Wielokolorowe obrazowanie poklatkowe transgenicznych rybek zebrafish: wizualizacja komórek macierzystych siatkówki aktywowanych przez ukierunkowaną ablację komórek neuronalnych

Podsumowanie

W tym filmie przedstawiono techniki wielokolorowego konfokalnego obrazowania time-lapse oraz celowanej ablacji komórek. Obrazowanie time-lapse jest wykorzystywane do monitorowania zachowania wielu wybranych typów komórek in vivo. Celowana ablacja komórek ułatwia badanie funkcji obwodów neuronalnych oraz paradygmatów regeneracji neuronów specyficznych dla danej grupy komórek.

Streszczenie

Obrazowanie poklatkowe o wysokiej rozdzielczości żywych larw zebrafish może być wykorzystywane do wizualizacji przebiegu procesów biologicznych (w ramach przeglądu patrz ¹). Złożone ryby transgeniczne, które wykazują ekspresję różnych reporterów fluorescencyjnych w sąsiadujących typach komórek, umożliwiają śledzenie interakcji komórkowych ² i/lub reakcji na poziomie tkankowym na manipulacje eksperymentalne w czasie. W niniejszym filmie prezentujemy metody, które mogą być stosowane do seryjnego obrazowania wielu transgenicznie znakowanych typów komórek u poszczególnych osobników w przebiegach czasowych trwających od kilku minut do wielu dni. Opisane techniki mają zastosowanie w każdym badaniu mającym na celu powiązanie „zachowania” sąsiadujących typów komórek w czasie, w tym: 1) seryjnych metod „wychwytywania i uwalniania” (catch and release) do obrazowania dużej liczby ryb w kolejnych dniach, 2) uproszczonych podejść do rozdzielania fluoroforów o nakładających się profilach wzbudzenia/emisji (np. GFP i YFP), 3) wykorzystania linii mutantów hipopigmentowanych w celu wydłużenia okna czasowego dostępnego dla obrazowania o wysokiej rozdzielczości w późnych stadiach rozwoju larwalnego, 4) zastosowania fluorescencyjnych reporterów celowanych w błonę w celu ujawnienia szczegółów morfologicznych pojedynczych komórek, jak i szczegółów komórkowych w większych populacjach komórek oraz 5) wcześniej opisaną metodę chemicznie indukowanej ablacji transgenicznie celowanych typów komórek; tj. konwersji substratów proleków, takich jak metronidazol (MTZ), do pochodnych cytotoksycznych za pośrednictwem nitroreduktazy (NTR) ^3,5.

Jako przykład tych podejść, zwizualizujemy ablację i regenerację podtypu neuronów bipolarnych siatkówki u poszczególnych ryb w ciągu kilku dni. Jednocześnie będziemy monitorować kilka innych typów komórek siatkówki, w tym sąsiednie, niedocelowe komórki bipolarne oraz potencjalne komórki macierzyste siatkówki stymulowane degeneracją (tj. glej Mϋllera). Strategia ta jest stosowana w naszym laboratorium w celu charakterystyki odpowiedzi na poziomie komórkowym i tkankowym (np. nisza komórek macierzystych) w reakcji na selektywną utratę i regenerację docelowych typów komórek neuronalnych.

