Technika cienkiej okienkowej czaszki do przewlekłego obrazowania dwufotonowego in vivo mikrogleju mysiego w modelach neurozapalenia

Podsumowanie

Opisujemy metodę wielokrotnej wizualizacji mikrogleju mysiego oraz monocytów krążących in vivo w czasie liczonym w godzinach, dniach lub tygodniach, z wykorzystaniem transkranialnej mikroskopii dwufotonowej. Demonstrujemy sposób przygotowania okna z cienkiej czaszki, które umożliwia przerywaną obserwację spoczywającego mikrogleju, który może zostać aktywowany poprzez sąsiednią stereotaktyczną iniekcję białka regulatorowego Tat wirusa HIV-1.

Streszczenie

Tradycyjnie w neuronauce obrazowanie dwufotonowe in vivo ośrodkowego układu nerwowego myszy opierało się na zastosowaniu preparatów z otwartą czaszką^1,2 lub z cieńszą czaszką ³. Chociaż technika otwartej czaszki jest bardzo wszechstronna, nie jest ona optymalna do badania mikrogleju, ponieważ jest inwazyjna i może powodować aktywację mikrogleju. Mimo że podejście z cieńszą czaszką jest minimalnie inwazyjne, powtarzane ścieńczanie czaszki wymagane przy obrazowaniu chronicznym zwiększa ryzyko uszkodzenia tkanek i aktywacji mikrogleju oraz pozwala na ograniczoną liczbę sesji obrazowania. Przedstawiamy tutaj metodę chronicznego okna z cienką czaszką do monitorowania mikrogleju mysiego in vivo przez dłuższy czas przy użyciu mikroskopii dwufotonowej. Demonstrujemy, jak przygotować stabilne, dostępne okno korowe z cieńszą czaszką (TSCW) z przyłożoną szklaną lamką, która pozostaje przezroczysta w ciągu trzech tygodni przerywanej obserwacji. Preparat TSCW jest znacznie bardziej obojętny immunologicznie pod kątem aktywacji mikrogleju niż otwarta kraniotomia lub powtarzane ścieńczanie czaszki i pozwala na dowolną liczbę sesji obrazowania w okresie wielu tygodni. Przygotowujemy TSCW u myszy CX₃CR₁ GFP/+ ⁴, aby wizualizować mikroglej z wzmocnionym zielonym białkiem fluorescencyjnym do głębokości ≤150 μm poniżej powierzchni opony miękkiej. Wykazujemy również, że preparat ten można stosować w połączeniu ze stereotaktycznymi iniekcjami do mózgu neurotoksycznego białka Tat wirusa HIV-1, w sąsiedztwie TSCW, które jest zdolne do indukowania trwałej mikroglejozy. Zatem metoda ta jest niezwykle użyteczna do badania zmian w morfologii i ruchliwości mikrogleju w czasie w żywym mózgu w modelach zaburzeń neuropoznawczych związanych z HIV (HAND) oraz innych chorób neurodegeneracyjnych z komponentem neurozapalnym.

