Wizualizacja transferu HIV między komórkami z wykorzystaniem fluorescencyjnych klonów HIV oraz konfokalnej mikroskopii żywych komórek

Podsumowanie

Niniejszy eksperyment w formie wizualizacji jest przewodnikiem po wykorzystaniu fluorescencyjnego klonu molekularnego HIV do eksperymentów z obrazowaniem konfokalnym żywych komórek.

Streszczenie

Dzięki fuzji zielonego białka fluorescencyjnego z wybranymi białkami, biolodzy zyskali możliwość badania złożonych procesów komórkowych w żywych organizmach przy użyciu wideomikroskopii fluorescencyjnej. Aby śledzić ruchy białka rdzeniowego wirusa niedoboru odporności u ludzi podczas transmisji wirusa z komórki do komórki, oznaczyliśmy białko Gag za pomocą GFP w kontekście zakaźnego klonu molekularnego HIV, nazwanego HIV Gag-iGFP. Badamy ten klon wirusowy przy użyciu konfokalnej mikroskopii wideo. W poniższym zwizualizowanym eksperymencie przeprowadzamy transfekcję ludzkiej linii komórek T za pomocą HIV Gag-iGFP, a jako komórki docelowe dla wirusa wykorzystujemy fluorescencyjnie oznakowane, niezakażone komórki T CD4+. Dzięki zastosowaniu różnych znaczników fluorescencyjnych możemy łatwo śledzić produkcję wirusa oraz jego transport przez struktury międzykomórkowe nazywane synapsami wirologicznymi. Proste komory obrazowania przepuszczalne dla gazów pozwalają nam obserwować synapsy za pomocą konfokalnej mikroskopii żywych komórek od kilku minut do kilku dni. Podejścia te mogą być wykorzystywane do śledzenia białek wirusowych podczas ich przemieszczania się z jednej komórki do drugiej.

Protokół

Metoda ta została wykorzystana w badaniach opisanych w publikacji Hübner et al. Science 323: 1743-1747 (2009).

1. Przegląd

Przenoszenie HIV z komórki na komórkę zostało pierwotnie opisane z wykorzystaniem zakażonych HIV komórek Jurkat jako komórek dawców oraz pierwotnych limfocytów T CD4+ jako komórek biorców ^1,2,3. W badaniach tych wirusa wykrywano w utrwalonych komórkach za pomocą barwienia przeciwciałami. Aby śledzić transfer wirusa z komórki na komórkę w żywych komórkach, wykorzystujemy rekombinowany, zakaźny klon molekularny HIV nazwany HIV Gag-iGFP ⁴. Zawiera on zielone białko fluorescencyjne (GFP) wstawione wewnętrznie do białka Gag pomiędzy domenami MA i CA. Ten klon molekularny HIV zachowuje zakaźność bez potrzeby stosowania wirusa pomocniczego. Cząsteczki wirusa powstałe z tego klonu są stechiometrycznie obciążone zielonym białkiem fluorescencyjnym, co zapewnia silny sygnał fluorescencji do monitorowania składania wirusa i jego transferu między komórkami. Dzięki zastosowaniu w połączeniu z obojętnymi fluorescencyjnymi barwnikami do śledzenia komórek, można odróżnić komórki biorców od wprowadzonych komórek dawców, co pozwala na wizualizację transferu HIV z zakażonej komórki T do niezakażonej komórki T ⁵. Formowanie synapsy wirologicznej i transfer wirusa z jednej komórki do drugiej można następnie obserwować w żywych komórkach podczas ich hodowli w szczelnej, przepuszczalnej dla gazów komorze obrazującej.

(Dzień 1)

2. Przygotowanie komórek T Jurkat ztransfected HIV Gag-iGFP

1. Przygotować ludzką linię komórkową limfocytów T CD4+ Jurkat (ATCC, Manassas, VA), utrzymując starannie komórki w stężeniu od 2 x 10⁵ do 8 x 10⁵ komórek/mL w pożywce do hodowli komórek Jurkat (RPMI 1640, 10% płodowej surowicy bydlęcej, 100 jednostek/mL penicyliny oraz 100 μg/mL streptomycyny). Klucz do sukcesu: Hodowanie komórek Jurkat w stężeniach przekraczających 8 x 10⁵ komórek/mL spowoduje obniżenie wydajności transfekcji.
   
