Wielokolorowe obrazowanie poklatkowe transgenicznego danio pręgowanego: wizualizacja komórek macierzystych siatkówki aktywowanych przez celowaną ablację komórek neuronalnych

Summary

W tym filmie przedstawiono techniki wielokolorowego konfokalnego obrazowania poklatkowego i celowanej ablacji komórek. Obrazowanie poklatkowe służy do monitorowania zachowania wielu typów komórek będących przedmiotem zainteresowania in vivo. Celowana ablacja komórek ułatwia badanie funkcji obwodów nerwowych i paradygmatów regeneracji neuronów specyficznych dla komórki.

Abstract

Wysokorozdzielcze obrazowanie poklatkowe żywych larw danio pręgowanego może być wykorzystane do wizualizacji przebiegu procesów biologicznych (zobacz ¹). Złożone transgeniczne ryby, które wyrażają różne fluorescencyjne reportery w sąsiednich typach komórek, zapewniają sposób śledzenia interakcji komórkowych ² i / lub odpowiedzi na poziomie tkankowym na eksperymentalne manipulacje w czasie. W tym filmie pokazujemy metody, które można wykorzystać do obrazowania wielu transgenicznie znakowanych typów komórek seryjnie u poszczególnych ryb w czasie, który może trwać od kilku minut do kilku dni. Opisane techniki mają zastosowanie do każdego badania mającego na celu skorelowanie "zachowania" sąsiednich typów komórek w czasie, w tym: 1) metody seryjnego "złów i wypuść" do obrazowania dużej liczby ryb w ciągu kolejnych dni, 2) uproszczone podejścia do rozdzielania fluoroforów o nakładających się profilach wzbudzenia/emisji (np. GFP i YFP), 3) wykorzystanie hipopigmentowanych zmutowanych linii w celu przedłużenia okna czasowego dostępnego dla obrazowania w wysokiej rozdzielczości do późnych stadiów rozwoju larw, 4) zastosowanie ukierunkowanych na błonę fluorescencyjną reporterów w celu ujawnienia drobnych szczegółów morfologicznych pojedynczych komórek, jak również szczegółów komórkowych w większych populacjach komórek, oraz 5) wcześniej opisana metoda chemicznie indukowanej ablacji transgenicznie ukierunkowanych typów komórek; tj. konwersja substratów prolekowych, takich jak metronidazol (MTZ), za pośrednictwem nitroreduktazy (NTR), do pochodnych cytotoksycznych ^3,5.

Jako przykład tych podejść, będziemy wizualizować ablację i regenerację podtypu dwubiegunowego neuronu siatkówki u poszczególnych ryb przez kilka dni. Jednocześnie będziemy monitorować kilka innych typów komórek siatkówki, w tym sąsiednie niedocelowe komórki dwubiegunowe i potencjalne komórki macierzyste siatkówki stymulowane degeneracją (tj. glej Mϋllera). Strategia ta jest stosowana w naszym laboratorium do charakteryzowania reakcji na poziomie komórkowym i tkankowym (np. niszy komórek macierzystych) na selektywną utratę i regenerację docelowych typów komórek nerwowych.