Protokół

1. Linie transgeniczne i mutanty

1. Utworzyć lub pozyskać transgeniczne linie rybek danio (zebrafish), w których interesujące typy komórek są różnicowo znakowane wariantami reporterów fluorescencyjnych. Optymalnie profil wzbudzenia/emisji wybranych reporterów powinien wykazywać minimalną overlap (np. ECFP i EYFP), jednak nie jest to absolutnie wymagane. W naszych zastosowaniach użycie fluorescencyjnych reporterów związanych z błoną znacznie ułatwia obrazowanie drobnych szczegółów komórkowych, takich jak wypustki neurytów, co pozwala na rozdzielenie liczby i/lub morfologii poszczególnych komórek w dużych, zmieszanych grupach oraz na „wyróżnienie” obszarów o wysokiej zawartości błon, takich jak neuropile synaptyczne.
2. W przypadku obrazowania w późnych stadiach larwalnych pomocne jest wprowadzenie lub skrzyżowanie linii transgenicznych z tłem mutacyjnym redukującym pigmentację [np. roy orbison (roy) lub roy orbison; albino (roy;alb); ⁴]. Według naszego doświadczenia redukcja irydoforów (np. roy) jest kwestią kluczową; melanogeneza może być ograniczana chemicznie za pomocą 1-fenylo-2-tiomocznika (PTU) lub poprzez wykorzystanie mutantów „albino”, które nie posiadają melanoforów. Należy jednak zauważyć, że Ren et al.⁴ wykazali deficyty wzrokowe i niewielkie zmiany morfologiczne w siatkówkach ryb pozbawionych melanoforów oraz że intensywne światło może indukować śmierć fotoreceptorów u mutantów „albino”. Zatem kwestie te muszą być brane pod uwagę podczas projektowania eksperymentów obrazowania i/lub interpretacji danych.
3. W niniejszej prezentacji wykorzystano następujące transgeniczne i mutantowe linie ryb:
   1. Tg(nyx:Gal4-VP16)^q16a/+;Tg(UAS:gap43-YFP)^q16b/+;Tg(UAS-E1b:NfsB-mCherry)^c264/+; Tg(pax6-DF4:gap43-CFP)^q01/+; roy^a9/a9
   2. Tg(nyx:Gal4-VP16)^q16a/+;Tg(UAS:gap43-YFP)^q16b/+;Tg(UAS-E1b:NfsB-mCherry)^c264/+;Tg(gfap:GFP)^mi201/+;roy^a9/+
   3. Uwaga: W rybach „1” subpopulacja komórek bipolarnych siatkówki definiowanych przez promotor nyx wykazuje ekspresję YFP związanego z błoną i/lub reportera fuzyjnego NTR-mCherry (większość wykazuje oba), a niemal wszystkie komórki siatkówki wykazują ekspresję CFP związanego z błoną. Ryby „2” są takie same jak powyżej, z wyjątkiem tego, że komórki glei Müllera wykazują ekspresję cytozolowego GFP, a globalna ekspresja CFP w siatkówce została wyeliminowana. Ekspresja fuzji NTR-mCherry sprawia, że zdefiniowane przez nyx komórki bipolarne są podatne na ablację indukowaną prolekiem ^3,5.

2. Wybór i przygotowanie zarodków/larw do obrazowania na żywo

1. Krzyżuj interesujące linie transgeniczne/mutanty, zbierz jaja i inkubuj/utrzymuj w temperaturze 28.5°C w 0,3X roztworze Danieau (lub wybranej „pożywce dla embrionów”).
2. W przypadku braku tła „albino”, należy dodać PTU w celu zahamowania aktywności tyrozynazy przed pojawieniem się jakichkolwiek oznak pigmentacji w badanej tkance (np. ok. 16 hpf dla oka, 200 μM końcowy). Należy pamiętać, że traktowanie PTU w stężeniach przekraczających 75 μM może powodować toksyczność i/lub efekty teratogenne. Jednakże, ze względu na wysoką pigmentację oka, zabiegi poniżej 200 μM nie nadają się do obrazowania konfokalnego o wysokiej rozdzielczości; w tych warunkach istotny jest wybór zdrowo wyglądających ryb do obrazowania. W przypadku obrazowania innych tkanek, 75 μM Zastosowanie PTU może być korzystniejsze. Ponadto, jak wspomniano powyżej, wykorzystanie linii mutantów „albino” eliminuje konieczność traktowania embrionów PTU i jest preferowaną strategią obrazowania w późniejszych stadiach larwalnych.
3. Po pojawieniu się reporterów fluorescencyjnych należy posegregować ryby pod kątem ekspresji transgenu oraz ogólnego stanu zdrowia, używając stereomikroskopu fluorescencyjnego z zoomem lub urządzenia o podobnym działaniu.
4. Przed pierwszym dniem obrazowania rozpuścić agarozę niskotopliwą (LMA) w medium dla embrionów do końcowego stężenia 0,5%, podgrzać i wymieszać do uzyskania roztworu, a następnie przechowywać w 40°C.
5. W pierwszym dniu obrazowania należy przygotować roztwór montażowy: dodać tricainę (środek znieczulający, 756 μM końcowy) oraz PTU (jeśli jest konieczne) do 0,5% LMA w podłożu dla embrionów, delikatnie wymieszać i przenieść z powrotem do 40°C.
6. Zanurzyć ryby w medium do embrionów zawierającym PTU i/lub trikainę w celu ich znieczulenia; odczekać do momentu, aż ryby przestaną reagować na dotyk (~3 min).
7. Przenieś poszczególne ryby do roztworu montującego, dbając o to, aby nie rozcieńczyć agarozy, tak aby można było jej użyć ponownie. Do przenoszenia używamy mikropipety z przyciętą końcówką; pomaga to również zachować kontrolowaną objętość (~30 μL). Po pobraniu należy odwrócić pipetę i pozwolić rybie opaść na dno, aby dotknięcie końcówki roztworu montującego umożliwiło transfer grawitacyjny bez konieczności wydmuchiwania cieczy.
8. Po przeniesieniu usunąć roztwór anestetyka z mikropipety i za pomocą niej przenieść rybę do ~30 μL kroplę medium montażowego do szalki Petriego.
   Uwaga: Ta metoda montażu dotyczy wyłącznie mikroskopii prostej, w której stosowane są obiektywy imersyjne wodne o dużej odległości roboczej. W przypadku metod dotyczących mikroskopów odwróconych, w których wymagane są szkiełka nakrywki, należy zapoznać się z publikacją Andersen i wsp.., 2010; O'Brien it al.., 2009; Graeden i Sive, 209.
9. przywrócić medium montażowe do 40°C blok grzewczy
10. Za pomocą szczoteczki do rzęs lub podobnego narzędzia delikatnie obróć rybę do pożądanej orientacji i ustaw obszar zainteresowania w centrum kropli agarozy.
11. Powtórz kroki od 6 do 10, aby zamontować pożądaną liczbę embrionów w jednej płytce. W przypadku seryjnych eksperymentów time-lapse (patrz poniżej) zazwyczaj montujemy sześć ryb jednocześnie i staramy się ograniczyć sesje obrazowania do 1 godziny na grupę.
12. Podczas montowania kolejnych ryb należy upewnić się, że poprzednie osobniki zachowują pożądaną orientację aż do momentu stężenia agarozy (~3 min).
13. Po zestaleniu się agarozy przenieś ryby na stolik mikroskopu konfokalnego i delikatnie dolej do naczynia medium do embrionów zawierające PTU i/lub trikainę, aż wszystkie ryby zostaną całkowicie zanurzone.

