Izolowanie komórek macierzystych z miękkich tkanek układu mięśniowo-szkieletowego

Podsumowanie

Izolowanie dorosłych komórek macierzystych z tkanek miękkich układu mięśniowo-szkieletowego na podstawie szybkości przylegania komórki do kolby.

Streszczenie

Dorosłe komórki macierzyste są od dawna dyskutowane pod kątem ich zastosowania w medycynie regeneracyjnej. Dorosłe komórki macierzyste wzbudziły wiele emocji w leczeniu uszkodzonych i chorych tkanek ze względu na ich imponujące zdolności do różnicowania komórek wieloliniowych i zdolność do samoodnawiania. Co najważniejsze, cechy te sprawiły, że są one korzystne do stosowania w terapiach autologicznych przeszczepów komórek. Obecny protokół zapozna czytelników ze zmodyfikowaną techniką preplate, w której tkanki miękkie układu mięśniowo-szkieletowego, np. ścięgna i mięśnie, są 1^st enzymatycznie dysocjowane, a następnie umieszczane w kolbach pokrytych kolagenem z podłożem. Supernatant, który składa się z pożywki i pozostałych komórek pływających, jest codziennie seryjnie przenoszony do nowych kolb. Komórki macierzyste najwolniej przylegają do kolb, co zwykle trwa 5-7 dni (transfery seryjne lub płytki wstępne). Dzięki zastosowaniu tej techniki, dorosłe komórki macierzyste obecne w tych tkankach można łatwo pobrać za pomocą dość nieinwazyjnych procedur.

Protokół

Ogólnie rzecz biorąc, kompletna zmodyfikowana procedura preplate wymaga 1-2 dni przygotowania, 1 tygodnia wykonania procedury technicznej, 2-3 dni identyfikacji komórek za pomocą immunocytochemii i dodatkowych 2-3 tygodni ekspansji populacji komórek macierzystych. Sprzęt wymagany do hodowli komórek macierzystych jest podobny do innych systemów hodowli komórkowych, które obejmują wirówkę stołową, inkubator_CO2, kaptur do hodowli tkanek z przepływem laminarnym oraz mikroskop odwrócony wyposażony w fluorescencję i kamerę cyfrową. Wyizolowane komórki macierzyste mogą być również klonowane i mogą być przechowywane przez długi czas w ciekłym azocie do obecnych lub przyszłych badań ^1,2. Wszystkie odczynniki i materiały używane do tej procedury muszą być sterylne i obsługiwane w sposób aseptyczny.

Krok 1: Przygotowanie

1. naczyń i kolb do hodowli tkanek kolagenu: Kolagen typu I pochodzący ze skóry cielęcej (0,1 g w 1 litrze; Sigma-Aldrich). Wyroby z tworzywa sztucznego do powlekania obejmują: kolby T-25, płytki 6 lub 12-dołkowe, szalki (60 i 100 mm, BD Falcon), jak opisano wcześniej 1,2. Delikatnie potrząsaj plastikowym naczyniem co pół godziny, przez 4 godziny, aby zapewnić równomierne pokrycie kolagenu. Roztwór kolagenu jest następnie usuwany. Powlekane naczynia z tworzywa sztucznego pozostawia się następnie do wyschnięcia w kapturze do hodowli tkanek przy świetle UV i kapturze, aby zapewnić sterylność, a na koniec ponownie przykrywa lub przykrywa do późniejszego użycia.
2. Przygotuj pożywkę do hodowli komórkowych: 400 ml DMEM (DMEM, wysoka glukoza; Invitrogen), 50 ml inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej (FBS, Invitrogen), 50 ml surowicy końskiej (HS, Invitrogen) i 5 ml ekstraktu z zarodków piskląt (CEE; Dokładna firma chemiczna Co.) będą filtrowane próżniowo przy użyciu jednorazowego sterylnego systemu filtrów 0,22 μm o pojemności 500 ml (Corning). Sterylny roztwór penicyliny/streptomycyny (Invitrogen) zostanie dodany na koniec 100 jednostek/ml. Przygotowane roztwory można przechowywać w temperaturze 4°C przez co najmniej miesiąc. Roztwór ten służy do odłączania komórek od kolby podczas dzielenia kultur lub przygotowywania komórek do przeszczepu.
3. Roztwory rozgrzewające do izolacji komórek: Następujące odczynniki należy podgrzać do 37°C przed użyciem do izolacji komórek: buforowany roztwór soli Hanka (HBSS, Invitrogen); 0,2% (wag./obj.) kolagenaza typu XI (Sigma-Aldrich), ze średnią 3,200 jednostek trawienia kolagenu na ml HBSS; Rozdzielić 2,4 jednostki/1 ml (Invitrogen); 0,5% (wag./obj.) trypsyna (Invitrogen).
4. Sterylizuj sprzęt chirurgiczny w przygotowaniu: Zabieg chirurgiczny wymaga sterylnych narzędzi chirurgicznych, w tym: kleszczyków o różnych rozmiarach, mikronożyczek, nożyczek do tęczówki i/lub ostrzy skalpela. Dodatkowo polipropylenowe probówki wirówkowe o pojemności 15 i 50 ml (BD Falcon); Sitko do komórek (wielkość porów 70 m) (BD Falcon); igły o rozmiarze 18, 23 i 27 (BD PrecisionGlide); oraz sterylne strzykawki o pojemności 10 lub 20 ml (BD).

