Dożylne mikroiniekcje u larw rybiek zebra w celu badania ostrego uszkodzenia nerek

Podsumowanie

Opisujemy technikę mikroiniekcji aminoglikozydu, gentamyciny, do larw zebrafish w 2. dniu po zapłodnieniu (dpf) w celu wywołania ostrego uszkodzenia nerek (AKI). Opisujemy również metodę immunohistochemii całego preparatu, zatapiania w plastiku i sekcjonowania larw zebrafish w celu wizualizacji uszkodzeń wywołanych przez AKI.

Streszczenie

W niniejszym artykule wideo opisujemy model ostrej niewydolności nerek (AKI) u danio pręgowanego, wykorzystując gentamicin jako nefrotoksynę. Technika ta polega na mikroiniekcjach dożylnych u larw danio pręgowanego w 2. dobie po zapłodnieniu (dpf). Metoda ta stanowi wydajny i szybki sposób dostarczania substancji rozpuszczalnych do krwiobiegu larw danio pręgowanego, umożliwiając iniekcję od 15 do 20 ryb na godzinę. Poza badaniami nad AKI, technika mikroiniekcji może być stosowana w innych rodzajach badań eksperymentalnych, takich jak angiografia. Przedstawiamy szczegółowy protokół tej techniki – od niezbędnego sprzętu po wizualne wskaźniki obniżonej funkcji nerek. Ponadto demonstrujemy proces fiksacji, immunohistochemię całego preparatu z zastosowaniem markera kanalików nerkowych, zatapianie w plastiku oraz wykonywanie przekrojów larw danio pręgowanego. Wykazujemy, że larwy danio pręgowanego po iniekcji gentamicyną wykazują cechy morfologiczne zgodne z AKI: obrzęki, utratę polaryzacji komórek nabłonka kanalików proksymalnych oraz morfologiczne uszkodzenie kanalików.

Protokół

Część poniższego protokołu opiera się na opublikowanych metodach opisanych przez (Hentschel et al. 2005) oraz (Weinstein et al. 1995) z niewielkimi modyfikacjami.

Część 1: Mikroiniekcje

Przygotuj stanowisko do mikroiniekcji z wyprzedzeniem

• Ryby są poddawane iniekcji w 2. dniu po zapłodnieniu (dpf). W związku z tym dorosłe zebrafish są rozmnażane na 3 noce przed planowanym eksperymentem. Należy zebrać embriony i umieścić je w szalce Petri z wodą E3 (5mM NaCl, 0.17mM KCL, 0.33mM CaCl₂, 0.33mM MgSO₄) w temperaturze 28.5°C. Na koniec pierwszego dnia należy usunąć martwe embriony z szalki Petri i rozdzielić embriony tak, aby w jednej szalce znajdowało się 80-100 embrionów.
• Należy przygotować szklane igły, wyciągając je z rurek kapilarnych (długość 4 cali, 0.63/ 0.20 OD/ID milimetr (mm) R-6 Custom Glass Tubing Drummond scientific company, Broomall, PA 9-000-3000) za pomocą wyciągacza elektrod. Średnica końcówki powinna wynosić 10-20 μm. Pod mikroskopem stereoskopowym (Leica S6E), przy pomocy linijki, należy narysować markerem permanentnym około 10 linii co 1mm wzdłuż igły, a następnie przechowywać igły w dużej szalce Petri na podpórkach z gliny.
• Przygotowanie pipety trzymającej: Końcówkę cienkościennej rurki kapilarnej z borokrzemianu szkła (152 mm, 1 / 0.75 OD/ID mm TW100-6, World Precision Instruments, Inc.) należy wypalić w płomieniu palnika Bunsena, aż średnica wewnętrzna końcówki wyniesie 0.4-0.5 mm. Taki wymiar zapewnia pewny chwyt pęcherzyka żółtkowego larwy zebrafish w 2. dniu dpf. Jeden koniec odcinka kapilary szklanej należy trzymać długą pęsetą, a przeciwległą końcówkę kapilary ogrzewać palnikiem Bunsena, umieszczając ją pionowo nad jasnoniebieskim wewnętrznym stożkiem płomienia (najgorętszą częścią) przez 1-2 sekundy, obracając ją w celu uzyskania równomiernego stopu. Czynność tę należy powtórzyć kilka razy, a następnie zbadać kapilarę pod mikroskopem, korzystając z mikrometru przedmiotowego (Ward's 94 W 9910). Jest to krok krytyczny; może być konieczne wypalenie kilku pipet trzymających i późniejszy wybór odpowiedniego rozmiaru podczas manipulowania larwami. Przy zachowaniu ostrożności jedna pipeta trzymająca wystarcza na wiele sesji mikroiniekcji.
• Ręczną pompę mikrostrzykawkową (MMP, World Precision Instruments, Inc.) należy napełnić olejem mineralnym zgodnie z instrukcjami producenta. Uchwyt pipety jest umieszczony w manipulatorze joystickowym (Narishige, MN-151), połączonym za pomocą statywu magnetycznego (Narishige, MN 151) z płytą żelazną (Narishige, IP).