Protokół

1. Przygotowanie zwierzęcia do obrazowania

1. W naszych eksperymentach wykorzystujemy dorosłe myszy CX₃CR₁GFP/+, które wykazują ekspresję GFP w liniach komórek jednojadrowych, w tym w mikrogleju.⁴ W zależności od potrzeb konkretnego projektu można zastosować różne szczepy myszy.
2. Zanurz mysz w narkozie poprzez podanie dosutrytonalnie koktajlu trzech leków składającego się z 0,05 mg/kg Fentanylu, 5,0 mg/kg Midazolamu oraz 0,5 mg/kg Medetomidyny.⁵ Przygotowanie chirurgiczne do TSCW rozpoczyna się, gdy zwierzę przestaje reagować na bodźce bólowe, takie jak uciśnięcie ogona. Przez cały czas trwania operacji i obrazowania zwierzę pozostaje na podgrzewanej podkładce, aby zapobiec hipotermii po znieczuleniu. W razie potrzeby można podać dawkę przypominającą w ilości jednej trzeciej dawki pierwotnej koktajlu anestetycznego, aby przywrócić pierwotną płaszczyznę znieczulenia.
3. Oczy zwierzęcia należy pokryć ochronną maścią oftalmiczną, aby utrzymać ich wilgotność podczas znieczulenia, które znosi odruch mrugania. Usuń owłosienie ze skóry głowy zwierzęcia za pomocą maszynki, trymera, nożyczek lub metod chemicznych. Zdezynfekuj skórę głowy, używając 10% roztworu powidonu z jodem i 70% etanolu. Wszystkie instrumenty chirurgiczne muszą zostać poddane autoklawowaniu, sterylizacji w sterylizatorze koralikowym lub dezynfekcji 70% etanolem.
4. Wykonaj nacięcie w linii środkowej skóry głowy za pomocą małych nożyczek, zaczynając 4-5 mm gorszo (kaudalnie) od czaszki i przesuwając się do przodu, aż do przedniej części oczu. Ważne jest, aby nacięcie było wystarczająco długie, tak aby skóra nie przeszkadzała w przyklejaniu płytki głowowej służącej do stabilizacji głowy myszy podczas obrazowania dwufotonowego (Rycina 1). Zidentyfikuj obszar do ścienienia pod stereomikroskopem. Unikaj obszarów zainteresowania znajdujących się bezpośrednio nad szwami czaszkowymi, ponieważ czaszka jest w tych miejscach mniej stabilna, a leżące pod nimi duże naczynia i opony mózgowe będą utrudniać obrazowanie.
5. Za pomocą sterylnego patyczka watowego nanieś 100% etanol, a następnie 10% roztwór chlorku żelaza, aby wysuszyć błony na szczycie czaszki, a następnie zeskrob je za pomocą precyzyjnej pęsety lub żyletki. Nieusunięcie błon prowadzi do niestabilnego przytwierdzenia płytki głowowej.
6. Nałóż cienką warstwę kleju Permabond 910 wokół krawędzi okna obserwacyjnego pod płytką głowową. Przyciśnij lekko płytkę głowową pokrytą klejem do obszaru zainteresowania na czaszce zwierzęcia (Rycina 1). Ważne jest, aby płytka głowowa była przyklejona wyłącznie do kości czaszki. Jakakolwiek skóra lub błony, które dostaną się między płytkę a czaszkę, zmniejszą stabilność wiązania. Za pomocą strzykawki nanieś niewielką ilość akrylatu wokół okna obserwacyjnego, aby natychmiast utrwalić klej. Na koniec nanieś niewielką ilość Loctite 454 na krawędzie okna obserwacyjnego, aby zapobiec wyciekom.
7. Przykręć płytkę głowową do uchwytu zwierzęcia (Rycina 1) i sprawdź stabilność płytki pod stereomikroskopem, delikatnie sondując ją pęsetą. Czaszka nie powinna przemieszczać się względem płytki głowowej. Na okno obserwacyjne nanieś kroplę soli fizjologicznej, aby upewnić się, że nie ma wycieków.