3. Wielokolorowe obrazowanie konfokalne in vivo

Uwaga: Staraliśmy się uogólnić poniższy protokół w taki sposób, aby dostarczył istotnych informacji dla innych konfiguracji mikroskopów. Konkretne odniesienia do aplikacji oprogramowania „Olympus” i „ImageJ” zostały ujęte w cudzysłowie. Nasz system obrazowania to pionowy mikroskop konfokalny Olympus FV100 wyposażony w lasery 405, 40, 48, 515, 59 i 635 nm, dwa kanały detekcji z regulowanymi filtrami barierowymi (umożliwiającymi regulację długości fali emisji w interwałach 1 nm), jeden standardowy kanał z filtrem barierowym (do obrazowania w zakresie czerwieni i dalekiej czerwieni) oraz jeden kanał światła przechodzącego.

1. Otwórz oprogramowanie do obrazowania („FV10-ASW”) i użyj źródła światła prześwieconego lub fluorescencyjnego, aby zlokalizować obszar zainteresowania. W celu uzyskania optymalnych obrazów detali komórkowych i/lub molekularnych należy zastosować obiektywy o dużej odległości roboczej i wysokiej aperturze numeryczną (np. 60X, 1,2NA).
2. W przypadku pozyskiwania obrazów w świetle przechodzącym, należy ustawić przysłonę polową dla oświetlenia Köhlera.
3. Wybierz odpowiednie fluorofory z „Listy barwników” (Dye List) lub załaduj parametry akwizycji z wcześniej zapisanego pliku obrazu. Wprowadź korekty zakresów emisji („Ustawienia spektralne” / Spectral Setting) niezbędne do uzyskania czystej separacji sygnałów reporterów i/lub maksymalnego stosunku sygnału do szumu. Ustawienia te będą wymagały empirycznego zdefiniowania dla każdego eksperymentu w celu zminimalizowania przesłuchów (crosstalk) przy jednoczesnym zmaksymalizowaniu sygnału; ustawienia dla przedstawionych tutaj przykładów podano poniżej:

   Fluorofory	Lasery (nm)	Ustawienia bariery / Filtr emisyjny (nm)
   1) ECFP, EYFP, mCherry*	440, 515, 559*	460-500, 530-545, 575-675
   2) EGFP**, EYFP**, mCherry	488, 515, 559	500-515, 530-545, 575-675