Protocol

1. Linie transgeniczne i zmutowane

1. Ustanowienie/pozyskanie transgenicznych linii danio pręgowanego, które mają typy komórek będące przedmiotem zainteresowania zróżnicowane oznakowane fluorescencyjnymi wariantami reporterowymi. Optymalnie, profil wzbudzenia/emisji wybranych reporterów powinien w minimalnym stopniu się pokrywać (np. ECFP i EYFP), jednak nie jest to bezwzględnie wymagane. Dla naszych celów zastosowanie fluorescencyjnych reporterów na uwięzi błonowej znacznie ułatwia obrazowanie drobnych szczegółów komórkowych, takich jak procesy neurytyczne, w celu określenia liczby pojedynczych komórek i/lub morfologii w dużych, zmieszanych grupach oraz "podkreślenia" regionów o wysokiej zawartości błony, takich jak neuropils synaptyczny.
2. W przypadku obrazowania w późnych stadiach larwalnych pomocne jest wyprowadzenie/skrzyżowanie linii transgenicznych ze zmutowanymi tłami, które zmniejszają pigmentację [np. Roy Orbison (Roy) lub Roy Orbison; Albinos (Roy; alb); ⁴]. Z naszego doświadczenia wynika, że redukcja irydyforów (np. Roy) jest najbardziej krytyczną kwestią, melanogenezę można rozwiązać chemicznie za pomocą 1-fenylo2-tiomocznika (PTU) lub mutantów "albinosów", które nie mają melanoforów. Należy jednak zauważyć, że Ren i wsp. ⁴, wykazały deficyty wzroku i niewielkie zmiany morfologiczne w siatkówkach ryb pozbawionych melanaforów, oraz że intensywne światło może indukować śmierć fotoreceptorów u mutantów "albinosów". W związku z tym kwestie te należy wziąć pod uwagę przy projektowaniu eksperymentów obrazowych i/lub interpretacji danych.
3. Do tej demonstracji użyto transgenicznych i zmutowanych linii rybnych:
   1. Tg(nyx:Gal4-VP16)^q16a/+;Tg(UAS:gap43-YFP)^q16b/+; Tg(UAS-E1b:NfsB-mCherry)^c264/+; Tg(pax6-DF4:gap43-CFP)^q01/+; Roy^A9/A9
   2. Tg(nyx:Gal4-VP16)^q16a/+;Tg(UAS:gap43-YFP)^q16b/+; Tg(UAS-E1b:NfsB-mCherry)^c264/+; Tg(gfap:GFP)^mi2001/+; Roy^A9/+
   3. Uwaga: U ryb "1" subpopulacja dwubiegunowych komórek siatkówki zdefiniowanych przez promotor nyx wyraża znakowany błoną YFP i / lub reporter fuzji NTR-mCherry (większość wyraża oba), a prawie wszystkie komórki siatkówki wyrażają znakowany błoną CFP. Ryby "2" są jak powyżej, z wyjątkiem tego, że komórki glejowe Müllera wyrażają cytozolowy GFP, a globalna ekspresja CFP siatkówki została wyeliminowana. Ekspresja fuzji NTR-mCherry sprawia, że komórki dwubiegunowe zdefiniowane przez nyx są podatne na ablację indukowaną prolekami ^3,5.

2. Selekcja i przygotowanie zarodków/larw do obrazowania na żywo

1. Połącz interesujące nas linie transgeniczne/zmutowane, zbierz jaja i wysiaduj/utrzymuj w temperaturze 28,5°C w 0,3-krotnym roztworze Danieau (lub "pożywce zarodkowej" z wyboru).
2. Jeśli nie jest na tle "albinosa", należy dodać PTU w celu zahamowania aktywności tyrozynazy przed wystąpieniem jakichkolwiek dowodów pigmentacji w tkance będącej przedmiotem zainteresowania (np. ~16 hpf dla oka, 200 μM końcowy). Należy zauważyć, że leczenie PTU w stężeniach przekraczających 75 μM może powodować działanie toksyczne i/lub teratogenne. Jednak ze względu na to, że oko jest silnie pigmentowane, zabiegi poniżej 200 μM nie są odpowiednie do obrazowania konfokalnego o wysokiej rozdzielczości; W tych warunkach ważne jest, aby wybrać zdrowo wyglądające ryby do obrazowania. Do obrazowania innych tkanek preferowane może być PTU 75 μM. Ponadto, jak wspomniano powyżej, stosowanie zmutowanych linii "albinosów" eliminuje potrzebę leczenia zarodków PTU i jest preferowaną strategią obrazowania w późnych stadiach larwalnych.
3. Gdy reportery fluorescencyjne są widoczne, posortuj ryby według ekspresji transgenu i ogólnego stanu zdrowia za pomocą fluorescencyjnego mikroskopu stereo z zoomem lub podobnego.
4. Przed pierwszym dniem obrazowania rozpuść niskotopliwą agarozę (LMA) w pożywce zarodkowej do końcowego stężenia 0,5%, podgrzej i wymieszaj do uzyskania roztworu, przechowuj w temperaturze 40°C.
5. W pierwszym dniu obrazowania należy przygotować roztwór montażowy: dodać trikainę (środek znieczulający, 756 μM końcowy) i PTU (jeśli to konieczne) do 0,5% LMA w pożywce zarodkowej, delikatnie wymieszać i powrócić do temperatury 40°C.
6. Znieczulić ryby, przenosząc je do pożywki embrionalnej zawierającej PTU i/lub trikainę, poczekaj, aż ryby przestaną reagować na dotyk (~3 min).
7. Przenieść poszczególne ryby do roztworu montażowego, uważając, aby nie rozcieńczyć agarozy, aby można ją było ponownie wykorzystać. Do przenoszenia używamy mikropipety z przyciętą końcówką; pomaga to również w utrzymaniu kontrolowanej objętości (~30 μL). Po pobraniu odwróć pipetę i pozwól rybie osiąść na dnie, tak aby dotknięcie końcówki do roztworu montażowego umożliwiło przeniesienie grawitacyjne bez konieczności rozpraszania płynu.
8. Po przeniesieniu należy wyjąć roztwór znieczulający z mikropipety i użyć go do przeniesienia ryby w kropli ~30 μl roztworu montażowego na szalkę Petriego.
   Uwaga: Ta metoda montażu ma zastosowanie tylko w przypadku mikroskopii pionowej, w której będą używane obiektywy zanurzające w wodzie na dużą odległość roboczą. Aby zapoznać się z metodami dotyczącymi mikroskopów odwróconych, w których wymagane są szkiełka nakrywkowe, zob. Andersen i in., 2010; O'Brien i wsp., 2009; Graeden i Sive, 2009.
9. Powrót roztworu montażowego do bloku grzewczego 40°C.
10. Za pomocą szczoteczki do rzęs lub podobnego delikatnie obróć rybę do pożądanej orientacji i umieść interesujący Cię obszar pośrodku kropli agarozy.
11. Powtórz kroki od 6 do 10, aby zamontować żądaną liczbę zarodków na szalce. W przypadku seryjnych eksperymentów poklatkowych (patrz poniżej) zazwyczaj montujemy sześć ryb na raz i staramy się ograniczyć sesje obrazowania do 1 godziny na grupę.
12. Podczas wsiadania na inne ryby sprawdź ponownie, czy poprzednie obiekty utrzymują pożądaną orientację, dopóki agaroza nie zastygnie (~3 min).
13. Po zestaleniu się agarozy należy przetransportować ryby do stadium mikroskopu konfokalnego i delikatnie dodać do naczynia pożywkę zarodkową zawierającą PTU i/lub trikainę, aż wszystkie ryby zostaną całkowicie zanurzone.

