Opisujemy metodę wielokrotnej wizualizacji mikrogleju mysiego oraz monocytów krążących in vivo w czasie liczonym w godzinach, dniach lub tygodniach, z wykorzystaniem transkranialnej mikroskopii dwufotonowej. Demonstrujemy sposób przygotowania okna z cienkiej czaszki, które umożliwia przerywaną obserwację spoczywającego mikrogleju, który może zostać aktywowany poprzez sąsiednią stereotaktyczną iniekcję białka regulatorowego Tat wirusa HIV-1.
Artykuł metodologiczny
Technika cienkiej okienkowej czaszki do przewlekłego obrazowania dwufotonowego in vivo mikrogleju mysiego w modelach neurozapalenia
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Tradycyjnie w neuronauce obrazowanie dwufotonowe in vivo ośrodkowego układu nerwowego myszy opierało się na zastosowaniu preparatów z otwartą czaszką1,2 lub z cieńszą czaszką 3. Chociaż technika otwartej czaszki jest bardzo wszechstronna, nie jest ona optymalna do badania mikrogleju, ponieważ jest inwazyjna i może powodować aktywację mikrogleju. Mimo że podejście z cieńszą czaszką jest minimalnie inwazyjne, powtarzane ścieńczanie czaszki wymagane przy obrazowaniu chronicznym zwiększa ryzyko uszkodzenia tkanek i aktywacji mikrogleju oraz pozwala na ograniczoną liczbę sesji obrazowania. Przedstawiamy tutaj metodę chronicznego okna z cienką czaszką do monitorowania mikrogleju mysiego in vivo przez dłuższy czas przy użyciu mikroskopii dwufotonowej. Demonstrujemy, jak przygotować stabilne, dostępne okno korowe z cieńszą czaszką (TSCW) z przyłożoną szklaną lamką, która pozostaje przezroczysta w ciągu trzech tygodni przerywanej obserwacji. Preparat TSCW jest znacznie bardziej obojętny immunologicznie pod kątem aktywacji mikrogleju niż otwarta kraniotomia lub powtarzane ścieńczanie czaszki i pozwala na dowolną liczbę sesji obrazowania w okresie wielu tygodni. Przygotowujemy TSCW u myszy CX3CR1 GFP/+ 4, aby wizualizować mikroglej z wzmocnionym zielonym białkiem fluorescencyjnym do głębokości ≤150 μm poniżej powierzchni opony miękkiej. Wykazujemy również, że preparat ten można stosować w połączeniu ze stereotaktycznymi iniekcjami do mózgu neurotoksycznego białka Tat wirusa HIV-1, w sąsiedztwie TSCW, które jest zdolne do indukowania trwałej mikroglejozy. Zatem metoda ta jest niezwykle użyteczna do badania zmian w morfologii i ruchliwości mikrogleju w czasie w żywym mózgu w modelach zaburzeń neuropoznawczych związanych z HIV (HAND) oraz innych chorób neurodegeneracyjnych z komponentem neurozapalnym.
Protokół
1. Przygotowanie zwierzęcia do obrazowania
- W naszych eksperymentach wykorzystujemy dorosłe myszy CX3CR1GFP/+, które wykazują ekspresję GFP w liniach komórek jednojądrzastych, w tym w mikrogleju.4 W zależności od potrzeb konkretnego projektu można zastosować różne szczepy myszy.
- Zanurz mysz w znieczuleniu poprzez dostarczenie do jamy otrzewnej koktajlu trzech leków w składzie: 0,05 mg/kg Fentanylu, 5,0 mg/kg Midazolamu oraz 0,5 mg/kg Medetomidyny.5 Przygotowanie chirurgiczne do TSCW rozpoczyna się, gdy zwierzę przestaje reagować na bodźce bólowe, takie jak ściśnięcie ogona. Przez cały czas trwania operacji i obrazowania zwierzę pozostaje na macie grzewczej, aby zapobiec hipotermii po znieczuleniu. W razie potrzeby można podać dawkę uzupełniającą w wysokości jednej trzeciej pierwotnej dawki koktajlu anestetycznego, aby przywrócić pierwotny poziom znieczulenia.
