Method Article

Izolowanie komórek macierzystych z miękkich tkanek układu mięśniowo-szkieletowego

DOI:

10.3791/2011

⸱

July 5th, 2010

 ,  , 
1Stem Cell Research Center, Childrens Hospital of Pittsburgh of UPMC, 2Department of Bioengineering, University of Pittsburgh, 3Department of Orthopedic Surgery, University of Pittsburgh, 4Department of Pathology, University of Pittsburgh, 5Department of Molecular Genetics & Biochemistry, University of Pittsburgh

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Izolowanie dorosłych komórek macierzystych z tkanek miękkich układu mięśniowo-szkieletowego na podstawie szybkości przylegania komórki do kolby.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Dorosłe komórki macierzyste są od dawna dyskutowane pod kątem ich zastosowania w medycynie regeneracyjnej. Dorosłe komórki macierzyste wzbudziły wiele emocji w leczeniu uszkodzonych i chorych tkanek ze względu na ich imponujące zdolności do różnicowania komórek wieloliniowych i zdolność do samoodnawiania. Co najważniejsze, cechy te sprawiły, że są one korzystne do stosowania w terapiach autologicznych przeszczepów komórek. Obecny protokół zapozna czytelników ze zmodyfikowaną techniką preplate, w której tkanki miękkie układu mięśniowo-szkieletowego, np. ścięgna i mięśnie, są 1st enzymatycznie dysocjowane, a następnie umieszczane w kolbach pokrytych kolagenem z podłożem. Supernatant, który składa się z pożywki i pozostałych komórek pływających, jest codziennie seryjnie przenoszony do nowych kolb. Komórki macierzyste najwolniej przylegają do kolb, co zwykle trwa 5-7 dni (transfery seryjne lub płytki wstępne). Dzięki zastosowaniu tej techniki, dorosłe komórki macierzyste obecne w tych tkankach można łatwo pobrać za pomocą dość nieinwazyjnych procedur.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ogólnie rzecz biorąc, kompletna zmodyfikowana procedura preplate wymaga 1-2 dni przygotowania, 1 tygodnia wykonania procedury technicznej, 2-3 dni identyfikacji komórek za pomocą immunocytochemii i dodatkowych 2-3 tygodni ekspansji populacji komórek macierzystych. Sprzęt wymagany do hodowli komórek macierzystych jest podobny do innych systemów hodowli komórkowych, które obejmują wirówkę stołową, inkubatorCO2, kaptur do hodowli tkanek z przepływem laminarnym oraz mikroskop odwrócony wyposażony w fluorescencję i kamerę cyfrową. Wyizolowane komórki macierzyste mogą być również klonowane i mogą być przechowywane przez długi czas w ciekłym azocie do obecnych lub....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Stwierdzono, że niektóre dorosłe tkanki zawierają wiele komórek macierzystych. W ciągu ostatnich kilku lat badań wykryto komórki macierzyste w miękkich tkankach mięśniowo-szkieletowych, w tym w mięśniach szkieletowych i ścięgnach. Ten obecny protokół szczegółowo opisuje procedurę, znaną jako zmodyfikowana technika preplate, która została z powodzeniem zastosowana w naszym laboratorium do izolowania dorosłych komórek macierzystych ze ścięgien i mięśni szkieletowych. Korzystając z opisanej powyżej zmodyfikowanej techniki p.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy są bardzo wdzięczni Pani Haiying Pan i Panu Ianowi Bellayrowi za ich pomoc techniczną w izolacji komórek do obecnych filmów oraz Panu Kyle'owi Holdenowi i Panu Jonathanowi Lucasowi za pomoc w edycji slajdów. Serdeczne podziękowania dla poniższej listy osób, które były zaangażowane w rozwój zmodyfikowanych technik preplate w ciągu ostatnich lat: Drs. Burhan Gharaibeh, BaoHong Cao, Deasy Bridget, Thomas R. Payne, Aiping Lu, Hairong Peng, Hideki Oshima, Bo Zeng, Xiaodong Mu, Kimimasa Tobita, Ron Jankowski, Makato Ikezawa. Jesteśmy wdzięczni za pomoc techniczną ze strony Jamesa H. Cumminsa, Ryana Pruchnica, Josepha Feduski, Rebecci C. Schugar, Haiying Pan i Jessik....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
DMEMInvitrogen#11995-073
FBSInvitrogen#10437-028
Inaktywowana termicznie surowica koniaInvitrogen#26050-088
Ekstrakt z zarodków pisklątDokładny chemiczny#CE650T-10
100U ml penicyliny/streptomycynyInvitrogen#15140-122
Dulbecco's PBSInvitrogen#14190-250
Buforowany roztwór soli HankaInvitrogen#24020-117
Kolagenaza typu XI 0,2%(wt/vol)Sigma-Aldrich#C7657
Dispase2.4U mlInvitrogen#17105-041
Trypsyna-EDTA0,5%(wag./obj.) (10x; 5g litr trypsyny (1:250)Invitrogen#15400-054
Kolagen do kolby powlekającej: Kolagen typu I pochodzący ze skóry cielęcej 0,1 g litrSigma-Aldrich#C-9791
DMSOSigma#D-2650

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gharaibeh, B. Isolation of a slowly adhering cell fraction containing stem cells from murine skeletal muscle by the preplate technique. Nat Protoc. 3, 1501-1509 (2008).
  2. Qu-Petersen, Z. Identificatio....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Stem Cell IsolationMusculoskeletal TissueEnzymatic DigestionPreplate TechniqueCollagen Coated FlaskCell DissociationFlow CytometryImmunofluorescenceMicroscopyProliferation Medium

Related Articles