2. Przygotowanie okna korowego z odcieńczoną czaszką

1. W ramach przygotowania do cieńczenia czaszki należy ją osuszyć, używając jałowych patyczków bawełnianych oraz sprężonego powietrza. Początkowo cieńczymy czaszkę za pomocą jałowego wiertła IRF 007 w wiertarce Microtorque II ustawionej na 4000 rpm. Bardzo delikatnie rozpoczynamy cieńczenie okrągłego obszaru czaszki o średnicy 2-2,5 mm. Należy stosować wyłącznie lekkie ruchy zamiatające, niemal równoległe do powierzchni czaszki; nie należy wywierać bezpośredniego nacisku w dół. Wiercenie należy przerywać co 20-30 sekund, aby usunąć pył kostny za pomocą sprężonego powietrza. Przerwy w wierceniu pozwalają czaszce ostygnąć, co zapobiega uszkodzeniom tkanki mózgowej pod nią wywołanym przez ciepło.
   1. W miarę postępów wiercenia należy zwrócić uwagę na przejście do bardziej wilgotnej warstwy kości gąbczastej (tj. „diploe”). Po dotarciu do tej warstwy należy zachować szczególną ostrożność podczas wiercenia.
2. Okazyjnie należy sprawdzać stopień cieńczenia czaszki, nakładając sól fizjologiczną na cieńczony obszar i obserwując go pod stereomikroskopem. Sól fizjologiczna dodatkowo wspomaga odprowadzanie ciepła. W miarę cieńczenia czaszki widoczne stają się mniejsze naczynia krwionośne.
3. Aby uzyskać ostateczną grubość, należy użyć jałowego mikroostrza dentystycznego w obecności soli fizjologicznej, ponieważ mikroostrze zapewnia znacznie lepsze sprzężenie zwrotne w dotyku w kwestii stabilności czaszki. Pozwala to na przygotowanie znacznie cieńszych okien niż przy użyciu samego wiertła. Z naszego doświadczenia wynika, że optymalna grubość czaszki wynosi 10-30 μm.
   1. Ważne jest, aby podczas pierwszych kilku prób tworzenia okna w czaszce wielokrotnie sprawdzać stopień cieńczenia pod mikroskopem epifluorescencyjnym. Ostrość i głębokość widocznych mikroglejów oraz naczyń krwionośnych dają dobry sygnał, że okno jest gotowe do obrazowania.
4. Gdy okno jest gotowe, należy przykleić nad nim specjalnie przygotowany prostokątny kawałek szkiełka nakrywkowego #0 o wymiarach mniejszych niż 2 mm z każdej strony. Używając szklanej pipety o średnicy 1,0 mm, należy nanieść małą kroplę kleju cyjanoakrylowego na cieńczony obszar czaszki i ostrożnie opuścić mały kawałek szkiełka, a następnie delikatnie docisnąć go do czaszki, aby wycisnąć nadmiar kleju. Ważne jest, aby uniknąć powstania pęcherzyków powietrza między szkłem a klejem, ponieważ uwięzione powietrze spowoduje, że obszar pod nim stanie się optycznie nieprzezroczysty. Klej cyjanoakrylowy jest stosowany, ponieważ pozostaje przezroczysty po wyschnięciu, a także zapobiega odrastaniu kości i błon, utrzymując czaszkę pod oknem cienką i półprzezroczystą. Jeśli na górze szkiełka nakrywkowego znajdzie się klej, należy go ostrożnie usunąć mikroostrzem po umieszczeniu szkiełka i wyschnięciu kleju.
5. Bezpośrednio po zabiegu podaje się lek przeciwbólowy (np. buprenorfinę 2 mg/kg podskórnie), a następnie powtarza się podanie przy wszelkich oznakach bólu, w tym przy niechęci do poruszania się, jedzenia lub picia, utracie masy ciała, ślinotoku, piloerekcji, słyszalnych dźwiękach oddechowych itp.

3. Obrazowanie dwufotonowe

1. W ramach przygotowania do obrazowania dwufotonowego, pokryj TSCW solą fizjologiczną i zlokalizuj obszar zainteresowania w świetle epifluorescencyjnym (Rysunek 2). Aby umożliwić późniejsze obrazowanie tego obszaru, wykonaj zdjęcie za pomocą aparatu fotograficznego.
2. Do obrazowania dwufotonowego wykorzystujemy specjalnie zbudowany mikroskop dwufotonowy⁶ z laserem Ti:Szafir nastrojonym na 920 nm. Fluorescencję wykrywa się przy użyciu lampy fotopowielącej w trybie detekcji całego pola oraz filtra emisyjnego 580/180. Przez całą sesję obrazowania stosowany jest obiektyw imersyjny z soczewką wodną 20X (0.95 N.A.). Maksymalna moc wyjściowa lasera na obiektywie jest ustawiona w zakresie od 50 do 65 mW.
3. Wybierz obszar zainteresowania w warstwie I lub II kory (do 150 μm poniżej powierzchni pialnej). Aby ułatwić ponowne obrazowanie, wykonaj zdjęcia tego samego pola widzenia przy cyfrowym powiększeniu 1X, 2X i 3X. Naczynia krwionośne mogą służyć jako punkty orientacyjne, ułatwiające odnalezienie tego samego pola widzenia podczas kolejnych sesji obrazowania. Przy powiększeniu 3X można co 5 minut przez maksymalnie 30 minut pozyskiwać serie obrazów z-stack z 80-90 krokami Z w każdym stosie i krokiem 0.69 μm, co pozwala na dobre próbkowanie morfologii i zachowania mikrogleju w czasie (Rysunek 3). Pomiędzy akwizycjami z-stacków należy sprawdzać poziom soli fizjologicznej nad TSCW oraz głębokość znieczulenia zwierzęcia.