Krok 2: Biopsje tkanek, izolacja i dysocjacja mechaniczna^1-4

Biopsje tkanek są wykonywane pod sterylnym kapturem hodowlanym i obejmują świeżo pobrane ścięgna, a mięśnie szkieletowe są uzyskiwane z mięśni piszczelowych lub płaszczkowatych kończyny tylnej myszy typu dzikiego (samica C57BL/6J, 4-5 tygodni lub młodsza, Jackson Laboratory). Wszelka widoczna tkanka łączna, naczynia krwionośne i tkanka tłuszczowa są następnie usuwane z próbek biopsyjnych. Tkanki ścięgien i mięśni są następnie starannie identyfikowane pod mikroskopem chirurgicznym w celu usunięcia resztek skóry i kości i umieszczane w naczyniu zawierającym zimny (4°C) HBSS (uzupełniony dodatkiem 5% FBS). Wyizolowane tkanki są następnie oddzielnie umieszczane na pokrytych kolagenem naczyniach zawierających zimny HBSS i są mielone (<1x1 mm³) na gruboziarnistą zawiesinę za pomocą mikronożyczek i/lub ostrzy skalpela.

Krok 3: Enzymatyczne trawienie tkanek:

Zmielona tkanka jest następnie enzymatycznie dysocjowana przez szereg kroków^2,4,5

1. Przenieś zawiesiny tkanki mielonej do oddzielnych probówek o pojemności 15 ml i odwiruj z prędkością ~3500 obr./min w temperaturze 4 °C przez 5 minut.
2. Usunąć supernatant, przemyć HBSS i ponownie powtórzyć wirowanie.
3. Usunąć supernatant i strawić te zawiesiny, dodając 10 ml wstępnie podgrzanej 0,2% kolagenazy typu XI (Sigma). Inkubować przez 60 minut w temperaturze 37 °C, ciągle delikatnie kołysząc probówkami. Alternatywnie potrząsaj ręką co 10 minut.
4. Odwirować i ponownie zawiesić te zawiesiny w 10 ml roztworu dyspazy (2,4 jednostki/ml, Gibco). Inkubować przez 45 minut w temperaturze 37 °C, potrząsając rękami lub delikatnie kołysząc co 10 minut.
5. Odwirować i ponownie zawiesić te zawiesiny w 10 ml 0,2% roztworu trypsyny HBSS. Inkubacja będzie się różnić w zależności od stopnia, w jakim pojedyncze komórki są uwalniane z tkanek, co można wykonać, obserwując zawiesinę pod mikroskopem. Nie zaleca się przekraczania 30 minut w temperaturze 37 °C z odwracaniem rurek lub delikatnym kołysaniem co 10 minut.
6. Odwirować powstałe komórki i ponownie zawiesić osad komórkowy w 10 ml pożywki proliferacyjnej (PM).
7. Oddziel zawiesinę komórkową, przepuszczając ekstrakt przez szereg igieł. Komórki są następnie przepuszczane 2 razy przez igłę 18G, następnie 23G, a na końcu 27G.
8. Przepuść ekstrakt komórkowy przez sitko do komórek o średnicy 70 μm.

Krok 4: Wstępne powlekanie w celu wyizolowania różnych populacji komórek na podstawie współczynnika adhezji komórek^1-3