Mikroiniekcja

• Przygotować 20μl mieszaniny do iniekcji: 2,4μl gentamycyny (Sigma-Aldrich G8648, 50mg/ml w roztworze soli fizjologicznej) oraz 17,6μl dekstranu lucifer yellow 10-kDa (Invitrogen D1825, 1mg/ml w roztworze soli fizjologicznej). W rybach kontrolnych gentamycynę zastępuje się roztworem soli fizjologicznej. Fluorescencyjny dekstran (można zastosować wiele różnych kolorów) jest wystarczający do weryfikacji dokładności iniekcji i wyselekcjonowania larw, którym podano nefrotoksynę.
• Przygotować 2 szalki Petriego o średnicy 30mm z 2ml oleju mineralnego, aby umieścić w nich mieszaninę do iniekcji oraz mieszaninę kontrolną, co zapobiegnie odparowywaniu roztworów.
• Przygotować środek znieczulający: 400 mg proszku trikainy (metanosulfonian etylo-m-aminobenzoesanu SIGMA A-5040), 97,7 ml wody DD, 2,1 ml 1M Tris (pH 9). Dostosować pH do wartości 7. Przechowywać ten roztwór stokowy w zamrażarce w aliquotach po 4,2 ml. Aby zastosować trikainę jako środek znieczulający, rozcieńczyć 4,2 ml roztworu stokowego trikainy w 100 ml wody E3 (Westerfield 1993) i pozostawić w temperaturze pokojowej.