3. "Wielokolorowe" obrazowanie konfokalne in vivo

Uwaga: Staraliśmy się uogólnić poniższy protokół tak, aby dostarczał istotnych informacji dla innych konfiguracji mikroskopów. Konkretne odniesienia do aplikacji Olympus i ImageJ znajdują się w cudzysłowie. Nasz system obrazowania to pionowy mikroskop konfokalny Olympus FV1000 wyposażony w lasery o długości fali 405, 440, 488, 515, 559 i 635 nm, dwa kanały detekcji filtrów o zmiennej barierze (umożliwiające regulację długości fali emisji w krokach co 1 nm), jeden standardowy kanał filtra barierowego (do obrazowania czerwieni i dalekiej czerwieni) oraz jeden kanał światła przechodzącego.

1. Otwórz oprogramowanie do obrazowania ("FV10-ASW") i użyj źródeł światła przechodzącego lub fluorescencyjnego, aby zlokalizować obszar zainteresowania. Aby uzyskać optymalne obrazowanie szczegółów komórkowych i/lub molekularnych, należy używać obiektywów o dużej odległości roboczej o wysokim N.A. (np. 60X, 1,2NA).
2. Jeśli zbierasz obrazy w świetle przechodzącym, ustaw ostrość przysłony pola dla oświetlenia Kohlera.
3. Wybierz odpowiednie fluorfory z "Listy barwników" lub załaduj parametry akwizycji z wcześniej zapisanego pliku obrazu. Dokonać korekt zakresów emisji ("ustawienie spektralne") niezbędnych do czystej separacji sygnałów reporterowych i/lub maksymalnych stosunków sygnału do szumu. Ustawienia te będą musiały być empirycznie zdefiniowane dla każdego eksperymentu, aby zminimalizować przesłuchy, ale zmaksymalizować sygnał; Ustawienia dla podanych tutaj przykładów są pokazane poniżej: Fluorofory Lasery (nm) Ustawienia bariery / Filtr emisji (nm) 1) ECFP, EYFP, mCherry* 440, 515, 559* 460-500, 530-545, 575-675 2) EGFP**, EYFP**, mWiśnia 488, 515, 559 500-515, 530-545, 575-675
   *Obrazowanie mCherry można poprawić przy użyciu lasera o większej długości fali (np. 568 lub 594 nm)
   **Tryb obrazowania sekwencyjnego umożliwiający wymianę zwierciadła dichroicznego i filtra barierowego ("kanały wirtualne") jest wymagany ze względu na nakładanie się emisji/wzbudzenia między GFP i YFP. GFP i mCherry mogą być przypisane do jednego kanału, YFP do osobnego kanału. Uwaga: przesłuchy między obrazami GFP i YFP będą widoczne przed odejmowaniem obrazu (część 6).
4. Upewnij się, że używany cel jest wybrany w menu rozwijanym, aby upewnić się, że wszystkie ustawienia wstępne zdefiniowane przez oprogramowanie są prawidłowo dostosowane.
5. Aby ustawić ostrość laserów i ustawić poziomy mocy, wybierz tabelę przeglądową (LUT), która ujawnia nasycenie pikseli ("Hi-lo") dla każdego kanału. Ustaw czułość detektora ("HV", napięcie PMT) na wartość zgodną z pożądaną jakością obrazu (zdefiniowaną empirycznie) i stopniowo zwiększaj moc lasera, aż intensywność obrazu będzie akceptowalna, unikając nasycenia pikseli.
6. Sprawdź przesłuchy między kanałami; upewnij się, że każda linia laserowa wytwarza wykrywalny sygnał tylko w odpowiednim kanale, ręcznie włączając i wyłączając lasery podczas monitorowania wszystkich kanałów obrazowania. Aby wyeliminować przesłuchy, zmniejsz moc lasera. Jeśli nie ma widocznych przesłuchów, wszystkie kanały mogą być odbierane jednocześnie, co zapewnia znaczną oszczędność czasu.
7. W przypadku nieuniknionego przesłuchu należy użyć trybu obrazowania "sekwencyjnego", który indywidualnie przełącza się między laserami/kanałami. Skrajne przypadki (np. obrazowanie GFP i YFP) wymagają użycia trybów sekwencyjnych, które również przełączają zwierciadła dichroiczne i/lub filtry barierowe ("kanały wirtualne"). Uwaga: ta opcja wprowadza znaczne opóźnienia czasowe w procesie pozyskiwania obrazu i może nie być odpowiednia do rejestrowania bardzo dynamicznych procesów.