- Oczy zwierzęcia należy pokryć ochronną maścią oftalmiczną, aby zapobiec ich wysychaniu podczas znieczulenia, które znosi odruch mrugania. Usuń owłosienie ze skóry głowy zwierzęcia za pomocą maszynki, trymera, nożyczek lub metod chemicznych. Zdezynfekuj skórę głowy, używając 10% roztworu powidonu jodowego i 70% etanolu. Wszystkie narzędzia chirurgiczne muszą zostać poddane autoklawowaniu, sterylizacji w sterylizatorze perłowym lub dezynfekcji 70% etanolem.
- Wykonaj nacięcie skóry głowy w linii środkowej za pomocą małych nożyczek, zaczynając 4-5 mm gorszo (caudalnie) od czaszki i przesuwając się do przodu, aż do przedniej części oczu. Ważne jest, aby nacięcie było wystarczająco długie, tak aby skóra nie przeszkadzała w przyklejaniu płytki głowowej służącej do stabilizacji głowy myszy podczas obrazowania dwufotonowego (Rycina 1). Pod stereomikroskopem zidentyfikuj obszar przeznaczony do ścieńczenia. Unikaj obszarów zainteresowania znajdujących się bezpośrednio nad szwami czaszkowymi, ponieważ czaszka jest w tych miejscach mniej stabilna, a leżące pod nimi duże naczynia i opony będą utrudniać obrazowanie.
- Za pomocą sterylnego patyczka nasączonego 10% etanolem, a następnie 10% roztworem chlorku żelaza, osusz błony na szczycie czaszki, a następnie zeskrob je za pomocą precyzyjnych pęset lub żyletki. Pozostawienie błon prowadzi do niestabilnego mocowania płytki głowowej.
- Nanieś cienką warstwę kleju Permabond 910 wokół krawędzi okna obserwacyjnego pod płytką głowową. Przyłóż pokrytą klejem płytkę głwową do obszaru zainteresowania na czaszce zwierzęcia, wywierając lekki nacisk (Rycina 1). Ważne jest, aby płytka głowowa była przyklejona wyłącznie do kości czaszki. Jakakolwiek skóra lub błony uwięzione między płytką a czaszką zmniejszą stabilność wiązania. Za pomocą strzykawki nanieś niewielką ilość akrylatu wokół okna obserwacyjnego, aby natychmiast utrwalić klej. Na koniec nanieś niewielką ilość Loctite 454 na krawędzie okna obserwacyjnego, aby zapobiec nieszczelnościom.
- Przykręć płytkę głwową do uchwytu zwierzęcia (Rycina 1) i sprawdź stabilność płytki pod stereomikroskopem, delikatnie dotykając jej pęsetą. Czaszka nie powinna przemieszczać się względem płytki głowowej. Umieść kroplę soli fizjologicznej na oknie obserwacyjnym, aby upewnić się, że nie ma wycieków.
2. Przygotowanie okna korowego poprzez ścieńczenie czaszki
- W celu przygotowania do ścieńczenia czaszki, należy osuszyć ją, używając sterylnych patyczków bawełnianych oraz sprężonego powietrza. Początkowo ścieńczamy czaszkę za pomocą sterylnego wiertła IRF 007 wiertarce Microtorque II ustawionej na 40 rpm. Bardzo delikatnie należy rozpocząć ścieńczanie okrągłego obszaru czaszki o średnicy 2-2,5 mm. Stosować wyłącznie lekkie ruchy zamiatające, niemal równoległe do powierzchni czaszki; nie wywierać bezpośredniego nacisku w dół. Należy przerywać wiercenie co 20-30 sekund, aby usunąć pył kostny za pomocą sprężonego powietrza. Przerwy w wierceniu pozwalają czaszce ostygnąć, co zapobiega uszkodzeniom tkanki mózgowej wywołanym ciepłem.
- W miarę postępu wiercenia należy zwrócić uwagę na przejście do wilgotniejszej warstwy kości gąbczastej (tzw. "diploe"). Po dotarciu do tej warstwy należy zachować szczególną ostrożność podczas pracy z wiertarką.
- Okazyjnie sprawdzać stopień ścieńczenia czaszki, nakładając sól fizjologiczną na ścieńczony obszar i obserwując go pod mikroskopem stereoskopowym. Sól fizjologiczna dodatkowo wspomaga odprowadzanie ciepła. W miarę ścieńczania czaszki widoczne stają się mniejsze naczynia krwionośne.