   Uwaga: Transfekcja prowiralnego DNA HIV Gag-iGFP do limfocytów T, opisana poniżej, prowadzi do produkcji zdolnego do replikacji ludzkiego wirusa niedoboru odporności. W związku z tym wszystkie procedury powinny być wykonywane wyłącznie przez przeszkolony personel laboratoryjny w certyfikowanych pomieszczeniach do hodowli tkankowej o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2+ lub 3 (BL2+/BL3). Praca z zakaźnym HIV w placówkach obrazowania musi zostać zatwierdzona przez lokalny instytucjonalny urząd ds. bezpieczeństwa biologicznego.
2. Przeprowadzić transfekcję komórek Jurkat plazmidem wirusowym HIV Gag-iGFP, stosując metodę nukleofekcji Amaxa (Lonza, Walkersville, MD). Osadzić 5 x 10⁶ komórek poprzez wirowanie przez 10 min przy 150 x g. Odessać nadsącz i przemyć komórki sterylnym roztworem soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS). Odwirować komórki i resuspendować osad w 97 μL uprzednio ogrzanego roztworu do nukleofekcji V zawierającego suplement producenta. Dodać trzy μL wolnego od endotoksyn plazmidu HIV Gag-iGFP (1 μg/μL) do zawiesiny komórkowej i delikatnie wymieszać. Przenieść zawiesinę komórkową do kuwety i przeprowadzić nukleofekcję, korzystając z programu S-18. Natychmiast przenieść komórki do 3 mL uprzednio ogrzanej pożywki do hodowli Jurkat bez antybiotyków.
3. Aby przygotować komórki docelowe CD4+ do synaps wirusologicznych, pozyskujemy ludzkie mononuklearne komórki krwi obwodowej z warstwy leukocytarnej (buffy coats), stosując standardowy protokół Ficoll-Paque (GE Healthcare, Uppsala, Szwecja). Następnie limfocyty T CD4+ są wyselekcjonowane negatywnie przy użyciu zestawu do izolacji za pomocą kulek magnetycznych (Miltenyi Biotec, Auburn, CA). Mogą one być przechowywane kriogenicznie w ciekłym N2 w alikwotach 5 x 10⁶ komórek/500 μL pożywki do zamrażania (90% płodowej surowicy bydlęcej/10% DMSO). Rozmrożone pierwotne limfocyty T CD4+ hoduje się w RPMI z 10% FBS, uzupełnionym o 10 jednostek/mL IL-2.

(Dzień 2)

3. Odzyskiwanie żywych komórek linii Jurkat przetransfekowanych HIV Gag-iGFP oraz barwienie komórek docelowych barwnikami fluorescencyjnymi

1. Pozostaw komórki Jurkat na noc w celu regeneracji po transfekcji. Następnie usuń zanieczyszczenia komórkowe poprzez wirowanie na gradiencie gęstości Ficoll-Paque. Do dna stożkowej probówki o pojemności 15 mL wlej 1.5 mL Ficoll-Paque. Ostrożnie nałóż na ten materiał gradientowy transfektowane komórki Jurkat w 5 mL objętości pożywki RPMI. Wiruj komórki przy 400 x g przez 20 min w temperaturze pokojowej z wyłączonym hamulcem. Ostrożnie pobierz komórki z interfejsu pożywka/Ficoll za pomocą pipety. Przenieś je do nowej stożkowej probówki 15 mL. Rozcieńcz komórki pożywką RPMI do całkowitej objętości 15 mL i wiruj przy 300 x g przez 10 min. Resuspenduj osad w 3 mL pożywki do hodowli komórek Jurkat w dołku 2 cm (płytka 6-dołkowa) i przenieś komórki do inkubatora do hodowli tkankowych.
2. Aby odróżnić komórki docelowe od komórek donora w eksperymentach z transferem komórka-komórka, uprzednio znakujemy komórki docelowe CD4+ barwnikami fluorescencyjnymi. Pierwotne limfocyty T CD4+ są znakowane wieczorem w dniu poprzedzającym użycie. Osiągnęliśmy doskonałe rezultaty, znakując limfocyty T barwnikami CellTracker oraz CellTrace (Invitrogen, Carlsbad, CA). Chociaż stężenie barwnika i czasy inkubacji muszą zostać zoptymalizowane w zależności od konkretnego barwnika i rodzaju użytych komórek, poniżej przedstawiono reprezentatywny protokół. Osadź 4 x 10⁶ pierwotnych limfocytów T CD4+ poprzez wirowanie przy 400 x g przez 10 min. Przemyj komórki 5 mL PBS i resuspenduj w 2 mL PBS. Dodaj CellTracker Orange (CMTMR, Invitrogen, Carlsbad, CA) do stężenia końcowego 1.5 μM i inkubuj w 37°C przez 20 min. Dodaj 8 mL kompletnej pożywki dla komórek Jurkat i wiruj przy 400 x g przez 10 min. Resuspenduj komórki w 3 mL kompletnej pożywki uzupełnionej o 10 units/mL IL-2 i umieść w inkubatorze do hodowli tkankowych na noc.