8. Funkcje "Zoom" i "Rotation" mogą być używane do dalszego kadrowania obszaru zainteresowania. Zoom może być również używany do poprawy rozdzielczości obrazu, aż do limitów używanego obiektywu i formatu skanowania (np. 512 x 512; informacje na temat tych problemów można znaleźć w http://corefacilities.systemsbiology.net/imaging/documents/app_note_image_res.pdf).
9. W przypadku obrazowania in vivo w ogóle, a szczególnie w przypadku obrazowania poklatkowego, należy położyć nacisk na techniki, które minimalizują problemy związane z fototoksycznością (tj. akumulację wolnych rodników); w miarę możliwości należy stosować duże prędkości skanowania (np. 2 μs/piksel) i niskie poziomy mocy lasera (np. 1%), a także format skanowania o najniższej rozdzielczości, odpowiedni do uchwycenia istotnych informacji.
10. Aby poprawić rozdzielczość obrazu, podczas akwizycji można użyć uśredniania skanów ("Kalman"). Wolniejsze prędkości skanowania również poprawiają rozdzielczość, ale wydłużają czas przebywania lasera, co zaostrzy problemy z fototoksycznością i wybielaniem. Należy zauważyć, że oba te podejścia nie są idealne do tworzenia filmów poklatkowych ze względu na potencjalną niemożność uchwycenia szybkich zmian w serii z, zjawisko, które nazywamy "rozmyciem w czasie". Należy pamiętać, że uśrednianie według linii i klatki może pomóc w wyeliminowaniu problemów z "rozmyciem czasowym" w obrębie jednej płaszczyzny, ale nie w poprzek głębokości z.
11. Jeśli intensywność sygnału jest niska i nie jest wymagana maksymalna rozdzielczość obrazu (np. po prostu zliczanie numerów komórek), można użyć zwiększenia apertury konfokalnej (średnicy otworka) w celu wzmocnienia sygnału. Służy to utrzymaniu niskiej intensywności lasera, zmniejszeniu fototoksyczności i wybielania, jednak dostosowanie przysłony do wartości większej niż 1 jednostka przewiewna prowadzi do szybkiej utraty jakości obrazu.
12. Definiowanie wymiarów głębi z przy użyciu trybu szybkiego skanowania ("Focus x4"). Ponieważ intensywność sygnału zazwyczaj zmniejsza się wraz z głębokością z, najlepiej jest rozpocząć akwizycję stosu z użyciem metody od najmniejszej głębokości i zakończyć na najbardziej powierzchownej, co pozwala na uzyskanie trudniejszych sygnałów, zanim dojdzie do znacznego blaknięcia.
13. Sprawdź, czy wykrywanie sygnału jest odpowiednie w całej głębi obrazu. W razie potrzeby można użyć funkcji korekcji jasności w wymiarze z ("Bright Z") w celu dostosowania parametrów akwizycji obrazu na określonych głębokościach.
14. Ustaw rozmiar kroku wymiaru Z zgodnie z potrzebami eksperymentalnymi. Na przykład w naszym pierwszym przykładzie (Rysunek 1) po prostu przeprowadzaliśmy "spis komórek" w poszczególnych siatkówkach w ciągu kolejnych dni, a więc ustawiliśmy głębokość z na 15 mikronów i wykonaliśmy od pięciu do siedmiu obrazów na siatkówkę. Ta strategia pozwoliła nam na pobranie próbki każdej siatkówki bez nakładania się komórek między obrazami. W naszym drugim przykładzie (Rysunek 2) przeprowadziliśmy szybkie filmy poklatkowe 4D, w których sygnały GFP i mCherry musiały być przestrzennie skorelowane, dlatego ustawiliśmy rozmiar kroku na trzykrotność teoretycznej rozdzielczości bocznej, co było kompromisem, który pozwolił na robienie obrazów ze stosu z co 5-10 minut, ale nadal służył do rozwiązywania indywidualnych szczegółów komórkowych.
15. Pobieraj obrazy ("XYLZt") i zapisz. Przejdź do następnej ryby, jeśli wykonujesz seryjny eksperyment poklatkowy (patrz #4 poniżej). Aby uzyskać informacje na temat szybkiego obrazowania poklatkowego, patrz #5 poniżej.