Kolejne kroki są wykonywane pod mikroskopem stereoskopowym

• Ręcznie usuń pozostałe choriony za pomocą pęsety precyzyjnej i znieczul rybki danio prążkowane, przenosząc je do szalki Petriego z tricainem ogrzanym do temperatury pokojowej. Rybki danio prążkowane powinny być poddane działaniu tricainu przez co najmniej 15 minut przed rozpoczęciem mikroiniekcji.
• Otwórz końcówkę igły do iniekcji za pomocą żyletki (VWR scientific 55411-050). Trzymaj ostrze pod niewielkim kątem, aby stworzyć skos, i odetnij końcówkę w taki sposób, aby uzyskać otwór o średnicy około 10-20μm.
• Włącz zasilanie, próżnię i dopływ powietrza w aparacie do mikroiniekcji (World precision instruments Inc., PV820 pneumatic picopump). Włóż igłę do uchwytu igły zamontowanego na mikromanipulatorze i podstawie pochylnej (Word Precision Instruments, Inc., Model M3301R, TB-1).
• Aby napełnić igłę, umieść kroplę (10μl) roztworu do iniekcji w 30mm szalce Petriego wypełnionej olejem mineralnym (Fisher Chemicals, 0121-1). Obróć ręczny mikromanipulator tak, aby zanurzyć końcówkę igły w kropli roztworu, ustaw przełącznik „hold/vent” picopompy na „vent” (pozycja „vent” odpowiada próżni w modelu PV820) i napełnij igłę, wciągając roztwór przez jej końcówkę. Zajmie to kilka minut; jeśli roztwór wnika do igły zbyt szybko, oznacza to, że średnica końcówki jest zbyt duża, co spowoduje brak precyzji iniekcji. Po napełnieniu igły ustaw picopompę na „hold” (pozycja „hold” odpowiada funkcji wstrzykiwania w modelu PV820).
• Aby skalibrować igłę, ustaw przełącznik „gated/timed” picopompy na „gated”, naciśnij pedał nożny, aby opróżnić igłę i zmierz czas (w sekundach), w jakim menisk przemieści się z jednej zaznaczonej linii do kolejnej (całkowita odległość 1 mm). Powtórz czynność 3 razy, oblicz średni czas (w sekundach) i podziel tę wartość przez 30 (objętość w nanolitrach (nl) odpowiadająca liniowej odległości 1 mm), aby wyznaczyć liczbę milisekund potrzebną do podania 1 nl roztworu. Ustaw pokrętło zakresu okresu na tę liczbę i przełącz przełącznik „gated/timed” na „timed”. Teraz picopompa jest ustawiona na podanie impulsu roztworu o objętości 1nl.
• Usuń szalkę z olejem mineralnym i ustaw szalkę Petriego z larwami pod mikroskopem. Zgrupuj rybki w centrum szalki Petriego i ustaw ostrość.
• Umieść pipetę przytrzymującą w ręcznej pompie mikrostrzykawkowej (MMP, World precision instruments) po przeciwnej stronie mikroinjektora, wysuń jej końcówkę do szalki Petriego i do płaszczyzny ostrości mikroskopu. Przechyl ją pod dość małym kątem, tak aby sam koniec pipety przytrzymującej dotykał dna szalki Petriego i znajdował się niemal poziomo. Upewnij się, że w układzie nie ma pęcherzyków powietrza, które spowolniłyby czas reakcji i zmniejszyły precyzję MMP.
• Zwiększ powiększenie mikroskopu i za pomocą superprecyzyjnej rzęsy z uchwytem (Ted Pella 113) ustaw larwy grzbietem do dołu, tak aby worek żółtkowy znajdował się bardzo blisko pipety przytrzymującej. Przytrzymaj larwę, wciągając żółtko do pipety przytrzymującej poprzez obrót w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara mikrometrycznego napędu sterującego ręczną pompą mikrostrzykawkową. Uważaj, aby nie obrócić mikrometru zbyt mocno, ponieważ żółtko może pęknąć, jeśli zostanie wciągnięte zbyt głęboko do pipety przytrzymującej. Ustaw ostrość na tworzącą się wspólną żyłę przednią, która znajduje się nad żółtkiem, tuż pod peridermem i jest miejscem bardzo silnego przepływu krwi. Za pomocą mikromanipulatora aparatu do iniekcji wprowadź igłę do rozwijającej się wspólnej żyły przedniej. Zazwyczaj konieczne jest lekkie cofnięcie igły po wprowadzeniu, ponieważ wspólna żyła przednia jest bardzo powierzchowna. Wstrzyknij 1nl roztworu, naciskając pedał nożny, a następnie zwolnij larwę z pipety przytrzymującej i przenieś ją z powrotem do wody dla embrionów. Jest to krytyczny etap, zwłaszcza przy pierwszej próbie, ponieważ wymaga pewnej praktyki w pozycjonowaniu ryb oraz kontrolowaniu ssania i ciśnienia zestawu. Jeśli żółtko embrionu jest prawidłowo przytrzymywane przez pipetę, nie będzie się obracać podczas wprowadzania igły.
• Aby zweryfikować sukces mikroiniekcji, monitoruj obecność dekstranu lucifer yellow w sercu rybki danio prążkowanej pod mikroskopem fluorescencyjnym. Lucifer yellow pozostaje widoczny w sercu przez około 20 minut przed rozproszeniem się w układzie krwionośnym. Jeśli roztwór nefrotoksyczny został wstrzyknięty prawidłowo, w ciągu 2 godzin od iniekcji zobaczysz bardzo mało dekstranu lucifer yellow pozostałego w miejscu wstrzyknięcia. Jeśli roztwór zostanie wstrzyknięty do worka żółtkowego, w miejscu iniekcji pozostanie plamka dekstranu lucifer yellow (Ryc. 1). Przenieś rybki do medium E3.
• Dwa dni po iniekcji u larw rozwija się obrzęk osierdzia w wyniku zmniejszenia funkcji nerek (Ryc. 2).