(Dzień 3)

4. Monitorowanie transferu HIV Gag-iGFP między komórkami za pomocą obrazowania komórek żywych

Rutynowo wykorzystujemy komórki Jurkat przetransfekowane HIV Gag-iGFP 48 godzin po transfekcji. Pomyślnie stosowaliśmy jednak komórki już po 24 godzinach, a także do 72 godzin po transfekcji.

1. Około 48 godzin po transfekcji komórki Jurkat wykazujące ekspresję HIV Gag-iGFP należy policzyć, przemyć pożywką niezależną od CO₂ (Invitrogen, Carlsbad, CA), a następnie zawiesić w pożywce do obrazowania żywych komórek (pożywka niezależna od CO₂, 10% płodowej surowicy bydlęcej, 100 U/mL penicyliny i 100 μg/mL streptomycyny, 10 jednostek/mL IL-2) w stężeniu 1-3 x 10⁷ komórek/mL.
2. W podobny sposób należy przemyć i zawiesić oznakowane pierwotne limfocyty T CD4+ w pożywce do obrazowania żywych komórek w stężeniu 1-3 x 10⁷ komórek/mL.
3. Komórki Jurkat przetransfekowane HIV Gag-iGFP należy zmieszać z pierwotnymi limfocytami T CD4+ w stosunku 1:2 lub 1:3, a następnie przenieść do mikrokomory przepuszczalnej dla gazów, przeznaczonej do hodowli tkankowych (Ibidi, Verona, WI). Na przykład należy zmieszać 20 μL przetransfekowanych HIV Gag-iGFP komórek Jurkat z 40 μL oznakowanych pierwotnych limfocytów T CD4+. Do komory Ibidi należy nanieść 50 μL tej mieszaniny i zamknąć komorę za pomocą korków. Korki należy zabezpieczyć, owijając miejsce styku korka z komorą Ibidi paraflem.

5. Uwagi dotyczące platform mikroskopowych: obrazowanie konfokalne z dyskiem obrotowym

Po załadowaniu komory obrazowania Ibidi komórkami, niezwłocznie montujemy urządzenie na odwróconym mikroskopie optycznym (iX71 Olympus, Center Valley, PA). Przenoszenie komory Ibidi do mikroskopu powinno być wykonywane wyłącznie przez przeszkolony personel laboratoryjny (poziom BSL2+), noszący odpowiednią odzież ochronną. Choć w obrazowaniu żywych komórek powszechnie stosuje się kosztowne komory inkubacyjne w celu utrzymania stabilnej temperatury 37°C, w tym przypadku osiągnięto to za pomocą prostego i ekonomicznego grzejnika termostatycznego (ASI 400, Nevtek, Williamsville, VA) wraz z termoparą typu T zamontowaną obok próbki w celu zapewnienia właściwej informacji zwrotnej o temperaturze. Stwierdzono, że zastosowanie pożywek niezależnych od CO₂ pozwala na utrzymanie wysokiej żywotności komórek przy jednoczesnym uniknięciu stosowania komory z CO₂. Aby zabezpieczyć platformę przed wahaniami temperatury w pomieszczeniu oraz zablokować tło świetlne, cały zestaw mikroskop/grzejnik przykrywa się dużą czarną osłoną, tworząc wokół systemu izolowaną kieszeń powietrzną. Znacznie ogranicza to wahania temperatury i związany z nimi dryft próbki, ale wymaga wstępnego podgrzewania przez 30 minut przed zamontowaniem próbki.