4. Seryjne obrazowanie "złów i wypuść": metoda śledzenia zmian komórkowych u poszczególnych ryb w ciągu kolejnych dni

1. Protokół "złów i wypuść" jest stosowany w celu zminimalizowania czasu unieruchomienia ryb i zwiększenia liczby ryb obrazowanych w jednym eksperymencie. Użyteczność tej techniki ogranicza się do procesów biologicznych, które rozwijają się w ciągu kilku dni (np. Mumm i in. 2006:²). Jedną z zalet tego podejścia jest to, że pozwala ono na wewnętrzną kontrolę wszelkich zaobserwowanych zmian; tj. porównania między różnymi stanami jednostek, a nie między populacjami. Na przykład śledzenie zmian w liczbie znakowanych komórek obecnych w danej tkance może być wykonane dokładnie, nawet jeśli liczba komórek początkowo znakowanych różni się znacznie między poszczególnymi rybami. Metody stosowania tego protokołu w kontekście testu ablacji komórek indukowanego prolekiem ^3,5 przedstawiono tutaj.
2. Aby zobrazować ablację i regenerację docelowych typów komórek u poszczególnych ryb w czasie, obrazy konfokalne są uzyskiwane przed podaniem proleku (przed leczeniem), bezpośrednio po usunięciu proleku (po leczeniu) oraz w okresie rekonwalescencji (obrazy odzyskiwania).
3. Obrazowanie przed zabiegiem: Ryby są montowane i obrazowane jak powyżej. Po zobrazowaniu ryby są uwalniane do pożywki zarodkowej (+ proleku) i inkubowane w temperaturze 28,5°C do czasu sesji obrazowania po zabiegu. Praca w dwuosobowych zespołach, z których jeden montuje i wypuszcza ryby, a drugi obrazowanie jest dobrym sposobem na maksymalizację liczby ryb, które można sfotografować dziennie.
4. Po zobrazowaniu wszystkich ryb w jednym naczyniu należy zastąpić pożywkę zarodkową zawierającą trikainę samą pożywką zarodkową (+/- PTU).
5. Aby uwolnić rybę, użyj kleszczy jubilerskich, aby przeciąć agarozę po obu stronach larw, a następnie delikatnie odkurz agarozę, aż ryba będzie swobodnie unosić się w pożywce embrionalnej.
6. Ablacja indukowana prolekami: Przenieść larwy do pojedynczego dołka na płytce wielodołkowej zawierającej pożywkę zarodkową (+/- PTU) + prolek (np. 10 mM metronidazolu, MTZ). Aby zapewnić dokładne końcowe stężenia proleku, zazwyczaj porcjujemy określoną objętość pożywki zarodkowej (+/- PTU) zawierającej 2-krotne stężenie proleku (np. 20 mM) do każdego dołka. Ryby są następnie dodawane do studzienek w równej objętości pożywki zarodkowej (+/- PTU), aby doprowadzić końcowe stężenie proleku do 1X.
7. Inkubować w temperaturze 28,5°C do momentu weryfikacji celowej ablacji komórek.
   Uwaga: Schematy leczenia prolekowego wymagane do osiągnięcia skutecznej ablacji różnią się w zależności od docelowego typu komórek; stężenie proleku i czas trwania leczenia będą musiały być określone empirycznie, należy pamiętać, że wysokie stężenia powodują ogólną toksyczność, np. >10 mM MTZ. Ponadto trwałość fragmentarycznych sygnałów reporterowych może komplikować ocenę powodzenia ablacji, w niektórych przypadkach wymagana jest mikroskopia konfokalna, aby odpowiednio zobrazować utratę komórek.
8. Obrazowanie po zabiegu: Ryby są montowane w taki sposób, aby ta sama tkanka była optymalnie zorientowana i zobrazowana jak powyżej. Po zobrazowaniu wszystkich ryb znajdujących się na danej płytce, są one uwalniane do podłoża zarodkowego (+/- PTU) do poszczególnych studzienek (jak wyżej) i inkubowane w temperaturze 28,5°C, aby umożliwić regenerację typu komórek, którym poddano ablację.
9. W zależności od wieku ryb i czasu potrzebnego do wyzdrowienia, może być konieczne karmienie ryb na tym etapie testu. Używamy żywego pokarmu, takiego jak pantofelek lub wrotki, aby zapewnić optymalne przetrwanie. Zaleca się również codzienne dostarczanie świeżych pożywek, szczególnie jeśli ryby są przechowywane w małych ilościach (np. płytki 96-dołkowe).
10. Obrazowanie regeneracyjne: Aby udokumentować kinetykę wymiany komórek, ryby mogą być obrazowane codziennie w okresie rekonwalescencji. Po ustaleniu kinetyki test można uprościć, uzyskując obrazy odzyskiwania tylko w punktach czasowych będących przedmiotem zainteresowania (np. pełne wyzdrowienie). Rycina 1 przedstawia przykład takiego podejścia z naszych badań nad regeneracją komórek siatkówki.
11. Na zakończenie eksperymentu ryby powinny zostać poddane eutanazji przez zanurzenie w 20-krotnym roztworze trikainy (15,3 μM) na lodzie.