Część 2: Fixacja i immunofluorescencja z użyciem przeciwciała przeciwko Na⁺/K⁺ ATPase (α-6F)

• W 4. dniu po zapłodnieniu (dpf) umieść od 10 do 15 larw danio pręgowanego w szklanych fiolkach o pojemności 4 ml (Weathon, 225012) i utrwal je w 1 ml utrwalacza Dent's (80% MeOH 20% DMSO) przez 4 godziny w temperaturze pokojowej (RT).
• Rehydratuj embriony w serii rozcieńczeń MeOH/PBT (PBS z 0,5% Tween20) w proporcjach 75:25, 50:50, 25:75 oraz 100% PBT, odpipowując roztwór i dodając nowy roztwór do tej samej fiolki (1 ml roztworu na fiolkę), przez 20 minut w każdym roztworze. Larwy nie mogą zostać wystawione na działanie powietrza; podczas wymiany roztworów pozostaw niewielką ilość cieczy pokrywającej larwy.
• Usuń PBT i zastąp 1 ml roztworem blokującym (PBS z 1% DMSO, 0,5% Tween20, 10% normalnego surowicy koziej) na 3 godziny w temperaturze 4 °C na nutatorze.
• Przenieś larwy do probówki mikrocentryfużowej o pojemności 2 ml. Usuń surowicę blokującą i zastąp ją 300 μl przeciwciała pierwszorzędowego w roztworze inkubacyjnym (PBS z 1% DMSO, 0,5% Tween20, 2% normalnej surowicy koziej) przez noc w temperaturze 4 °C na nutatorze. Stosujemy monoklonalne przeciwciało przeciwko Na⁺/K⁺ ATPase (α-6F, supernatant, Developmental Studies Hybridoma Bank, Iowa) w rozcieńczeniu 1:25.
• Usuń przeciwciało pierwszorzędowe i przemywaj 3 x 30 minut roztworem inkubacyjnym w temperaturze pokojowej (RT).
• Inkubuj z przeciwciałem wtórnym (goat anti-mouse cy3, Jackson Immunoresearch Laboratories, Inc. 155-165-003) rozcieńczonym 1:500 w roztworze inkubacyjnym przez 2 godziny w temperaturze pokojowej (RT).
• Przemywaj 3 x 30 minut roztworem PBT.