   
   *Obrazowanie białka mCherry można usprawnić, stosując laser o większej długości fali (np. 568 lub 594 nm)
   Wymagany jest sekwencyjny tryb obrazowania umożliwiający zmianę luster dichroicznych i filtrów barierowych („Wirtualne Kanały”) ze względu na nakładanie się widm emisji i wzbudzenia GFP oraz YFP. GFP i mCherry można przypisać do jednego kanału, natomiast YFP do oddzielnego kanału. Uwaga: przed wykonaniem odjęcia obrazu (część 6) widoczny będzie przesłuch (crosstalk) między obrazami GFP i YFP.
4. Upewnij się, że w menu rozwijanym wybrano używany obiektyw, aby zagwarantować prawidłowe dostosowanie wszelkich zdefiniowanych programowo ustawień wstępnych.
5. Aby przeprowadzić ogniskowanie laserów i ustawić poziomy mocy, należy wybrać tabelę wyszukiwania (LUT) ukazującą nasycenie pikseli („Hi-lo”) dla każdego kanału. Ustaw czułość detektora („HV”, napięcie PMT) na wartość zgodną z pożądaną jakością obrazu (zdefiniowaną empirycznie) i stopniowo zwiększaj moc lasera, aż intensywność obrazu będzie odpowiednia, unikając nasycenia pikseli.
6. Należy sprawdzić występowanie przesłuchów (crosstalk) między kanałami; upewnić się, że każda linia laserowa generuje wykrywalny sygnał wyłącznie w odpowiednim kanale, ręcznie włączając i wyłączając lasery podczas monitorowania wszystkich kanałów obrazowania. Aby wyeliminować przesłuchy, należy zmniejszyć moc lasera. Jeśli nie stwierdzono przesłuchów, wszystkie kanały mogą być rejestrowane jednocześnie, co zapewnia znaczną oszczędność czasu.
7. W przypadku nieuniknionego przenikania sygnałów (crosstalk) należy zastosować tryb obrazowania sekwencyjnego („Sequential”), który przełącza poszczególne lasery/kanały. W skrajnych przypadkach (np. obrazowania GFP i YFP) wymagane jest użycie trybów sekwencyjnych, które dodatkowo przełączają lustra dichroiczne i/lub filtry barierowe („Virtual Channels”). Uwaga: opcja ta wprowadza znaczne opóźnienia czasowe w procesie akwizycji obrazów i może nie być odpowiednia do rejestracji procesów o wysokiej dynamice.
8. Funkcje „Zoom” (powiększenie) i „Rotation” (obrót) mogą być wykorzystane do dalszego kadrowania obszaru zainteresowania. Funkcja Zoom może służyć również do poprawy rozdzielczości obrazu, w granicach limitów zastosowanego obiektywu i formatu skanowania (np. 512 x 512; informacje na ten temat znajdują się pod adresem http://corefacilities.systemsbiology.net/imaging/documents/app_note_image_res.pdf).
9. Dla in vivo obrazowania w ogóle, a szczególnie istotne w przypadku obrazowania poklatkowego, należy położyć nacisk na techniki minimalizujące problem fototoksyczności (tj. akumulację wolnych rodników); szybkie prędkości skanowania (np. 2 μs/pixel) i niskie poziomy mocy wyjściowej lasera (np. 1%) powinny być stosowane wszędzie tam, gdzie to możliwe, wraz z najniższym formatem skanowania o rozdzielczości wystarczającej do uchwycenia istotnych informacji.
10. Aby poprawić rozdzielczość obrazu, podczas akwizycji można zastosować uśrednianie skanowania („Kalman”). Wolniejsze prędkości skanowania również poprawiają rozdzielczość, lecz zwiększają czas przebywania wiązki lasera (laser dwell time), co nasila problemy z fototoksycznością i wybielaniem. Należy pamiętać, że oba te podejścia nie są idealne dla obrazowania poklatkowego (time-lapse) ze względu na możliwość braku możliwości uchwycenia szybkich zmian w obrębie serii z, zjawisko to nazywamy „rozmyciem czasowym” (time blur). Należy zauważyć, że uśrednianie linia po linii w przeciwieństwie do uśredniania klatek może pomóc wyeliminować problemy z „rozmyciem czasowym” w obrębie jednej płaszczyzny, ale nie w obrębie głębokości z.
11. Jeśli intensywność sygnału jest niska i nie jest wymagana maksymalna rozdzielczość obrazu (np. w przypadku zwykłego zliczania komórek), można zwiększyć aperturę konfokalną (średnicę otworu pinhole), aby wzmocnić sygnał. Pozwala to na utrzymanie niskiej intensywności lasera, co ogranicza fototoksyczność i fotobleaching, jednak ustawienie apertury na wartość większą niż 1 jednostka Airy prowadzi do gwałtownego spadku jakości obrazu.
12. Zdefiniuj wymiary głębokości z, korzystając z trybu szybkiego skanowania („Focus x4”). Ponieważ intensywność sygnału zazwyczaj maleje wraz z głębokością z, najlepiej rozpocząć akwizycję stosu z (z-stack) od najniższej głębokości i zakończyć na najbardziej powierzchownej; pozwala to na zarejestrowanie słabszych sygnałów przed wystąpieniem znaczącego blaknięcia.
13. Należy sprawdzić, czy detekcja sygnału jest odpowiednia w całej głębokości obrazu. W razie potrzeby można zastosować funkcję korekcji jasności w wymiarze z („Bright Z”), aby dostosować parametry akwizycji obrazu na określonych głębokościach.
14. Ustaw wielkość kroku w wymiarze z zgodnie z potrzebami eksperymentalnymi. Na przykład w naszym pierwszym przykładzie (rycina 1) przeprowadzaliśmy jedynie „spis komórek” w poszczególnych siatkówkach w kolejnych dniach, dlatego ustawiliśmy głębokość z na 15 mikronów i wykonaliśmy od pięciu do siedmiu obrazów na siatkówkę. Strategia ta pozwoliła nam na próbkowanie każdej siatkówki bez nakładania się komórek między obrazami. W naszym drugim przykładzie (rycina 2) wykonaliśmy szybkie filmy time-lapse 4D, w których sygnały GFP i mCherry musiały być skorelowane przestrzennie, dlatego ustawiliśmy wielkość kroku na trzykrotność teoretycznej rozdzielczości bocznej – był to kompromis, który pozwolił na wykonywanie obrazów stosu z co 5–10 minut, a jednocześnie umożliwił rozdzielenie poszczególnych szczegółów komórkowych.
15. Należy pozyskać obrazy („XYLZt”) i zapisać je. W przypadku przeprowadzania seryjnego eksperymentu time-lapse należy przejść do kolejnej ryby (patrz pkt 4 poniżej). W celu wykonania szybkiego obrazowania time-lapse należy przejść do pkt 5 poniżej.