5. Szybkie obrazowanie poklatkowe.

1. W przypadku szybkiego obrazowania poklatkowego (tj. "filmów") wielu fluorforów kluczowe znaczenie mają techniki minimalizujące problemy z fototoksycznością (patrz wyżej). Jak wspomniano powyżej, technika ta najlepiej nadaje się do fluorforów umożliwiających obrazowanie symultaniczne, a nie sekwencyjne
2. Utrzymuj ryby w temperaturze 28,5°C za pomocą podgrzewanego stage'u, szklanego elementu grzejnego ITO lub podobnego.
3. Stosować metody, które zmniejszają parowanie, aby pomóc ustabilizować temperaturę i osmolarność (np. szkiełka nakrywkowe uszczelnione pierścieniami uszczelnionymi o-ringiem do mikroskopów odwróconych).
4. Jeśli korzystasz z automatycznej akwizycji przez dłuższy czas, pamiętaj, aby ustawić rozmiar stosu tak, aby umożliwić wzrost i/lub dryf w wymiarze z.
5. Ustaw interwały czasowe i liczbę skanowań ("TimeScan" lub "TimeController"). Wskaźniki akwizycji będą musiały zostać ustalone empirycznie zgodnie z dynamiką procesu biologicznego, zobrazowaną i/lub dostosowaną zgodnie z właściwościami wrażliwości na fototoksyczność populacji komórek będących przedmiotem zainteresowania.
6. Pobierz obrazy (przycisk "XYLZt") i zapisz.
7. Aby skonstruować "filmy", obszary zainteresowania będą musiały być zdefiniowane i wyrównane w wymiarach x, y i z. Cały proces wykracza poza zakres tego przeglądu protokołu, ale dostępnych jest kilka programów, które również ułatwiają funkcje powiększania, obracania i panoramowania podczas montażu obrazu 4D (Volocity, Amira itp.).