- Aby uzyskać końcowe ścieńczenie w środowisku soli fizjologicznej, należy użyć sterylnego dentystycznego mikrodłuta, ponieważ zapewnia ono znacznie lepsze sprzężenie zwrotne w zakresie stabilności czaszki. Pozwala to na przygotowanie znacznie cieńszych okien niż przy użyciu samej wiertarki. Z naszego doświadczenia wynika, że optymalna grubość czaszki wynosi 10-30 μm.
- Podczas pierwszych kilku prób wykonania okna w czaszce ważne jest wielokrotne sprawdzanie stopnia jej ścieńczenia pod mikroskopem epifluorescencyjnym. Wyrazistość i głębokość widocznej mikroglei oraz naczyń krwionośnych stanowią dobrą wskazówkę, kiedy okno jest gotowe do obrazowania.
- Gdy okno jest gotowe, należy przykleić nad nim dopasowany prostokątny kawałek szkiełka podstawkowego #0 o wymiarach mniejszych niż 2 mm na każdym boku. Używając szklanej pipety o średnicy 1,0 mm, nanieść małą kroplę kleju cyjanoakrylowego na ścieńczony obszar czaszki, ostrożnie opuścić mały kawałek szkiełka, a następnie delikatnie docisnąć go do czaszki, aby wycisnąć nadmiar kleju. Ważne jest unikanie powstawania pęcherzyków powietrza między szkłem a klejem, ponieważ uwięzione powietrze spowoduje, że obszar pod nim stanie się optycznie nieprzezroczysty. Stosuje się klej cyjanoakrylowy, ponieważ pozostaje on przezroczysty po wyschnięciu oraz zapobiega odrostowi kości i błon, utrzymując czaszkę pod oknem w stanie cienkim i półprzezroczystym. Jeśli na górnej powierzchni szkiełka znajduje się klej, należy go ostrożnie usunąć mikrodłutem po umieszczeniu szkiełka i wyschnięciu kleju.
- Bezpośrednio po operacji podaje się lek przeciwbólowy (na przykład Buprenorphine 2 mg/kg podskórnie), który jest ponownie podawany przy wszelkich oznakach bólu, w tym przy niechęci do poruszania się, jedzenia lub picia, utracie masy ciała, ślinotoku, piloerekcji, specyficznych dźwiękach oddechowych itp.
3. Obrazowanie dwufotonowe
- W ramach przygotowania do obrazowania dwufotonowego, przykryj TSCW solą fizjologiczną i zlokalizuj obszar zainteresowania w świetle epifluorescencyjnym (Rysunek 2). Aby umożliwić późniejsze obrazowanie tego obszaru, wykonaj zdjęcie za pomocą aparatu fotograficznego.
- Do obrazowania dwufotonowego wykorzystujemy specjalnie skonstruowany mikroskop dwufotonowy6 z laserem Ti:Szafir nastrojonym na 920 nm. Fluorescencję wykrywa się za pomocą fotopowielacza w trybie detekcji całego pola z zastosowaniem filtru emisyjnego 580/180. Przez całą sesję obrazowania używany jest obiektyw z imersją wodną 20X (0,95 N.A.). Maksymalna moc wyjściowa lasera na obiektywie jest ustawiona w zakresie od 50 do 65 mW.
- Wybierz obszar zainteresowania w warstwach I lub II kory (do 150 μm poniżej powierzchni pialnej). Aby ułatwić ponowne obrazowanie, wykonaj zdjęcia tego samego pola widzenia przy 1X, 2X i 3X cyfrowym powiększeniu. Naczynia krwionośne mogą służyć jako punkty orientacyjne, ułatwiające odnalezienie tego samego pola widzenia podczas kolejnych sesji obrazowania. Przy powiększeniu 3X co 5 minut przez maksymalnie 30 minut można pozyskiwać wiele stosów z-stack z 80-90 krokami Z w każdym stosie i krokiem 0,69 μm, co pozwala na dobre próbkowanie morfologii i zachowania mikrogleju w czasie (Rysunek 3). Pomiędzy akwizycjami stosów z-stack należy sprawdzić poziom soli fizjologicznej nad TSCW oraz głębokość znieczulenia zwierzęcia.