6. Pozyskiwanie, transfer danych i przetwarzanie obrazów

Obrazy są rejestrowane przy użyciu obiektywu imersyjnego z olejkiem 60x 1.42 NA (UPlanApo N, Olympus), ponieważ wysoka apertura numeryczna (NA) znacznie poprawia rozdzielczość. W celu utworzenia konfokalnych obrazów 3D skanowanie jest przeprowadzane przez jednostkę konfokalną z wirującym dyskiem (CSU-10, Yokagawa, Japonia), która jednocześnie wykorzystuje >800 punktów konfokalnych, aby radykalnie zwiększyć szybkość skanowania. Aby uzupełnić tę szybkość, CSU-10 jest sparowany z bardzo czułą kamerą o sprzężonych ładunkach z mnożeniem elektronów (EMCCD, iXon+ 897, Andor Technologies, Irlandia), co umożliwia szybkie obrazowanie przy słabym oświetleniu, redukując jednocześnie fotobleaching i fototoksyczność. Źródłem światła fluorescencyjnego jest wielodługościowy gazowy laser jonowy ArKr (Innova 70C, Coherent, Santa Clara), w którym pożądana długość fali (488 nm) oraz moc lasera mierzona bezpośrednio przed obiektywem mikroskopu (<1 mW) są wybierane przez akustyczno-optyczny filtr strojony (AOTF, Andor Technologies). Aby dodatkowo ograniczyć fotobleaching i wydłużyć całkowity czas obrazowania, AOTF szybko (mikrosekundy) wyłącza wiązkę lasera za każdym razem, gdy kamera jest nieaktywna (10-20 ms), podczas gdy nowo nabyty obraz jest przesyłany z CCD (ekspozycja 15-30 ms) do komputera. Światło lasera jest wprowadzane do systemu wirującego dysku za pomocą quadbandowego lustra dichroicznego 405/488/568/647 (Semrock, Rochester, NY). Emisja fluorescencji jest filtrowana za pomocą filtra pasmowego 525/50 (Semrock) wewnątrz koła filtrowego (Ludl Electronic Products, Hawthorne, NY) zamontowanego pomiędzy kamerą EMCCD a konfokalną jednostką wirującego dysku. Cały sprzęt i proces akwizycji, w tym stolik z osią z (Mad City Labs, Madison, WI), są sterowane przez oprogramowanie Andor iQ v1.8. Aby zmaksymalizować szybkość akwizycji przy stosach obrazów 3D trwających około 1.2-1.9 sekundy, przycinamy obszar rejestracji kamery EMCCD do bezpośredniej okolicy pary komórek. Ponadto, kosztem części informacji w osi z, można zastosować duży krok z w zakresie 0.45-0.75 μm, aby przyspieszyć akwizycję. Obrazowanie w tych warunkach może trwać do 6 godzin – z wykorzystaniem ciągłych segmentów 20-60 minutowych – przy minimalnym fotobleachingu. Łącznie każdy segment danych zajmuje zazwyczaj 5-20 Gb miejsca, ponieważ rejestrowanych jest dziesiątki tysięcy obrazów. Aby ułatwić transport i analizę dużych plików danych, każdy zestaw akwizycyjny musi zostać podzielony i wyeksportowany jako 1 Gb segmenty plików obrazów TIFF za pomocą oprogramowania Andor iQ v1.8. Na tym etapie dostępnych jest wiele doskonałych pakietów oprogramowania do analizy obrazu, takich jak Metamorph, Volocity i ImageJ (zalecamy jego modyfikację Fiji).

W przypadku konieczności śledzenia dwóch markerów fluorescencyjnych, rejestrujemy oba jednocześnie bez spowalniania akwizycji, korzystając z „trybu podzielonego ekranu” (split screen mode). Oba markery są pobudzane jednocześnie przez dwie różne linie lasera ArKr (najczęściej 488 i 568 nm). Bezpośrednio przed kamerą EMCCD umieszczony jest dzielnik obrazu (OptoSplit II, Cairn, Kent, UK), który rozdziela dwa różne obrazy. Następnie każdy obraz jest niezależnie filtrowany za pomocą filtrów fluorescencyjnych (Semrock) i rzutowany obok siebie na matrycę kamery w tym samym czasie, co tworzy efekt „podzielonego ekranu”. Wymaga to następnie ręcznego przycinania i dopasowania obrazów na etapie późniejszej obróbki obrazu.

7. Uwagi dotyczące przetwarzania obrazów i analizy danych

Analizę obrazów przeprowadzamy zazwyczaj za pomocą oprogramowania Volocity (PerkinElmer, Waltham, MA) na komputerach Macintosh (Apple, Inc). Obrazy z konfokalnej mikroskopii laserowej z dyskiem obrotowym są najpierw korygowane pod kątem intensywności w celu kompensacji fotoblaknięcia, a następnie poddawane dekonwolucji w programie Volocity. Pomiary intensywności oraz śledzenie punktów Gag wykonuje się za pomocą modułu Quantification w programie Volocity. W przypadku zestawów obrazów, w których konieczne jest obliczenie ruchu względem wcześniej uformowanej synapsy, stosowany jest zautomatyzowany algorytm śledzenia, który monitoruje kolbkę synaptyczną przez całą sekwencję. Należy przeprowadzić ręczną inspekcję obszarów zainteresowania (ROI) zdefiniowanych przez oprogramowanie do autotrackingu, aby potwierdzić, że program poprawnie śledził wybrany obiekt. W przypadku obiektów, których kontrast z otoczeniem jest zbyt słaby, śledzenie może być wykonywane ręcznie, klatka po klatce. Pakiet oprogramowania Volocity umożliwia eksport lokalizacji XYZ, objętości oraz zintegrowanego sygnału w obrębie wybranych obiektów. Odległość od synapsy oraz prędkość śledzonego obiektu oblicza się poprzez normalizację ruchów względem centrum kolbki synaptycznej.