6. Przetwarzanie obrazów z separacją spektralną za pomocą darmowego oprogramowania Imagej

1. Optymalnie, podczas wykonywania eksperymentu z obrazowaniem wieloreporterowym, najlepiej jest użyć fluorforów, które są dobrze oddzielone spektralnie. Nie zawsze jest to jednak praktyczne i/lub możliwe. W tym miejscu przedstawiamy uproszczoną metodę separacji fluorforów, które mają nakładające się profile wzbudzenia i emisji, w tym przypadku GFP i YFP. W podanym przykładzie użyliśmy opisanych powyżej technik obrazowania poklatkowego w celu śledzenia zachowania "komórek macierzystych" siatkówki znakowanych GFP, gleju Müllera, podczas celowanej ablacji i regeneracji dwubiegunowych komórek siatkówki znakowanych YFP i NTR-mCherry (ryc. 2).
2. Zbieraj obrazy przy użyciu trybów obrazowania sekwencyjnego i filtrów o zmiennej barierze, które umożliwiają niezależne pozyskiwanie nakładających się fluoroforów i częściową separację (patrz powyżej przykład ustawień GFP/YFP). Aby usunąć przesłuchy, używamy prostej strategii odejmowania obrazu, która usuwa sygnał z jednego kanału z drugiego.
3. Proces odejmowania obrazu: Zainstaluj najnowszą wersję ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij/notes.html), narzędzia Loci Bio-Formats (http://www.loci.wisc.edu/bio-formats/imagej) i wtyczki align stacks (http://www.med.harvard.edu/JPNM/ij/plugins/Align3TP.html).
4. Użyj wtyczki Loci Bio-Formats Import, aby otworzyć pliki obrazów; po prostu przeciągnięcie interesującego pliku do okna ImageJ uruchomi narzędzie do importowania. Podziel kanały na indywidualne stosy za pomocą pola wyboru "Podziel kanały" w oknie importu lub zakładki "Podziel kanały" w sekcji "Narzędzia kanałów" (shift + ctrl + z) po załadowaniu.
5. Uruchom wtyczkę Align 3 TP (wtyczki>Align stacks> Align 3 TP). Stosy muszą być wyrównane, aby zapewnić prawidłowe odejmowanie. Wybierz stos odwołań w pierwszym polu listy rozwijanej i nieprawidłowo wyrównany stos w drugim. Zaznacz pola "użyj względnego początku xy" i "użyj względnego początku z" i kliknij "OK".
6. Aby rozpocząć proces wyrównywania, kliknij przycisk "Rejestracja woluminu". Pojawi się nowe okno zawierające parametry wyrównania. Ta sekcja została zoptymalizowana przez dystrybutora wtyczki, nie są konieczne żadne modyfikacje, wystarczy kliknąć "OK".
7. Po zakończeniu pojawi się okno "Wyrównane stosy". Wybierz "Wyjście" w oknie Wyrównaj, a powinno pojawić się okno Wyjście. To okno jest również zoptymalizowane i nie wymaga modyfikacji. Kliknij "OK". W przestrzeni roboczej powinien pojawić się nowy stos z napisem "Wyrównany" dołączonym na końcu tytułu pliku.
8. Przesłuch zostanie usunięty za pomocą "Kalkulatora obrazu" (Kalkulator Procesu>obrazu). Wybierz stos do odjęcia w polu rozwijanym Obraz1 i stos używany w odejmowaniu w polu rozwijanym Obraz2. Wybierz "Odejmij" w polu rozwijanym Operacja i kliknij "OK". ImageJ poprosi o przetworzenie stosu, wybierz "Tak". Powinien pojawić się nowy stos, który usunął przesłuchy między nakładającymi się kanałami.
9. Aby odtworzyć tę samą strukturę obrazu przed wyrównaniem i odejmowaniem, stosy muszą zostać scalone. Wybierz "Scal kanały" w oknie Narzędzia kanałów. Narzędzie pozwoli Ci scalić do czterech stosów w hyperstack.
   Uwaga: Aby scalić więcej niż 4 stosy, połącz stosy w żądanej kolejności za pomocą narzędzia Konkatenuj (obrazy>stosy>narzędzia>Konkatenuj). Przekonwertuj połączony stos na hyperstack (images>hyperstack>stack na hyperstack). Konkatenacja stosów zmienia głębokość, czas, kolejność kanałów (zct), należy to zresetować w wyświetlonym polu rozwijanym; Ustaw "Porządek" na XYZTC, ustaw "Kanały", "Wycinki" i "Ramki" zgodnie odpowiednio z liczbą stosów, głębokością stosu i liczbą punktów czasowych.
10. Na koniec wszystkie kanały muszą zostać pokolorowane, dostosowane do jasności i kontrastu oraz zapisane jako pliki TIFF. Od tego momentu konwersja do RGB, montażu, projekcji z lub szeregów czasowych jest tym samym procesem, co w przypadku oryginalnych plików.

7. Reprezentatywne wyniki

Rysunek 1. Seria poklatkowych obrazów konfokalnych demonstrujących ukierunkowaną utratę i regenerację dwubiegunowych komórek siatkówki z ekspresją NTR-mCherry (krwinek czerwonych). A & A') Przed leczeniem występuje mozaikowa ekspresja znakowanego błoną reportera YFP w "kontrolnych" komórkach dwubiegunowych, pokazana na żółto, oraz białko fuzyjne nitroreduktazy i wiśni w "celowanych" dwubiegunowych pokazane na czerwono. B & B') Po leczeniu metronidazolem, czerwone komórki dwubiegunowe wykazujące ekspresję nitroreduktazy są tracone, podczas gdy żółte "kontrolne" komórki dwubiegunowe są oszczędzane. Świadczy to o bardzo specyficznym charakterze tej metodologii ablacji. C & C') Po usunięciu metronidazolu powracają krwinki wykazujące ekspresję NTR (czerwone).