4. Iniekcja neurotoksyny HIV-1, Tat
- W pierwszej kolejności należy zsilanizować wewnętrzną powierzchnię igły o rozmiarze 35 G oraz strzykawki Microvolume o pojemności 10 μL, aby zapobiec osadzaniu się białka Tat. Należy pobrać roztwór silanizujący (Sigmacote), aż wypełni on zarówno igłę, jak i strzykawkę. Roztwór powinien pozostać wewnątrz przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Następnie należy opróżnić strzykawkę z roztworu, wyjąć tłok i pozwolić strzykawce oraz igle całkowicie wyschnąć. Na koniec strzykawkę i igłę należy dokładnie wypłukać wodą dejonizowaną.
- Należy wykonać niewielką kraniotomię o średnicy 0,5 mm, w odległości 3 mm w kierunku rostralnym lub bocznym od TSCW, w miejscu, gdzie uzyskano obrazy dwufotonowe, używając mniejszego wiertła i ostrożnie ścieńczając czaszkę, aż do momentu, gdy pęseta z ostrymi końcówkami będzie mogła z łatwością usunąć cienką warstwę kości. Wykorzystujemy strzykawkę Microvolume o pojemności 10 μL z igłą 35 G, sterowaną przez pompę strzykawkową Ultramicropump III zamontowaną na trójosiowym mikromanipulatorze. Po ustawieniu końcówki igły nad otworem kraniotomii, należy ją ostrożnie wprowadzić na głębokość od 70 do 90 μm poniżej powierzchni oponowej, gdzie podaje się 3 μL Tat1-72 (lub inne czynniki prozapalne) bądź sól fizjologiczną (lub nośnik kontrolny) z prędkością 80 nL/min.
5. Zakwaterowanie zwierząt
- Jeśli zwierzę ma być poddawane obrazowaniu wielokrotnie w ciągu jednego dnia, należy pokryć otwarty obszar czaszki mieszaniną maści oftalmicznej i wazeliny, aby zapobiec dyskomfortowi lub uszkodzeniu czaszki pomiędzy sesjami obrazowania. Odłączyć mostek wspierający od małej płytki głownej (patrz Rycina 1B) i umieścić zwierzę w ogrzewanej klatce z łatwo dostępnym pokarmem i wodą. Wszystkie zwierzęta po operacji muszą być przez cały czas utrzymywane w pojedynczych klatkach. Po zakończeniu sesji obrazowania zwierzęcia w danym dniu, ostrożnie usunąć całą płytkę głowną i zaszyć skórę nad czaszką nicią chirurgiczną o rozmiarze #6 lub mniejszą. Ponownie umieścić zwierzęta w pojedynczych klatkach z łatwo dostępnym pokarmem i wodą pomiędzy dniami eksperymentalnymi. Codziennie sprawdzać, czy u zwierząt nie występują oznaki stresu, bólu lub infekcji.
6. Reprezentatywne wyniki
Rysunek 1. Stabilizacja zwierzęcia do zabiegu chirurgicznego i obrazowania dwufotonowego (A) oraz konstrukcja płytki głownej (B).
Rycina 2. Mikroglej znakowany GFP wizualizowany za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej.
Rysunek 3. Mikroglicia znakowana GFP uwidoczniona za pomocą obrazowania dwufotonowego po implantacji TSCW, około 50 μm poniżej powierzchni pialnej. Pojedyncze przekroje dwufotonowe wykonane 15–30 minut po implantacji TSCW (dzień 0), a także 7 i 17 dni później, wykazują, że okna pozostają przejrzyste, a mikroglej nieaktywny w przypadku braku bodźców zapalnych. Projekcje osi z wykonane 6 i 24 godziny po wstrzyknięciu neurotoksyny tat wirusa HIV wykazują wyraźne zmiany morfologiczne aktywowanego mikrogleju. Pasek skali: 10 μm.