4. Seryjne obrazowanie w schemacie „wychwyć i wypuść” (Catch and Release): metoda śledzenia zmian komórkowych u poszczególnych ryb w kolejnych dniach

1. W celu zminimalizowania czasu unieruchomienia ryb i zwiększenia liczby osobników obrazowanych w jednym eksperymencie stosuje się protokół „złap i wypuść” (catch and release). Przydatność tej techniki ogranicza się do procesów biologicznych przebiegających w ciągu wielu dni (np. Mumm et al. 206²). Jedną z zalet tego podejścia jest to, że pozwala ono na wewnętrzną kontrolę obserwowanych zmian; tzn. porównania między różnymi stanami tych samych osobników, a nie między populacjami. Przykładowo, śledzenie zmian w liczbie znakowanych komórek w danej tkance może być przeprowadzone precyzyjnie, nawet jeśli liczba komórek znakowanych początkowo znacznie różni się między poszczególnymi rybami. Poniżej przedstawiono metody stosowania tego protokołu w kontekście testu ablacji komórek indukowanej prolekiem ^3,5.
2. Aby zwizualizować ablację i regenerację docelowych typów komórek u poszczególnych ryb w czasie, wykonuje się obrazy konfokalne przed podaniem proleku (Przed traktowaniem), bezpośrednio po usunięciu proleku (Po traktowaniu) oraz w okresie rekonwalescencji (Obrazy regeneracji).
3. Obrazowanie przed traktowaniem: Ryby są montowane i obrazowane w opisany wyżej sposób. Po obrazowaniu ryby są uwalniane do medium dla embrionów (+ prolek) i inkubowane w temperaturze 28.5°C aż do sesji obrazowania po traktowaniu. Praca w zespołach dwuosobowych, gdzie jedna osoba montuje i uwalnia ryby, a druga wykonuje obrazowanie, jest dobrym sposobem na zmaksymalizowanie liczby ryb, które można obrazować w ciągu jednego dnia.
4. Po obrazowaniu wszystkich ryb w jednej szalce należy zastąpić medium dla embrionów zawierające tricain samym medium dla embrionów (+/- PTU).
5. Aby uwolnić ryby, należy użyć pęsety jubilerskiej do przecięcia agarozy po obu stronach larwy, a następnie delikatnie oddzielić agarozę, aż ryba będzie swobodnie pływać w medium dla embrionów.
6. Ablacja indukowana prolekiem: Przenieś larwy do oddzielnych studzienek płytki wielodołkowej zawierającej medium dla embrionów (+/- PTU) + prolek (np. 10mM metronidazolu, MTZ). Aby zapewnić dokładne końcowe stężenia proleku, zazwyczaj odmierzamy określoną objętość medium dla embrionów (+/- PTU) zawierającego dwukrotne stężenie proleku (np. 20 mM) do każdej studzienki. Następnie dodaje się ryby do studzienek w równym samym wolumenie medium dla embrionów (+/- PTU), aby uzyskać końcowe stężenie proleku 1X.
7. Inkubuj w temperaturze 28.5°C, aż do momentu, gdy będzie można zweryfikować ablację docelowych komórek.
   Uwaga: Schematy traktowania prolekiem wymagane do osiągnięcia skutecznej ablacji różnią się w zależności od docelowego typu komórek; stężenie proleku i czas traktowania muszą zostać określone empirycznie. Należy pamiętać, że wysokie stężenia wywołują ogólną toksyczność, np. >10 mM MTZ. Ponadto utrzymywanie się pofragmentowanych sygnałów reporterowych może utrudniać ocenę skuteczności ablacji; w niektórych przypadkach wymagana jest mikroskopia konfokalna, aby odpowiednio zwizualizować utratę komórek.
8. Obrazowanie po traktowaniu: Ryby są montowane w taki sposób, aby ta sama tkanka była optymalnie zorientowana, a następnie obrazowane jak opisano wyżej. Po obrazowaniu wszystkich ryb na danej płytce są one uwalniane do medium dla embrionów (+/- PTU) do oddzielnych studzienek (jak wyżej) i inkubowane w temperaturze 28.5°C, aby umożliwić regenerację ablacyjnego typu komórek.
9. W zależności od wieku ryb i czasu wymaganego do rekonwalescencji, na tym etapie testu może być konieczne karmienie ryb. Stosujemy żywy pokarm, taki jak paramecje lub rotifery, aby zapewnić optymalne przeżycie. Zaleca się również codzienną wymianę medium, szczególnie jeśli ryby są utrzymywane w małych objętościach (np. płytki 96-dołkowe).
10. Obrazowanie regeneracji: Aby udokumentować kinetykę zastępowania komórek, ryby mogą być obrazowane codziennie w okresie rekonwalescencji. Po ustaleniu kinetyki test można uprościć, wykonując obrazy regeneracji tylko w interesujących punktach czasowych (np. po pełnej regeneracji). Rysunek 1 przedstawia przykład tego podejścia z naszych badań nad regeneracją komórek siatkówki.
11. Po zakończeniu eksperymentu ryby należy uśpić poprzez zanurzenie w 20X roztworze tricaine (15.3 μM) na lodzie.