4. Iniekcja neurotoksyny HIV-1, Tat

1. W pierwszej kolejności należy przeprowadzić silanizację wewnętrznej ścianki igły o rozmiarze 35 G oraz strzykawki Microvolume o pojemności 10 μL, aby zapobiec osadzaniu się Tat. Należy pobrać roztwór do silanizacji (Sigmacote), aż wypełni on zarówno igłę, jak i strzykawkę. Roztwór powinien pozostać w naczyniu przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Następnie należy opróżnić strzykawkę z roztworu, wyjąć tłok i pozwolić strzykawce oraz igle całkowicie wyschnąć. Na koniec należy dokładnie wypłukać strzykawkę i igłę wodą dejonizowaną.
2. Należy wykonać małą kraniotomię o średnicy 0,5 mm, w odległości 3 mm rostralnie lub bocznie od TSCW, w miejscu, gdzie pobrano obrazy dwufotonowe, używając mniejszego wiertła i ostrożnie cieńcząc czaszkę, aż do momentu, gdy cienką warstwę kości będzie można łatwo usunąć za pomocą pincety z ostrymi końcówkami. Stosujemy strzykawkę Microvolume o pojemności 10 μL z igłą 35 G, sterowaną za pomocą pompy strzykawkowej Ultramicropump III zamontowanej na trójosiowym mikromanipulatorze. Po ustawieniu końcówki igły w miejscu kraniotomii, należy ją ostrożnie wprowadzić na głębokość od 700 do 900 μm poniżej powierzchni opony miękkiej, gdzie podaje się 3 μL Tat_1-72 (lub inne czynniki prozapalne) lub sól fizjologiczną (lub kontrolny nośnik) z prędkością 80 nL/min.

5. Zakwaterowanie zwierząt

1. Jeśli zwierzę ma być poddawane obrazowaniu wielokrotnie w ciągu jednego dnia, należy pokryć odsłonięty obszar czaszki mieszanką maści oftalmicznej i wazeliny, aby zapobiec dyskomfortowi lub uszkodzeniu czaszki pomiędzy sesjami obrazowania. Odłączyć mostek wspierający od małej płytki głownej (patrz Rysunek 1B) i umieścić zwierzę w ogrzewanej klatce z łatwo dostępną wodą i pokarmem. Wszystkie zwierzęta po operacji muszą być przez cały czas utrzymywane pojedynczo. Po zakończeniu sesji obrazowania danego zwierzęcia w określonym dniu, należy ostrożnie usunąć całą płytkę główną i zaszyć skórę nad czaszką, używając nici chirurgicznej o rozmiarze #6 lub mniejszej. Ponownie należy utrzymywać zwierzęta pojedynczo z łatwo dostępną wodą i pokarmem pomiędzy dniami eksperymentalnymi. Codziennie sprawdzać zwierzęta pod kątem wszelkich oznak stresu, bólu lub infekcji.

6. Reprezentatywne wyniki

Rycina 1. Stabilizacja zwierzęcia do zabiegu chirurgicznego i obrazowania dwufotonowego (A) oraz konstrukcja płytki głowowej (B).

Rycina 2. Mikroglej znakowany GFP wizualizowany za pomocą epifluorescencji.

Rycina 3. Mikrogliia znakowana GFP wizualizowana za pomocą obrazowania dwufotonowego po implantacji TSCW, około 50 μm poniżej powierzchni pialnej. Pojedyncze przekroje dwufotonowe wykonane 15–30 minut po implantacji TSCW (dzień 0), a także 7 i 17 dni później, wykazują, że okna pozostają przejrzyste, podczas gdy mikroglia pozostaje nieaktywna w przypadku braku bodźców zapalnych. Projekcje z wykonane 6 i 24 godziny po wstrzyknięciu neurotoksyny tat wirusa HIV wykazują znaczące zmiany morfologiczne aktywnej mikroglii. Pasek skali: 10 μm.