Dyskusja
Rośnie przekonanie, że faktycznym podłożem deficytów neuropoznawczych związanych z HIV-1 (HAND) jest destrukcja architektury synaptycznej, prawdopodobnie wywołana przez mediatory prozapalne uwalniane z zainfekowanych HIV-1 fagocytów jednojadrowych. Aktywacja mikrogleju, wielojądrowe komórki olbrzymie oraz glioza wynikająca z hipertrofii astrocytów są uważane za nieswoiste cechy charakterystyczne dla infekcji HIV-1 i stanu zapalnego w OUN 7. W przeciwieństwie do nich, ciężkość przedśmiertnej choroby neurologicznej skorelowano z utratą złożoności synaptycznej, a także z obciążeniem makrofagami w OUN 8,9,10,11. Jednakże dynamiczne interakcje między mikroglejem, naciekającymi makrofagami obwodowymi a neuronami u pacjentów z HAND nie mogą być modelowane przy użyciu konwencjonalnego przetwarzania statycznego uzyskiwanego z tradycyjnych badań immunocytochemicznych. Niedawne badania w naszych laboratoriach zasugerowały, że przynajmniej niektóre z tych interakcji między obwodowymi i centralnymi komórkami jednojadrowymi a neuronami mogą być częściowo modelowane poprzez stereotaktyczną iniekcję białka Tat1-72 HIV-1 do miąższu mózgu (Lu, Marker, Tremblay, Qi oraz Gelbard, dane nieopublikowane). Zdecydowaliśmy się zatem zastosować obrazowanie dwufotonowe in vivo, aby zbadać współdziałanie między makrofagami pochodzącymi z monocytów, mikroglejem rezydentnym w mózgu a neuronami w łatwym w obsłudze modelu neuroAIDS u małych zwierząt. Podczas gdy preparaty z otwartą czaszką lub z cienką czaszką umożliwiają jednorazowe badanie architektury kory przez krótki czas (godziny), badacze zainteresowani przebiegiem zdarzeń podostrych nie mogą stosować tych preparatów bez artefaktycznej aktywacji mikrogleju/makrofagów w wyniku chirurgicznej manipulacji oknem czaszkowym. Tutaj demonstrujemy prosty sposób obejścia tych ograniczeń poprzez przyklejenie małego kawałka szkiełka nakrywowego nad obszarem cienkiej czaszki, co zapobiega regeneracji sklepienia czaszki w TSCW oraz utrzymuje przezroczystość przez ≥3 tygodnie. Wykazujemy ponadto, że technika ta pozwala nam monitorować zachowanie monocytów obwodowych wnikających do mikrokrążenia mózgowego, a także mikrogleju rezydentnego w mózgu w odpowiedzi na stereotaktyczną iniekcję HIV Tat1-72 do kory myszy heterozygotycznych dla CX3CR1/GFP (w celu identyfikacji komórek linii jednojadrowej). Technikę tę można łatwo dostosować do myszy o innym tle genetycznym; na przykład rutynowo stosujemy myszy heterozygotyczne CX3CR1/GFP X Thy-1 YFP 12 do badania interakcji między makrofagami pochodzącymi z monocytów, mikroglejem rezydentnym w mózgu a neuronami w modelach in vivo neurozapalenia istotnych dla HAND. Nasz preparat TSCW pozwala badaczom badać interakcje międzykomórkowe między obwodem a OUN, które mogą występować w okresie wielu tygodni, podczas których zwierzę może być wielokrotnie obrazowane przed i po leczeniu eksperymentalnym. W ten sposób każde zwierzę może służyć jako własna kontrola. Jedynym zastrzeżeniem dla tego modelu TSCW jest to, że badane komórki docelowe muszą być albo genetycznie zmodyfikowane w celu ekspresji ulepszonych białek fluorescencyjnych (eXFP), albo znakowane barwnikiem fluorescencyjnym bez mechanicznego naruszania sklepienia czaszki; ponadto ekspresja eXFP musi być wystarczająco silna, aby umożliwić wizualizację architektury komórkowej po wielokrotnych sesjach obrazowania w okresie wielu tygodni.
Oświadczenia
Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Dziękujemy Emily A. Kelly za projekt płytki głowowej.