Część 3: Zatapianie w plastiku z użyciem JB-4

• Odwodnij tkanki, stosując szereg stężeń etanolu (50%; 75%; 95%; 100% x 2), przez 10 minut na każdym etapie.
• Przygotuj roztwór do infiltracji: 25 ml JB-4 Embedding Solution A (Polysciences 0226A) oraz 0,24 g katalizatora (Polysciences 02618). Rozpuszczenie katalizatora trwa około 20-30 minut. Roztwór można przechowywać w temperaturze 4°C do 1 miesiąca.
• Odlej 100% etanol i zastąp go roztworem do infiltracji z tworzywa sztucznego. Umieść fiolki w temperaturze 4°C na rotatorze i pozostaw do czasu, aż larwy opadną na dno szklanej fiolki. Proces ten trwa zazwyczaj około 30 minut.
• Protokół zatapiania: Umieść tackę z plastikowymi formami do zatapiania (Polysciences, Inc. 16643A) pod mikroskopem stereoskopowym. Przenieś larwy wraz z przykrywającym je roztworem do infiltracji do form. Plastikowe medium do zatapiania przygotowuje się w małej plastikowej probówce. Zazwyczaj zatapiamy 4-5 ryb jednocześnie, po jednej rybie w każdej formie. Przygotuj 5-6 ml plastiku do zatapiania (1,2 ml roztworu do zatapiania na każdą formę), dodając 35 μl JB-4 Embedding Solution "B" (Polysciences Inc. 0226B) na każdy ml roztworu do infiltracji. Dodaj 35 μl JB-4 Embedding Solution "B" (Polysciences Inc. 0226B) na każdy ml roztworu do infiltracji. Wymieszaj dokładnie, pipetując w górę i w dół plastikową pipetą Pasteura kilka razy. Jest to istotne, ponieważ w przypadku niedokładnego wymieszania JB-4 nie spolimeryzuje się prawidłowo. Po przygotowaniu 5 ml plastiku do zatapiania, usuń pipetą Pasteura plastik do infiltracji z okolic próbek. Wypełnij formę plastikiem do zatapiania. Plastik musi wypłynąć z formy, aby zapewnić dobre przyleganie uchwytu bloku do preparatu. W celu wykrycia kanalików nerkowych zebrafish najlepsze są przekroje poprzeczne. W tym celu ryby zatapia się pionowo, głową w dół. Za pomocą rzęsy z uchwytem lub precyzyjnej pęsety okresowo ustawiaj ryby pionowo, dopóki plastik nie stwardnieje na tyle, by nie przesuwały się z pozycji. Trwa to około 20-30 minut. Następnie nałóż uchwyt do bloków EBH-2 Block Holder (Polysciences Inc. 15899) na formy i pozostaw tackę w temperaturze 4°C na noc. Po zakończeniu polimeryzacji bloki można wycisnąć jak kostki lodu.
• Alternatywny protokół zatapiania dla wielu larw: Wypełnij formy do połowy całkowitym JB-4 i pozwól mu spolimeryzować. Dla form kwadratowych 15 mm używamy objętości JB-4 wynoszącej 700 μl, aby wypełnić formę do połowy. Następnie dodaj namoczone w JB-4 larwy z utwardzaczem do wstępnie spolimeryzowanych, wypełnionych do połowy form. Ustaw larwy głowami w stronę dłuższej strony formy i wyrównaj je tak, aby gałki oczne znajdowały się w jednej linii (w jednej formie można umieścić 10 ryb w linii). Po spolimeryzowaniu bloku można odciąć jego krawędzie, obrócić go tak, aby bok był skierowany w stronę noża i przykleić go klejem cyjanoakrylowym do plastikowego uchwytu („chuck”), który pasuje do mikrotomu. Dzięki tej metodzie można umieścić dużą liczbę larw w jednym bloku, wycentrowanych w plastiku i gotowych do przekrojów poprzecznych. Należy zachować ostrożność przy orientowaniu bloku względem noża, aby w jednym przekroju uzyskać równoważne sekcje każdej ryby. Można to osiągnąć, wykonując przekroje przez oczy: należy zorientować blok tak, aby dla każdej ryby pobrano równoważne sekcje oczu. Wynikiem końcowym jest możliwość jednoczesnej analizy wielu ryb na jednym szkiełku mikroskopowym.