1. Odwiruj i ponownie zawieś granulki komórkowe w pożywce proliferacyjnej.
2. Umieść mieszaniny komórek na kolbie T-25 pokrytej kolagenem (lub szalce o średnicy 60 mm) i oznacz ją jako PP1. Zawiesinę komórkową należy obserwować jako zawierającą pod mikroskopem dużą liczbę jąder refrakcyjnych i innych zanieczyszczeń.
3. Inkubować w temperaturze 37 °C w nawilżanym inkubatorze o stężeniu 5%_{CO2 przez} 2 godziny.
4. Przenieś nieprzylegające komórki do nowej kolby T-25 pokrytej kolagenem (lub szalki 60 mm) i oznacz jako PP2. Dodać 5 ml PM do płytki oznaczonej PP1. Wczesne przylegające komórki, które przyczepiają się do kolby, to głównie miofibroblasty³.
5. Umieścić kolby z powrotem w inkubatorze na kolejne 24 godziny, przenieść nieprzyrodzone komórki do nowej kolby T-25 pokrytej kolagenem (lub szalki) i oznaczyć ją jako PP3. Dodać 5 ml pożywki do proliferacji na płytkę oznaczoną PP2. Te przylegające komórki, które przyczepiają się do tej kolby, to głównie fibroblasty^2,3.
6. Kolby należy umieścić z powrotem w inkubatorze i powtarzać procedurę w ciągu kolejnych 24 godzin, aż do utworzenia populacji PP6. Utrzymuj każdą grupę zawieszonych komórek i pozwól im się rozmnażać, badając je regularnie za pomocą odwróconego mikroskopu. PP3-PP4 to głównie mioblasty, podczas gdy komórki satelitarne mięśni są często widoczne głównie w PP5 ².
7. Większość wolno przylegających komórek zwykle przyłącza się przez PP6. Na tym etapie komórki wydają się małe, okrągłe, załamują światło i są bardzo rzadkie i uważa się je za populację komórek macierzystych 1,2.

Krok 5: Identyfikacja i ekspansja izolowanych komórek macierzystych

1. Izolowane komórki PP6 są bardzo nieliczne i muszą być utrzymywane w pożywce proliferacyjnej bogatej w FBS (20% FBS w DMEM), która jest codziennie zmieniana. Większość komórek obecnych w kulturze PP6 umiera w ciągu kolejnych 1-2 tygodni hodowli, ale duża, zdrowa populacja PP6 jest zwykle tworzona po dodatkowych 1-2 tygodniach ekspansji. Komórki macierzyste wyizolowane od myszy wykazują wysoką ekspresję antygenu komórek macierzystych 1 (Sca1), CD34, płodowej kinazy wątrobowej 1 (Flk1) i innych markerów macierzystych^1,2,6,7, które można uwidocznić za pomocą barwienia immunocytochemicznego. Te komórki macierzyste wykazują również wielorakie zdolności różnicowania^3,6,8.
2. Wyizolowane komórki są utrzymywane i namnażane przy niskiej gęstości komórek w hodowli (12-dołkowe szalki przy 50-100 komórkach/dołku lub <20-30% konfluencji w kolbie lub szalce), aby uniknąć różnicowania ^1,2. Bardzo niewiele komórek tworzy klony podczas ekspansji, a te sklonowane komórki macierzyste mogą zostać poddane długotrwałej proliferacji (LTP) w przypadku innych badań kompetencyjnych. Sklonowane komórki macierzyste mogą być również przechowywane w ciekłym azocie przy użyciu ogólnych procedur przechowywania komórek, np. pożywki PM z 10% DMSO. Zrób pewną liczbę zapasów komórek macierzystych o niskim pasażu do wszelkich innych badań zapasowych.

Dyskusja

Stwierdzono, że niektóre dorosłe tkanki zawierają wiele komórek macierzystych. W ciągu ostatnich kilku lat badań wykryto komórki macierzyste w miękkich tkankach mięśniowo-szkieletowych, w tym w mięśniach szkieletowych i ścięgnach. Ten obecny protokół szczegółowo opisuje procedurę, znaną jako zmodyfikowana technika preplate, która została z powodzeniem zastosowana w naszym laboratorium do izolowania dorosłych komórek macierzystych ze ścięgien i mięśni szkieletowych. Korzystając z opisanej powyżej zmodyfikowanej techniki p...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
DMEM	Invitrogen	#11995-073
FBS	Invitrogen	#10437-028
Inaktywowana termicznie surowica konia	Invitrogen	#26050-088
Ekstrakt z zarodków piskląt	Dokładny chemiczny	#CE650T-10
100U ml penicyliny/streptomycyny	Invitrogen	#15140-122
Dulbecco's PBS	Invitrogen	#14190-250
Buforowany roztwór soli Hanka	Invitrogen	#24020-117
Kolagenaza typu XI 0,2%(wt/vol)	Sigma-Aldrich	#C7657
Dispase2.4U ml	Invitrogen	#17105-041
Trypsyna-EDTA0,5%(wag./obj.) (10x; 5g litr trypsyny (1:250)	Invitrogen	#15400-054
Kolagen do kolby powlekającej: Kolagen typu I pochodzący ze skóry cielęcej 0,1 g litr	Sigma-Aldrich	#C-9791
DMSO	Sigma	#D-2650