Dyskusja

Rośnie przekonanie, że faktycznym podłożem deficytów neuropoznawczych związanych z HIV-1 (HAND) jest destrukcja architektury synaptycznej, prawdopodobnie wywołana przez mediatory prozapalne uwalniane z zainfekowanych HIV-1 fagocytów jednojadrowych. Aktywacja mikrogleju, wielojądrowe komórki olbrzymie oraz glioza wynikająca z hipertrofii astrocytów są uważane za nieswoiste cechy charakterystyczne dla infekcji HIV-1 i stanu zapalnego w OUN ⁷. W przeciwieństwie do nich, ciężkość przedśmiertnej choroby neurologicznej skorelowano z utratą złożoności synaptycznej, a także z obciążeniem makrofagami w OUN ^8,9,10,11. Jednakże dynamiczne interakcje między mikroglejem, naciekającymi makrofagami obwodowymi a neuronami u pacjentów z HAND nie mogą być modelowane przy użyciu konwencjonalnego przetwarzania statycznego uzyskiwanego z tradycyjnych badań immunocytochemicznych. Niedawne badania w naszych laboratoriach zasugerowały, że przynajmniej niektóre z tych interakcji między obwodowymi i centralnymi komórkami jednojadrowymi a neuronami mogą być częściowo modelowane poprzez stereotaktyczną iniekcję białka Tat_1-72 HIV-1 do miąższu mózgu (Lu, Marker, Tremblay, Qi oraz Gelbard, dane nieopublikowane). Zdecydowaliśmy się zatem zastosować obrazowanie dwufotonowe in vivo, aby zbadać współdziałanie między makrofagami pochodzącymi z monocytów, mikroglejem rezydentnym w mózgu a neuronami w łatwym w obsłudze modelu neuroAIDS u małych zwierząt. Podczas gdy preparaty z otwartą czaszką lub z cienką czaszką umożliwiają jednorazowe badanie architektury kory przez krótki czas (godziny), badacze zainteresowani przebiegiem zdarzeń podostrych nie mogą stosować tych preparatów bez artefaktycznej aktywacji mikrogleju/makrofagów w wyniku chirurgicznej manipulacji oknem czaszkowym. Tutaj demonstrujemy prosty sposób obejścia tych ograniczeń poprzez przyklejenie małego kawałka szkiełka nakrywowego nad obszarem cienkiej czaszki, co zapobiega regeneracji sklepienia czaszki w TSCW oraz utrzymuje przezroczystość przez ≥3 tygodnie. Wykazujemy ponadto, że technika ta pozwala nam monitorować zachowanie monocytów obwodowych wnikających do mikrokrążenia mózgowego, a także mikrogleju rezydentnego w mózgu w odpowiedzi na stereotaktyczną iniekcję HIV Tat_1-72 do kory myszy heterozygotycznych dla CX₃CR₁/GFP (w celu identyfikacji komórek linii jednojadrowej). Technikę tę można łatwo dostosować do myszy o innym tle genetycznym; na przykład rutynowo stosujemy myszy heterozygotyczne CX₃CR₁/GFP X Thy-1 YFP ¹² do badania interakcji między makrofagami pochodzącymi z monocytów, mikroglejem rezydentnym w mózgu a neuronami w modelach in vivo neurozapalenia istotnych dla HAND. Nasz preparat TSCW pozwala badaczom badać interakcje międzykomórkowe między obwodem a OUN, które mogą występować w okresie wielu tygodni, podczas których zwierzę może być wielokrotnie obrazowane przed i po leczeniu eksperymentalnym. W ten sposób każde zwierzę może służyć jako własna kontrola. Jedynym zastrzeżeniem dla tego modelu TSCW jest to, że badane komórki docelowe muszą być albo genetycznie zmodyfikowane w celu ekspresji ulepszonych białek fluorescencyjnych (eXFP), albo znakowane barwnikiem fluorescencyjnym bez mechanicznego naruszania sklepienia czaszki; ponadto ekspresja eXFP musi być wystarczająco silna, aby umożliwić wizualizację architektury komórkowej po wielokrotnych sesjach obrazowania w okresie wielu tygodni.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Cytrynian fentanylu	Hospira Inc.
Wodorochlorek midazolamu	Baxter International Inc.
hydrochlororek medetomidyny (Domitor)	Pfizer Pharma GmbH
Podkładki grzewcze	Poza ciepłem ciała
Maść do oczu z tobramycyną i deksametazonem (TobraDex)	Alcon
10% roztwór powidonu z jodem	Betadine Puredue Pharma
10% roztwór chlorku żelaza(III)	Ricca Chemical Company	3120-32
Cyjanoakrylan metylowy 910	Permabond
Cyjanoakrylan 454	Loctite
sieciowanie materiału protetycznego TEETS metakrylan metylu	Co-Oral-lte Dental Mfg CO
Zestaw końcówek Microtorque II	Testy Pearsona	R14-0002
Wiertła IRF 007	Fine Science Tools	19008-07
mikroostrzyże Norland z pełnym promieniem, wyginalne	Salvin Dental	BLAD-NORLAND-69
Cyjanoakrylan	Oryginalny superklej
szkiełko podstawowe nr 0	Electron Microscopy Sciences	63750-01
10 μStrzykawka mikrolitrowa	World Precision Instruments, Inc.	ILS010LT
UltraMicroPump III	World Precision Instruments, Inc.	UMP3-1
igła NanoFil 35 G	World Precision Instruments, Inc.	NL35BL-2
Młyn kulowy, wiertła węglikowe 1/4"	World Precision Instruments, Inc.	501860
Sigmacote	Sigma-Aldrich	SL2-100
Pomnożnik fotonowy	Hamamatsu Corp.	HC125-02
Laser tytano-szafirowy Mai-Tai	Newport Corp.