Protokół ten jest zaczerpnięty z Teoh i in., Ilościowe podejścia do badania struktur komórkowych i morfologii organelli w Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2019).
Przygotowanie preparatów do obrazowania
- Przygotuj 3-4% w/v bulionu agarozowego w butelce nadającej się do kuchenki mikrofalowej (3-4 g w 100 ml ultraczystej wody).
UWAGA: Agar może być stosowany zamiast agarozy w tym samym stężeniu.
- Ostrożnie rozpuść agarozę w kuchence mikrofalowej, uważając, aby nie przegotować, aż cała agaroza się rozpuści (klarowny roztwór). Roztwór należy przechowywać w temperaturze 70 °C, aby zapobiec krzepnięciu.
UWAGA: Bulion agarozowy można stosować wielokrotnie. Podgrzej ponownie przed użyciem, jeśli agaroza zastygła.
- Za pomocą pipety Pasteura umieść kroplę stopionej agarozy na szkiełku mikroskopowym.
UWAGA: Unikaj pęcherzyków powietrza w kropli agaru, ponieważ naruszają one integralność podkładki.
- Natychmiast dociśnij kroplę agarozy innym szkiełkiem mikroskopowym, delikatnie spłaszczając agarozę w podkładkę między dwoma szkiełkami.
UWAGA: Na tym etapie należy usunąć wszelkie resztki bąbelków. Jeśli nie, należy wykonać nowe zjeżdżalnie, ponieważ zwierzęta mogą łatwo utknąć w bąbelkach. Unikaj przelewania się agaru na bok podczas naciskania na szkiełko.
- Pozostaw agarozę do wyschnięcia na 1 minutę.
- Ostrożnie oddziel oba szkiełka, aby uniknąć uszkodzenia agarozy, pozostawiając zestaloną podkładkę na jednym ze szkiełek.
UWAGA: Szkiełka z płatkami agarozowymi powinny być zawsze przygotowywane świeże tuż przed eksperymentem, ponieważ mogą wyschnąć. Upewnij się, że podkładka agarozowa ma stałą grubość. W podkładce nie powinno być pęcherzyków powietrza ani pęknięć, ponieważ może to zakłócać obrazowanie.
- Dodaj małą kroplę (5-10 μl) 0,05% chlorowodorku tetramizolu (środka znieczulającego) do środka wacika agarozowego.
- Za pomocą sterylizowanego termicznie kilofa szybko przenieś około 10 – 15 zwierząt z talerza podstawowego do kropli znieczulającej, zanim roztwór wyschnie. Unikaj przenoszenia zbyt dużej ilości bakterii OP50, ponieważ powoduje to zmętnienie roztworu, co może zakłócać obrazowanie.
UWAGA: Jeśli roztwór znieczulający wyschnie podczas zbierania, po prostu odpipetuj drugą kroplę 0,05% chlorowodorku tetramizolu na zwierzęta. Zwierzęta mają tendencję do leżenia na boku w roztworze znieczulającym.
- Nałóż szkiełko nakrywkowe, umieszczając je tuż nad podkładką agarozową i delikatnie upuszczając w dół. Zapobiegnie to tworzeniu się pęcherzyków. Nie należy wywierać nacisku na szkiełko nakrywkowe, ponieważ może to zmiażdżyć zwierzęta.
- Oznacz slajdy nazwą szczepu.