Ilościowe oznaczanie pęknięć dwuniciowych DNA na podstawie ognisk γH2AX stało się nieocenionym narzędziem, szczególnie w radiobiologii, służącym do oceny radiowrażliwości tkanek oraz efektów związków modyfikujących działanie promieniowania. W niniejszym materiale demonstrujemy zastosowanie testu immunofluorescencyjnego do ilościowego oznaczania ognisk γH2AX w próbkach tkanek.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Ilościowe oznaczenie ognisk $\gamma$H2AX w próbkach tkanek
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Pęknięcia obu nici DNA (DSBs) są szczególnie letalnymi i genotoksycznymi uszkodzeniami, które mogą powstawać w wyniku procesów endogennych (fizjologicznych lub patologicznych) lub czynników egzogennych, w szczególności promieniowania jonizującego oraz związków radiomimetycznych. Fosforylacja wariantu histony H2A, H2AX, w reszcie seryny-139 w wysoce konserwatywnym motywie SQEY na C-końcu, prowadząca do powstania γH2AX, stanowi wczesną odpowiedź na pęknięcia obu nici DNA1Proces fosforylacji ten jest pośredniczony przez białka z rodziny kinazy 3-fosfoinosydylowej (PI3K), kinazę ATM (ataxia telangiectasia mutated), katalityczną podjednostkę kinazy białkowo-DNA oraz kinazę ATR (ATM and RAD3-related).2Ogólnie indukcja DSB prowadzi do powstania wyraźnych jądrowych ognisk γH2AX, które można łatwo wykryć i ilościowo określić za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej2Biorąc pod uwagę wyjątkową specyficzność i czułość tego markera, analiza ognisk γH2AX znalazła szerokie zastosowanie w badaniach biomedycznych, szczególnie w radiobiologii i medycynie nuklearnej. Ilościowe oznaczanie ognisk γH2AX było najczęściej badane w systemach hodowli komórkowych w kontekście pęknięć DSB indukowanych promieniowaniem jonizującym. Poza radiowrażliwością komórkową, testy oparte na immunofluorescencji stosowano również do oceny skuteczności związków modyfikujących działanie promieniowania. Ponadto γH2AX był wykorzystywany jako marker molekularny do badania skuteczności różnych związków indukujących pęknięcia DSB, a ostatnio jest uznawany za istotny marker starzenia się i chorób, w szczególności nowotworów.3Ponadto metody oparte na immunofluorescence zostały dostosowane do wykrywania i kwantyfikacji ognisk γH2AXex vivoiin vivo4,5W niniejszej pracy prezentujemy typową metodę immunofluorescencji do wykrywania i oznaczania ilościowego ognisk γH2AX w tkankach mysich.
Protokół
Tkanki
- Tkankę płucną, zatopioną w formach w związku OCT (optimal cutting temperature) 4583, przekrojono (5 μm) przy użyciu kriostatu CM Leica 1950 i osadzono na szkiełkach pokrytych poli-L-lizyną.
Zamrożone próbki otrzymano od dr. Simona Royce'a z Murdoch Children's Research Institute. Tkanka płuc pochodziła z nieleczonych myszy Balb/c oraz z modelu mysiego przewlekłej alergicznej choroby dróg oddechowych, który wykazuje wiele patologicznych cech ludzkiej astmy6. Doświadczenia na zwierzętach przeprowadzono zgodnie z wytycznymi i regulacjami określonymi przez Komitet Etyki Zwierząt Murdoch Children's Research Institute, który przestrzega australijskiego Kodeksu Praktyk w zakresie opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych do celów naukowych.
- Przekroje pozostawiono do wyschnięcia na powietrzu w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
Barwienie immunofluorescencyjne
- Przekroje utrwalono 2% (w/v) paraformaldehydem w soli fizjologicznej buforowanej fosforanowo (PBS) przez 20 minut.
- Przekroje poddano równoważeniu poprzez dwukrotne przemycie w PBS, po 15 minut każdy.
- Przekroje potraktowano 70% etanolem (schłodzonym do -20°C) przez 20 minut, a następnie trzykrotnie przemyto w PBS po 10 minut każde przemycie.
Na tym etapie preparaty można przechowywać w szczelnych pojemnikach w temperaturze 4°C przez maksymalnie 2 tygodnie.
- Przekroje płukano trzykrotnie w PBS po 10 minut każdorazowo, a następnie blokowano za pomocą 100μL świeżo przygotowanego roztworu 8% BSA w PBS zawierającym 0,5% Tween-20 i 0,1% Triton X-100 (PBS-TT) przez 1 h w temperaturze pokojowej.