5. Szybkie obrazowanie poklatkowe.

1. W przypadku szybkiego obrazowania poklatkowego (tzn. „filmów”) wielu fluoroforów, krytyczne jest zastosowanie technik minimalizujących problemy z fototoksycznością (patrz wyżej). Jak wspomniano powyżej, technika ta najlepiej nadaje się do fluoroforów umożliwiających obrazowanie symultaniczne, a nie sekwencyjne.
2. Utrzymuj ryby w temperaturze 28.5°C, używając podgrzewanego stolika, elementu grzejnego z szyby ITO lub podobnego urządzenia.
3. Stosuj metody ograniczające parowanie, aby pomóc w stabilizacji temperatury i osmolalności (np. uszczelniające pierścienie O do szkiełek nakrywkowych w mikroskopach odwróconych).
4. W przypadku korzystania z automatycznej akwizycji przez dłuższy czas, należy upewnić się, że rozmiar stosu (stack) jest ustawiony tak, aby uwzględnić wzrost i/lub dryf w wymiarze z.
5. Ustaw odstępy czasowe oraz liczbę skanowań („TimeScan” lub „TimeController”). Szybkość akwizycji musi zostać ustalona empirycznie, zgodnie z dynamiką obrazowanego procesu biologicznego i/lub dostosowana do właściwości wrażliwości na fototoksyczność badanej populacji komórek.
6. Wykonaj akwizycję obrazów (przycisk „XYLZt”) i zapisz dane.
7. Aby stworzyć „filmy”, należy zdefiniować obszary zainteresowania i wyrównać je w wymiarach x, y oraz z. Pełny proces wykracza poza zakres niniejszego przeglądu protokołu, jednak dostępnych jest kilka programów komputerowych, które ułatwiają również funkcje przybliżania, obracania i przesuwania podczas składania obrazów 4D (Volocity, Amira itp.).