Część 4: Krojenie

• Zamocuj preparat w uchwycie mikrotomu (używamy mikrotomu Shandon Finesse Thermo Electro Corporation)
• Ustaw podgrzewacz do szkiełek na 45°C.
• Nalej wodę dejonizowaną do zlewki i postaw ją w pobliżu mikrotomu
• Przed przystąpieniem do cięcia upewnij się, że blok jest zorientowany w taki sposób, aby uzyskać idealne przekroje poprzeczne ryby. Dźwignie regulacji głowicy orientującej można obracać, co umożliwia precyzyjne ustawienie głowy preparatu względem noża. Rozpocznij wycinanie grubych sekcji przez głowę ryby. Podczas cięcia przez oczy zorientuj blok tak, aby dla każdej ryby pobrano równoważne przekroje oczu. Pojawienie się płetw piersiowych w przekrojach oznacza początek cewek pronefrycznych. Od tego momentu wytnij z bloku około 32 sekcji o grubości 4 um.
• Zbieraj sekcje pęsetą i pozwól im opaść do zlewki z wodą, nie dotykając pęsetą tafli wody. Sekcja rozszerzy się natychmiast po zetknięciu z powierzchnią wody; teraz można ją przenieść na szkiełko. Włóż szkiełko do wody pod kątem 45° i zbliż się do sekcji za pomocą rzęsówki z uchwytem, dotykając jedynie krawędzi sekcji.
• Inkubuj szkiełka na podgrzewaczu do całkowitego wyschnięcia.
• Wykonaj obrazowanie sekcji przy użyciu mikroskopii epifluorescencyjnej lub konfokalnej.

Część 5: Reprezentatywne wyniki

Przy prawidłowym wykonaniu wstrzyknięte ryby wyglądają jak na rysunku 1, z niewielką ilością fluorescencyjnego dekstranu (w tym przypadku Lucifer Yellow) widoczną w sercu i w układzie krwionośnym. Jeśli wstrzyknięcie jest zbyt głębokie, wstrzyknięty materiał może gromadzić się w worku żółtkowym lub może dojść do przebicia serca, co spowoduje nadmierny krwotok. Jeśli pipeta trzymająca zostanie wykonana prawidłowo, ryba nie będzie się obracać ani poruszać podczas iniekcji, co pozwoli na bardziej precyzyjne wstrzyknięcie. Ważne jest również upewnienie się, że w MMP nie ma pęcherzyków powietrza, co spowolniłoby czas reakcji i zmniejszyło precyzję systemu. Zazwyczaj, w wyniku nefrotoksyczności gentamycyny, u 80% wstrzykniętych ryb rozwija się obrzęk osierdzia (Rys. 2). Stosujemy system klasyfikacji oparty na fenotypie, w którym ryby z umiarkowanym obrzękiem wykazują wyraźny obrzęk osierdzia, ale nie wykazują innych obserwowalnych fenotypów, natomiast ryby z ciężkim obrzękiem wykazują obrzęk osierdzia i tułowia wraz z lekkim do umiarkowanego wygięciem osi ciała. Używając przeciwciała przeciwko Na⁺/K⁺ ATPase (α-6F) specyficznego dla kanalików nerkowych, możemy zwizualizować uszkodzone kanaliki w przekrojach poprzecznych, z wyraźną utratą polaryzacji komórek i destrukcją kanalików w próbkach uszkodzonych w porównaniu z grupą kontrolną (Rys. 3). Wzór ten jest spójny w wielu przekrojach poprzecznych. Aby uzyskać idealne przekroje poprzeczne kanalików nerkowych, ważne jest prawidłowe ustawienie ryby podczas zatapiania w medium. Podczas porównywania przekrojów jako markery anatomiczne wykorzystuje się płetwy piersiowe i proksymalne kanaliki kręte.

Rysunek 1. Mikroiniekcja nefrotoksyny. (A) Pomyślna iniekcja dekstranu 10kDa sprzężonego z lucifer yellow, z rozmytą ekspresją w wspólnej żyle głównej, biała strzałka. (B) Nieprawidłowa iniekcja, skutkująca złogiem dekstranu 10kDa sprzężonego z lucifer yellow, który nie rozprasza się w układzie krwionośnym, czerwona strzałka.

Rysunek 2. Obrzęk wywołany gentamycyną. (A) Larwa danio pręgowanego z grupy kontrolnej po iniekcji. Larwy danio pręgowanego po iniekcji gentamycyny z (B) umiarkowanym lub (C) silnym obrzękiem. Wszystkie larwy są w 4 dpf; przód znajduje się po lewej stronie, a góra po stronie grzbietowej. Czarne strzałki wskazują obrzęk osierdzia w B i C.