Wszystkie inkubacje przeprowadzano w nawilżonej kuwecie do barwienia. - Przekroje płukano w PBS-TT przez 5 minut, a wokół tkanki wyznaczono obrys hydrofobowy za pomocą pisaka Pap pen.
- Nadmiar buforu odlano i do każdego przekroju dodano 100μl pierwszorzędowego króliczego poliklonalnego przeciwciała anty-γH2AX (rozcieńczonego 1:500 w 1% BSA w PBS; Millipore) i inkubowano przez 2 h w temperaturze pokojowej.
Inkubację z przeciwciałem pierwszorzędowym można przeprowadzać przez noc w temperaturze 4°C.
Aby dostarczyć dodatkowych dowodów na to, że ogniska γH2AX reprezentują DSB, można zastosować przeciwciało pierwszorzędowe rozpoznające białko naprawy DSB. Przykładowo, często stosowaną kombinacją jest kolokalizacja γH2AX i phospho-ATM. - Przekroje płukano dwukrotnie w PBS-TT po 5 minut każdorazowo, a następnie inkubowano z 100μl przeciwciała wtórnego (Alexa Fluor 488 kozi anty-rabbit IgG rozcieńczonego 1:500 w 1% BSA; Invitrogen) przez 1 godzinę w ciemności w temperaturze pokojowej. (Rozcieńczone przeciwciało przechowywano w ciemności przez cały czas trwania procedury).
- Przekroje płukano trzykrotnie w PBS-TT po 5 minut każdorazowo, a następnie inkubowano z RNAse A w stężeniu 0,5mg/mL przez 30 min w temperaturze 37°C.
- Przeciwbarwienie jąder komórkowych i montowanie wykonano przy użyciu medium Vectashield zawierającego jodek propidyny.
- Preparaty uszczelniono lakierem do paznokci i przechowywano przez noc w temperaturze 4°C w ciemności przed analizą.
Mikroskopia / Analiza
- Do pozyskania obrazów wykorzystano konfokalny mikroskop Zeiss LSM510 Meta, stosując standardowe lasery GFP (dla γH2AX - Alexa Fluor 488 kozi przeciwciało przeciw króliczym IgG) oraz PI (543 nm).
Obrazy pozyskano w serii Z z wielkością kroku 0,5 μm. Podczas analizy poszczególne płaszczyzny poddano dekonwolucji, a następnie zestawiono w stosie w celu uzyskania obrazu o maksymalnej projekcji, aby zminimalizować nakładanie się ognisk.
Metodę tworzenia obrazu maksymalnej projekcji przed przeliczeniem cząsteczek należy stosować wyłącznie w sytuacjach, gdy używany jest cienki przekrój (np. 5μm) i gdy barwienie tła jest nieznaczne. W przypadku konieczności analizy grubszych przekrojów z wyraźnym tłem należy zastosować bardziej złożoną analizę, taką jak 3D Object Counter, opisaną przez Bolte i Cordelieres (2006)7.
- Do stworzenia obrazów złączonych (czerwonych i zielonych) w celu ilościowego określenia liczby ognisk wykorzystano program Metamorph (Molecular Devices, USA).
Chociaż program Metamorph może być wykorzystywany do ilościowego określania liczby ognisk, w przypadku stosowania przekrojów tkanek ognisk zazwyczaj dokonuje się zliczenia ręcznego (wzrokowego), aby zapewnić większą dokładność.
