. &, Sloper, J. C. Incorporation of donor muscle precursor cells into an area of muscle regeneration in the host mouse. J Neurol Sci. 57, 319-331 (1982).
- Lu, A. Isolation of myogenic progenitor populations from Pax7-deficient skeletal muscle based on adhesion characteristics. Gene Ther. 15, 1116-1125 (2008).
- Lee, J. Y. Clonal isolation of muscle-derived cells capable of enhancing muscle regeneration and bone healing. J Cell Biol. 150, 1085-1100 (2000).
- Cao, B. The role of receptors in the maturation-dependent adenoviral transduction of myofibers. Gene Ther. 8, 627-637 (2001).
- Cao, B. Muscle stem cells differentiate into haematopoietic lineages but retain myogenic potential. Nat Cell Biol. 5, 640-646 (2003).
- Huard, J. Regenerative medicine based on muscle stem cells. J Musculoskelet Neuronal Interact. 8, (2008).
- Gates, C. B., Karthikeyan, T., Fu, F. &, Huard, J. Regenerative medicine for the musculoskeletal system based on muscle-derived stem cells. J Am Acad Orthop Surg. 16, 68-76 (2008).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