Rysunek 2. Podaje przykład procesu odejmowania obrazu, który umożliwia czyste oddzielenie GFP i YFP po akwizycji. A & A') Przed odejmowaniem obrazy GFP (zielony) i YFP (pseudokolorowy fioletowy) są wyrównywane. Proces odejmowania pozwala na usunięcie komórek dwubiegunowych znakowanych YFP z obrazu GFP, co pozwala na łatwiejsze wykrycie gleju Müllera znakowanego GFP. C & C') Jednoczesna ekspresja GFP (zielony) i mCherry (czerwony) jest widoczna w komórce wskazanej przez strzałkę. Ponieważ koekspresja markera komórek glejowych Müllera i markera komórek dwubiegunowych sugeruje, że ablacja komórek dwubiegunowych wyzwala glej Müllera w celu zastąpienia utraconych komórek. Interpretacja ta jest zgodna z ostatnimi badaniami nad regeneracją siatkówki, które sugerują, że komórki glejowe Müllera są "komórkami macierzystymi" wywołanymi urazami zarówno u ssaków, jak i ryb.

Discussion

W tym filmie przedstawiono przegląd technik stosowanych przez nas do wielokolorowego konfokalnego obrazowania poklatkowego i celowanej ablacji komórek. Wykorzystujemy obrazowanie poklatkowe do monitorowania zachowania wielu typów komórek będących przedmiotem zainteresowania in vivo, podczas gdy celowana ablacja komórek jest wykorzystywana do badania funkcji obwodów nerwowych i paradygmatów regeneracji neuronów specyficznych dla komórki. Przedstawione przykłady podkreślają kilka korzyści, jakie można uzyskać dzięki tym podejściom. Być może najważniejsze jest to, że obrazowanie poklatkowe zapewnia wewnętrznie kontrolowany paradygmat; Wszystkie zaobserwowane zjawiska można odnieść wstecz do poprzednich stanów. Pozwala to na dokonywanie bezpośrednich, a nie wywnioskowanych porównań między eksperymentalnymi punktami czasowymi, co ułatwia ilościowe określenie względnych zmian i redukuje eksperymentalny "szum" związany z różnicami w obrębie populacji. Zaletą obrazowania wielokolorowego jest możliwość wizualizacji zmian w oddziałujących i/lub sąsiadujących typach komórek. Na przykład, korzystając z linii transgenicznej, która oznacza glej Müllera, charakteryzujemy teraz reakcję tych potencjalnych komórek macierzystych wywołanych urazem na utratę dyskretnych subpopulacji komórek siatkówki. Wykorzystaliśmy również to podejście do zdefiniowania nowych mechanizmów powstawania obwodów nerwowych ². Wreszcie, oprócz badań nad regeneracją komórkową, niedawno zaczęliśmy używać systemu ablacji opartego na NTR do badania funkcjonalnej roli podtypów neuronów, a tym samym dyskretnych obwodów neuronalnych przy użyciu różnych paradygmatów behawioralnych i testów elektrofizjologicznych. Unikalną zaletą wykorzystania danio pręgowanego do takich badań jest to, że ze względu na ich zdolności regeneracyjne, indukowane deficyty są tymczasowe. W ten sposób, korelując z testami obrazowania poklatkowego, możemy scharakteryzować mechanizmy reinerwacji, które prowadzą, a także zakres reinerwacji wymagany do odzyskania funkcji.

Podane metody można dostosować do wielu różnych pytań. Na przykład, podobne analizy ablacji i regeneracji można zastosować do dowolnego transgenicznie definiowalnego podtypu komórkowego. Reasumując, takie badania mają potencjał, aby poszerzyć naszą wiedzę na temat regeneracji na poziomie poszczególnych typów komórek oraz w obrębie dyskretnych nisz komórek macierzystych.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1. Odczynniki:
Roztwór Danieau:
chlorek sodu (Fisher, S271 1) chlorek potasu (Fisher, P217 500) HEPES (Fisher, BP310500) siarczan magnezu (Fisher, M65 500) azotan wapnia (Fisher, C109500) Penicylina-Streptomycyna (Fisher, ICN1670049)
Inne odczynniki:
Niskotopliwa agaroza (Fisher, BP165-25) Tricane methanesulfonate (Fisher, NC9435281) N-fenylotiomocznik (Fisher, NC9968868) Metronidazol (Fisher, AC21034-1000)
2. Materiały:
Deep petri-dish (Fisher Scientific/Corning, 08-772-32) Dumont #5 cienkie kleszcze (Fisher, NC9404145)
3. Wyposażenie:
Zoom Stereoskop (Olympus, SZ51) Stereoskop fluorescencyjny z zoomem (Olympus, SZX16) Mikroskop konfokalny (Olympus FV1000) Cyfrowy grzejnik blokowy - Isotemp (Fisher, 11-715-125DQ) Barnstead/Termolyne Inkubator stołowy (Fisher, 11-702-4).