Jesteśmy wdzięczni za wsparcie z grantów NIH przyznanych H.A.G.: PO1 MH64570, RO1 MH56838, RO1 MH078989, R21 MH03851 oraz za hojne wsparcie z Geoffrey Waasdorp Pediatric Neurology Fund, bez których ta praca nie byłaby możliwa. A.K.M jest finansowany przez NIH (EY019277), Whitehall Foundation, Alfred P. Sloan Foundation oraz Career Award in the Biomedical Sciences z Burroughs Wellcome Fund. M.E.T jest finansowany z grantu na staż podoktorski Fonds de la recherche en sante du Quebec (FRSQ). D.F.M jest stażystą w programie Medical Scientist Training Program, finansowanym przez NIH T32 GM07356 oraz T32 AI049815.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Cytrynian fentanylu | Hospira Inc. | ||
| Wodorochlorek midazolamu | Baxter International Inc. | ||
| hydrochlororek medetomidyny (Domitor) | Pfizer Pharma GmbH | ||
| Podkładki grzewcze | Poza ciepłem ciała | ||
| Maść do oczu z tobramycyną i deksametazonem (TobraDex) | Alcon | ||
| 10% roztwór powidonu z jodem | Betadine Puredue Pharma | ||
| 10% roztwór chlorku żelaza(III) | Ricca Chemical Company | 3120-32 | |
| Cyjanoakrylan metylowy 910 | Permabond | ||
| Cyjanoakrylan 454 | Loctite | ||
| sieciowanie materiału protetycznego TEETS metakrylan metylu | Co-Oral-lte Dental Mfg CO | ||
| Zestaw końcówek Microtorque II | Testy Pearsona | R14-0002 | |
| Wiertła IRF 007 | Fine Science Tools | 19008-07 | |
| mikroostrzyże Norland z pełnym promieniem, wyginalne | Salvin Dental | BLAD-NORLAND-69 | |
| Cyjanoakrylan | Oryginalny superklej | ||
| szkiełko podstawowe nr 0 | Electron Microscopy Sciences | 63750-01 | |
| 10 μStrzykawka mikrolitrowa | World Precision Instruments, Inc. | ILS010LT | |
| UltraMicroPump III | World Precision Instruments, Inc. | UMP3-1 | |
| igła NanoFil 35 G | World Precision Instruments, Inc. | NL35BL-2 | |
| Młyn kulowy, wiertła węglikowe 1/4" | World Precision Instruments, Inc. | 501860 | |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2-100 | |
| Pomnożnik fotonowy | Hamamatsu Corp. | HC125-02 | |
| Laser tytano-szafirowy Mai-Tai | Newport Corp. |
Bibliografia
- Mostany, R., &, P. ortera-C. ailliau, C, A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging. J Vis Exp. 12, (2008).
- Holtmaat, A. high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nat Protoc. 4, (2009).
- Yang, G. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nature Protoc. 5, 213-21 (2010).
- Jung, S. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol Cell Biol. 20, 4106-41 (2000).
- Mrsic-Flogel, T. D. Homeostatic regulation of eye-specific responses in visual cortex during ocular dominance plasticity. Neuron. 54, 961-96 (2007).
- Majewska, A., Yiu, G., &, Y. uste, R, A custom-made two-photon microscope and deconvolution system. Pflugers Arch. 441, 2-3 (2000).
- Sharer, L. R. Pathology of HIV-1 infection of the central nervous system. A review. J Neuropathol Exp Neurol. 51, (1992).
- Everall, I. P., Aliberti, J., &, B. alcerzyk, M, Neuronal density in the superior frontal and temporal gyri does not correlate with the degree of human immunodeficiency virus-associated dementia. Acta Neuropathol (Berl. 88, 538-53 (1994).
- Masliah, E., Banati, R. B., &, Q. uinlan, M, E. Dendritic injury is a pathological substrate for human immunodeficiency virus-related cognitive disorders. Ann Neurol. 42, 963-96 (1997).
- Everall, I. P., Banati, R. B., &, U. pender, B, M. Cortical synaptic density is reduced in mild to moderate human immunodeficiency virus neurocognitive disorder. Brain Pathol. 9, (1999).
- Glass, J. D., Fedor, H., Wesselingh, S. L., &, M. cA. rthur, C, J. Immunocytochemical quantitation of human immunodeficiency virus in the brain: correlations with dementia. Ann Neurol. 38, (1995).
- Feng, G. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, (2000).
Przedruki i uprawnienia