8. Reprezentatywne wyniki

W ciągu 10 do 15 minut od zmieszania powinna być możliwa wizualizacja komórek Jurkat wykazujących ekspresję HIV Gag-iGFP przylegających do pierwotnych limfocytów T CD4+. Obrazując te koniugaty, można ocenić ruchy punktów Gag w komórkach zakażonych, a także w komórkach docelowych po utworzeniu synapsy. Można zaobserwować przemieszczanie się punktów Gag-iGFP do komórek docelowych wkrótce po sformowaniu się synaps.

Dyskusja

Opisujemy tutaj prostą metodę wizualizacji transferu HIV z komórki do komórki. Niedawne badania przeprowadzone w naszym laboratorium oraz przez inne zespoły sugerują, że może to być dominujący sposób rozprzestrzeniania się HIV między limfocytami T. Opisana tutaj metoda wykorzystuje rekombinowaną formę HIV, zwaną HIV Gag-iGFP, która posiada genetycznie zakodowany znacznik zielonego białka fluorescencyjnego w podstawowym białku strukturalnym, Gag. Dzięki wysokiemu poziomowi GFP wytwarzanego w każdej cząsteczce wirusa, ten zdolny do replikacji klon HIV umożliwia badaczom śledzenie pojedynczych cząsteczek wirusa w czasie rzeczywistym. Wirus ten powinien być szczególnie użyteczny w badaniach dotyczących montażu i transferu HIV z komórki do komórki.

Przenoszenie HIV poprzez transfer komórka-komórka jest wysoce efektywne. Podczas trzymiastegodzinnej kokultury rutynowo obserwujemy przeniesienie wirusa do 20-30% pierwotnych limfocytów T, co oceniano za pomocą cytometrii przepływowej. Podobną efektywność obserwuje się jakościowo podczas obrazowania żywych komórek. Zainfekowane wirusem limfocyty T zaczynają tworzyć synapsy z niezainfekowanymi pierwotnymi limfocytami T niemal natychmiast po rozpoczęciu kokultury. Co ciekawe, nie wszystkie pierwotne limfocyty T są zdolne do wchodzenia w interakcje z zakażonymi HIV komórkami Jurkat, mimo wymuszonych interakcji za pomocą pęset laserowych (niepublikowane obserwacje, GM). HIV Gag-iGFP bez wątpienia okaże się użyteczny w określaniu subpopulacji limfocytów T najbardziej podatnych na transfer komórka-komórka, zarówno in vitro, jak i in vivo.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Komórki T Jurkat	ATCC
Warstwy leukocytarne z krwi pełnej	New York Blood Center
RPMI	Sigma-Aldrich
Płodowa surowica bydlęca	Hyclone
Penicylina/Streptomycyna	Invitrogen
System Nucleofector oraz roztwór V	Lonza Inc.
Zestawy EndoFree Maxi Prep	Qiagen
Plazmid HIV Gag-iGFP	Chen Laboratory
Zestaw do izolacji komórek T CD4+	Miltenyi Biotec
Ficoll-Paque	GE Healthcare
Barwniki Celltracker/CellTrace	Invitrogen
Pożywka niezależna od CO2	Invitrogen
Komory obrazujące	Ibidi
Odwrócony mikroskop Olympus IX-71	Olympus Corporation
Obiektyw olejowy PlanApo N 1.42NA 60X	Olympus Corporation
Laser jonowy ArKr Innova 70C	Coherent Inc.
Konfokalna jednostka z wirującym dyskiem typu Nipkow CSU-10	Yokogawa
Dichroiczny dzielnik wiązki Di01-T405/488/568/647-13x15x0.5	Semrock
Filtr pasmowy 525/50	Semrock
Kamera iXon+ 897 z urządzeniem sprzężonych ładunków z mnożeniem elektronów	Andor
Grzejnik termostatyczny ASI 400	Nevtek