6. Przetwarzanie obrazów z separacji spektralnej przy użyciu bezpłatnego oprogramowania ImageJ

1. Optymalnie, podczas przeprowadzania eksperymentu obrazowania z wieloma reporterami, najlepiej stosować fluorofory dobrze rozdzielone spektralnie. Nie zawsze jest to jednak praktyczne i/lub możliwe. Przedstawiamy tutaj uproszczoną metodę rozdzielania fluoroforów o nakładających się profilach wzbudzenia i emisji, w tym przypadku GFP i YFP. W podanym przykładzie wykorzystaliśmy opisane powyżej techniki obrazowania time-lapse do śledzenia zachowania oznakowanych GFP „komórek macierzystych” siatkówki, czyli glei Müllera, podczas celowej ablacji i regeneracji komórek bipolarnych siatkówki oznakowanych YFP i NTR-mCherry (Rysunek 2).
2. Należy zebrać obrazy, korzystając z sekwencyjnych trybów obrazowania i zmiennych filtrów barierowych, które pozwalają odpowiednio na niezależną akwizycję i częściowe rozdzielenie nakładających się fluoroforów (patrz powyżej przykład ustawień dla GFP/YFP). Aby usunąć przesłuchy (crosstalk), stosujemy prostą strategię odejmowania obrazów, która usuwa sygnał z jednego kanału z drugiego.
3. Proces odejmowania obrazów: Należy zainstalować najnowszą wersję programu ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij/notes.html), narzędzie Loci Bio-Formats (http://www.loci.wisc.edu/bio-formats/imagej) oraz wtyczkę align stacks (http://www.med.harvard.edu/JPNM/ij/plugins/Align3TP.html).
4. Do otwarcia plików obrazów należy użyć wtyczki Loci Bio-Formats Import; przeciągnięcie interesującego pliku na okno ImageJ uruchomi narzędzie importu. Kanały należy rozdzielić na poszczególne stosy (stacks), korzystając z pola wyboru „Split Channels” w oknie importu lub karty „Split Channels” w sekcji „Channel Tools” (shift + ctrl + z) po załadowaniu plików.
5. Należy uruchomić wtyczkę Align 3 TP (plugins>Align stacks> Align 3 TP). Stosy muszą zostać wyrównane, aby zapewnić prawidłowe odejmowanie. W pierwszym polu rozwijanym należy wybrać stos referencyjny, a w drugim stos niewyrównany. Należy zaznaczyć pola „use xy relative origin” oraz „use z relative origin”, a następnie kliknąć „OK”.
6. Aby rozpocząć proces wyrównywania, należy kliknąć przycisk „Volume Registration”. Pojawi się nowe okno zawierające parametry wyrównywania. Ta sekcja została zoptymalizowana przez dystrybutora wtyczki, nie są wymagane żadne modyfikacje, należy po prostu kliknąć „OK”.
7. Po zakończeniu pojawi się okno „Aligned Stacks”. Należy wybrać „Output” w oknie Align, po czym powinno pojawić się okno Output. To okno jest również zoptymalizowane i nie wymaga modyfikacji. Kliknij „OK”. W obszarze roboczym powinien pojawić się nowy stos z dopiskiem „Aligned” na końcu nazwy pliku.
8. Przesłuchy zostaną usunięte za pomocą narzędzia „Image Calculator” (Process>image Calculator). W polu rozwijanym Image1 należy wybrać stos, który ma zostać odjęty, a w polu Image2 stos wykorzystywany do odejmowania. W polu Operation należy wybrać „Subtract” i kliknąć „OK”. Program ImageJ zapyta o przetworzenie stosu, należy wybrać „Yes”. Powinien pojawić się nowy stos, w którym usunięto przesłuchy między nakładającymi się kanałami.
9. Aby odtworzyć tę samą strukturę obrazu sprzed wyrównania i odejmowania, należy scalić stosy. W oknie Channel Tools należy wybrać „Merge Channels”. Narzędzie to pozwala scalić do czterech stosów w jeden hiperstos (hyperstack).
   Uwaga: Aby scalić więcej niż 4 stosy, należy połączyć stosy w żądanej kolejności za pomocą narzędzia concatenate (images>stacks>tools>concatenate). Następnie należy przekonwertować połączony stos na hiperstos (images>hyperstack>stack to hyperstack). Łączenie stosów zmienia kolejność głębokości, czasu i kanału (zct), co należy zresetować w pojawiającym się polu rozwijanym; ustawić „order” na xyztc, a wartości „channels”, „slices” i „frames” zgodnie z liczbą stosów, głębokością stosu i liczbą punktów czasowych.
10. Na koniec wszystkie kanały muszą zostać pokolorowane, skorygowane pod kątem jasności i kontrastu oraz zapisane jako pliki TIFF. Od tego momentu konwersja do RGB, tworzenie montażu, projekcja z lub seria czasowa odbywają się w ten sam sposób, co w przypadku oryginalnych plików.

7. Reprezentatywne wyniki

Rysunek 1. Seria obrazów konfokalnych wykonana w technice poklatkowej, demonstrująca celową utratę i regenerację komórek bipolarnych siatkówki (komórki czerwone) wykazujących ekspresję NTR-mCherry. A & A') Przed rozpoczęciem zabiegu obserwuje się mozaikową ekspresję reportera YFP związanego z błoną w „kontrolnych” komórkach bipolarnych, zaznaczonych na żółto, oraz białka fuzyjnego nitroreduktaza-Cherry w „celowanych” komórkach bipolarnych, zaznaczonych na czerwono. B & B') Po zastosowaniu metronidazolu czerwone komórki bipolarne wykazujące ekspresję nitroreduktazy ulegają zniszczeniu, natomiast żółte komórki bipolarne „kontrolne” zostają zachowane. Dowodzi to wysokiej specyficzności tej metody ablacji. C & C') Po usunięciu metronidazolu powracają komórki wykazujące ekspresję NTR (czerwone).