Rycina 3. Immunohistochemia AKI. Barwienie przeciwciałem α-6F na Na⁺/K⁺ ATPase 48 godzin po wstrzyknięciu gentamycyny (larwy w 4 dpf) w grupie kontrolnej (A,B) oraz u larw po wstrzyknięciu gentamycyny (C,D). Panele A i C przedstawiają powiększenie 20X, natomiast B i D to cyfrowe powiększenia 3X prawych kanalików z paneli A i C. Zwrócić uwagę na utratę polaryzacji podstawno-bocznej i zniszczenie kanalików (biała strzałka) w panelu D w porównaniu do B.

Dyskusja

W niniejszym artykule wideo zaprezentowaliśmy technikę mikroiniekcji dożylnych dla modelu AKI, poprzez wywołanie uszkodzeń cewistek proksymalnych za pomocą gentamycyny u larw zebrafish. Uszkodzenia te prowadzą do powstania obrzęku osierdziowego i/lub ogólnego, co odzwierciedla niezdolność do regulacji gospodarki wodnej. Opisaliśmy również eksperyment immunohistochemiczny z użyciem przeciwciała znakującego zróżnicowane cewki nerkowe (Majumdar et al. 2000), wykazujący utratę polaryzacji komórek oraz przerwanie ciągłości cewki proksymalnej w uszkodzonych nerkach. Mikroiniekcje dożylne stanowią efektywną metodę wprowadzania substancji rozpuszczalnych do krwiobiegu larw zebrafish. Technika ta jest doskonałym narzędziem do wprowadzania różnych substancji, a dzięki zastosowaniu znacznika fluorescencyjnego możliwe jest wielokrotne powtarzanie jednolitych iniekcji, co pozwala na uzyskanie spójnych wyników.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
αmysi przeciwciało monoklonalne 6F	Bank Hybrydomy Badań Rozwojowych
Uchwyt do kasetek EBH-2	Polysciences, Inc.	15899
Kapilary z borokrzemianowego szkła	World Precision Instruments, Inc.	TW100-6
Kapilary R-6 Custom Glass Tubing	Drummond Scientific	9-000-3000
Proszek katalityczny	Polysciences, Inc.	02618
Cy3	Jackson ImmunoResearch	155-165-003
Dextran 10k z żółcią lucyferową, z możliwością utrwalania lizyną	Molecular Probes, Life Technologies	D1825
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418
Rzęsa	Ted Pella, Inc.	113
Siarczan gentamycyny	Sigma-Aldrich	G8648
Fiolki szklane 4 ml	Weathon	225012
Płyta żelazna	Narishige International	IP
Roztwór do zatapiania JB-4 A	Polysciences, Inc.	0226A
Roztwór zatapiający JB-4 B	Polysciences, Inc.	0226B
Mikromanipulator z joystickiem	Narishige International	MN 151
Statyw magnetyczny	Narishige International	MN-151
Ręczna pompa mikroszprycowa	World Precision Instruments, Inc.
Aparat do mikroiniekcji	World Precision Instruments, Inc.	PV820
Mikromanipulator	World Precision Instruments, Inc.	M3301R
Mikrotom	Thermo Fisher Scientific, Inc.	Shandon Finesse
Olej mineralny, lekki	Fisher Scientific	0121-1
Wciągacz pipet	Kopf Instruments	720
Taca z plastikowymi formami w kształcie kubeczków	Polysciences, Inc.	16643A
Żyletka	VWR international	55411-050
Podgrzewacz do szkiełek	Instrumenty Labline
Mikrometr przedmiotowy	ODKŁAD’Nauki przyrodnicze	94 W 9910
Podstawa z funkcją przechylania	World Precision Instruments, Inc.	Gruźlica 1
Proszek tricainy	Sigma-Aldrich	A-5040
Tween 20	Sigma-Aldrich	P7949
Mikroskop	Leica Microsystems	S6F	Mikroskop stereoskopowy
Mikroskop	Leica Microsystems	M205FA	Mikroskop fluorescencyjny