Do kwantyfikacji można wybrać konkretne, interesujące typy komórek, na przykład komórki nabłonkowe płuc. Można to zrobić na podstawie histologii, odnosząc się do seryjnych skrawków barwionych hematoksyliną i eozyną.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Na potrzeby niniejszej demonstracji wykorzystaliśmy tkankę płuc myszy z nieleczonych myszy Balb/c oraz z mysiego modelu przewlekłej alergicznej choroby dróg oddechowych. Ilościowo określono różnice w liczbie ognisk na komórkę, obserwując nieco wyższe średnie w uszkodzonych płucach w porównaniu z nieleczonymi przekrojami. Konkretnie, analiza ilościowa wykazała odpowiednio 6,5 ognisk/komórkę oraz 9,4 ognisk/komórkę (ręczne przeliczanie 20 komórek na przekrój) w tkance nieleczonej i tkance z przewlekłą allergiczną chorobą d...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Podziękowania kierujemy do Australian Institute of Nuclear Science and Engineering za udzielone wsparcie. TCK otrzymał nagrody AINSE. Epigenomic Medicine Lab jest wspierany przez National Health and Medical Research Council of Australia (566559). LM korzysta ze wsparcia w ramach stypendiów Melbourne Research (University of Melbourne) oraz Biomedical Imaging CRC. Nieocenionym wsparciem dla niniejszej pracy była pomoc Monash Micro Imaging (dr Stephen Cody i dr Iśka Carmichael). MMT jest wdzięczny za ekspercką pomoc i porady dr Olgi Sedelnikovej z National Institutes of Health.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze | |
|---|---|---|---|---|
| albumina surowicy bydlęcej (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | BSA (1%) jest stosowany w celu zablokowania nieswoistego wiązania przeciwciał. Przeciwciała pierwszorzędowe i drugorzędowe są rozcieńczane w BSA. | |
| PBS (bez Ca2+)2+ or Mg2+) | Invitrogen | 17-517Q | ||
| Związek OCT (Optimal Cutting Temperature) 4583 | Tissue-Tek | 4583 | ||
| Superfrost Plus | Szkiełka z poli-L-lizyną | Menzel-Glaser | SF41296SP | Elektrostatycznie przyciąga zamrożone skrawki tkanek, co ogranicza konieczność stosowania dodatkowych powłok i substancji klejących. |
| Tween 20 | Odczynnik | Calbiochem | 655205 | Tween 20 (0,5%) jest detergentem służącym do permeabilizacji komórek |
| Triton X-100 | Odczynnik | Sigma-Aldrich | T8787 | Do permeabilizacji komórek zastosowano Triton X-100 (0,1%). |
| Paraformaldehyd | Odczynniki | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Przeciwciało przeciwko fosfo-γH2AX (królicze przeciwciało poliklonalne) | Przeciwciało pierwszorzędowe | Upstate, Millipore | 07-164 | Rozcieńczenie przeciwciała pierwszorzędowego (1:500) w 1% BSA. |
| Alexa Fluor 488 kozie przeciwkrólicze przeciwciało IgG (H+L) | Przeciwciało wtórne | Invitrogen | A-11008 | Rozcieńczenie przeciwciała wtórnego (1:500) w 1% BSA. |
| Etanol (70%) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | BSPEL316 | ||
| RNaza A | Odczynniki | Qiagen | 19101 | |
| Vectashield z jodkiem propidyny | Odczynnik | Vector Laboratories | H-1300 | Medium montażowe na bazie glicerolu zawierające jodek propidyny (czerwony barwnik jądrowy). Medium to należy stosować z obiektywem olejowym o odpowiadającym mu współczynniku załamania światła. Uwaga: powszechnie stosowany barwnik DNA: dihydrochlorek 4,6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI). Można go stosować wyłącznie w mikroskopach wyposażonych w odpowiedni laser wzbudzenia. |
| Mini PAP Pen | Invitrogen | 008877 | ||
| Szkiełka nakrywkowe (22x50 mm) | Menzel-Glaser | CS2250100 | ||
| naczynie Coplina, szklane | Grale Scientific P/L | 1771-OG | ||
| Kuweta do barwienia | Grale Scientific P/L | V1991.99 | ||
| Konfokalny mikroskop Zeiss LSM 510 Meta | Mikroskop konfokalny | |||
| Kriostat CM Leica 1950 | Leica Microsystems | |||
| Metamorph | Oprogramowanie do analizy obrazowania | Molecular Devices |
Bibliografia
- Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo. J. Cell Biol. 146, 905-916 (1999).
- Bonner, W. M. Gamma H2AX and cancer. Nature Reviews Cancer. 8 (12), 957-967 (2008).
- Dickey, J. S. H2AX: functional roles and potential applications. Chromosoma. 118 (6), 683-692 (2009).
- Bhogal, N. Late residual gamma-H2AX foci in murine skin are dose responsive and predict radiosensitivity in vivo. Radiat Res. 173 (1), 1-9 (2010).
- Redon, C. E., Dickey, J. S., Bonner, W. M., Sedelnikova, O. A. gamma-H2AX as a biomarker of DNA damage induced by ionizing radiation in human peripheral blood lymphocytes and artificial skin. Adv Space Res. 43 (8), 1171-1178 (2009).
- Locke, N. R., Royce, S. G., Wainewright, J. S., Samuel, C. S., Tang, M. L., L, M. Comparison of airway remodeling in acute, subacute, and chronic models of allergic airways disease. Am J Respir Cell Mol Biol. 36 (5), 625-632 (2007).
- Bolte, S. &, Cordelieres, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. J Microsc. 224 (Pt 3), 213-232 (2006).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