Rysunek 2. Przedstawiono przykład procesu odejmowania obrazów, który umożliwia dokładne rozdzielenie sygnałów GFP i YFP po akwizycji. A & A') Przed odjęciem obrazów, obrazy GFP (zielony) i YFP (pseudokolor fioletowy) zostają wyrównane. B & B') Proces odejmowania pozwala na usunięcie znakowanych YFP komórek bipolarnych z obrazu GFP, co umożliwia łatwiejsze wykrycie znakowanej GFP glei Müllera. C & C') Koekspresja GFP (zielony) i mCherry (czerwony) jest widoczna w komórce wskazanej strzałką. Koekspresja markera gleju Müllera oraz markera komórek bipolarnych sugeruje, że ablacja komórek bipolarnych pobudza glej Müllera do zastąpienia utraconych komórek. Interpretacja ta jest zgodna z niedawnymi badaniami nad regeneracją siatkówki, w których glej Müllera został wskazany jako indukowane urazem źródło „komórek macierzystych” zarówno u ssaków, jak i u ryb.

Dyskusja

W tym filmie przedstawiono przegląd technik stosowanych do wielokolorowego obrazowania konfokalnego w trybie time-lapse oraz celowanej ablacji komórek. Wykorzystujemy obrazowanie time-lapse do monitorowania zachowania wielu interesujących nas typów komórek in vivo, natomiast celowana ablacja komórek służy do badania funkcji obwodów neuronalnych oraz paradygmatów regeneracji neuronów specyficznych dla danych komórek. Przedstawione przykłady podkreślają szereg zalet wynikających z zastosowania tych podejść. Być może najważniejszym jest to, że obrazowanie time-lapse zapewnia paradygmat z kontrolą wewnętrzną; wszelkie zaobserwowane zjawiska mogą być odnoszone do stanów poprzednich. Pozwala to na dokonywanie bezpośrednich, a nie wnioskowanych porównań pomiędzy punktami czasowymi eksperymentu, co ułatwia kwantyfikację zmian względnych i redukuje „szum” eksperymentalny związany z wariancją w obrębie populacji. Zaletą obrazowania wielokolorowego jest możliwość wizualizacji zmian w oddziałujących i/lub sąsiadujących typach komórek. Na przykład, wykorzystując linię transgeniczną znakującą glej Müllera, charakteryzujemy obecnie odpowiedź tych potencjalnych, indukowanych urazem komórek macierzystych na utratę dyskretnych subpopulacji komórek siatkówki. Podejście to wykorzystaliśmy również do zdefiniowania nowych mechanizmów formowania obwodów neuronalnych ². Wreszcie, oprócz badań nad regeneracją komórkową, zaczęliśmy ostatnio stosować system ablacji oparty na NTR w celu zbadania funkcjonalnej roli podtypów neuronów – a zatem dyskretnych obwodów neuronalnych – przy użyciu różnych paradygmatów behawioralnych i testów elektrofizjologicznych. Wyjątkową zaletą wykorzystania rybek danio w takich badaniach jest fakt, że dzięki ich zdolnościom regeneracyjnym indukowane deficyty są przejściowe. Dzięki temu, korelując wyniki z testami obrazowania time-lapse, możemy typować mechanizmy reinnerwacji prowadzące do powrotu funkcji, a także określać zakres reinnerwacji niezbędny do pełnej regeneracji funkcjonalnej.

Przedstawione metody można dostosować do wielu różnych zagadnień badawczych. Na przykład podobne analizy ablacji i regeneracji można zastosować do dowolnego podtypu komórkowego, który można zdefiniować transgenicznie. Wspólnie badania te mają potencjał, aby poszerzyć naszą wiedzę na temat regeneracji na poziomie poszczególnych typów komórek oraz w obrębie odrębnych nisz komórek macierzystych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1. Odczynniki:
Roztwór Danieau:
chlorek sodu (Fisher, S271 1) chlorek potasu (Fisher, P217 500) HEPES (Fisher, BP310500) siarczan magnezu (Fisher, M65 500) azotan wapnia (Fisher, C109500) penicylina-streptomycyna (Fisher, ICN1670049)
Pozostałe odczynniki:
agaroza o niskiej temperaturze topnienia (Fisher, BP165-25) metanosulfonian trikanu (Fisher, NC9435281) N-fenylotiomocznik (Fisher, NC9968868) metronidazol (Fisher, AC21034-1000)
2. Materiały:
głębokie szalki Petriego (Fisher Scientific/Corning, 08-772-32) precyzyjne pęsety Dumont #5 (Fisher, NC9404145)
3. Sprzęt:
stereomikroskop z zoomem (Olympus, SZ51) fluorescencyjny stereomikroskop z zoomem (Olympus, SZX16) mikroskop konfokalny (Olympus FV1000) cyfrowy grzejnik blokowy Isotemp (Fisher, 11-715-125DQ) inkubator stołowy Barnstead/Thermolyne (Fisher, 11-702-4).