Analiza całego genomu przy użyciu ChIP w celu identyfikacji celów genów specyficznych dla izoformy

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy procedurę immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) do analizy lokalizacji całego genomu izoform białek, które różnią się domeną wiążącą histony. Stosujemy go do analizy ChIP-Seq w celu identyfikacji celów demetylazy histonowej KDM5A / JARID1A / RBP2.

Streszczenie

Rekrutacja czynników transkrypcyjnych i epigenetycznych do ich celów jest kluczowym krokiem w ich regulacji. Wyraźnie widoczne w rekrutacji są domeny białkowe, które wiążą się z określonymi modyfikacjami histonów. Jedną z takich domen jest homeodomena roślinna (PHD), znajdująca się w kilku białkach wiążących chromatynę. Czynnik epigenetyczny RBP2 ma wiele domen PHD, jednak pełnią one różne funkcje (ryc. 4). W szczególności C-końcowa domena PHD, znajdująca się w fuzji onkogennej RBP2 w ludzkiej białaczce, wiąże się z trimetylowaną lizyną 4 w histonie H3 (H3K4me3)¹. Transkrypt odpowiadający izoformie RBP2 zawierającej C-końcowy PHD gromadzi się podczas różnicowania komórek promocyjnych pochodzących z chłoniaka U937 w monocyty². Zgodnie z obydwoma zestawami danych, analiza całego genomu wykazała, że w zróżnicowanych komórkach U937 białko RBP2 jest zlokalizowane w regionach genomu wysoce wzbogaconych o H3K4me3³. Lokalizacja RBP2 do jego celów koreluje ze spadkiem H3K4me3 z powodu aktywności demetylazy histonów RBP2 i spadkiem aktywności transkrypcyjnej. W przeciwieństwie do tego, dwa inne doktoraty RBP2 nie są w stanie związać H3K4me3. Warto zauważyć, że domena C-końcowa PHD RBP2 jest nieobecna w mniejszej izoformie^{RBP2 4}. Można sobie wyobrazić, że mała izoforma RBP2, która nie ma interakcji z H3K4me3, różni się od większej izoformy lokalizacją genomową. Różnica w lokalizacji genomowej izoform RBP2 może odpowiadać za obserwowaną różnorodność funkcji RBP2. W szczególności RBP2 jest kluczowym graczem w różnicowaniu komórkowym, w którym pośredniczy białko siatkówki (pRB). Zgodnie z tymi danymi, wcześniejsza analiza całego genomu, bez rozróżnienia między izoformami, zidentyfikowała dwie odrębne grupy docelowych genów RBP2: 1) geny związane przez RBP2 w sposób niezależny od różnicowania; 2) geny związane przez RBP2 w sposób zależny od różnicowania.

Aby zidentyfikować różnice w lokalizacji między izoformami, przeprowadziliśmy analizę lokalizacji całego genomu za pomocą ChIP-Seq. Korzystając z przeciwciał, które wykrywają obie izoformy RBP2, zlokalizowaliśmy wszystkie cele RBP2. Dodatkowo mamy przeciwciała, które wiążą tylko dużą, a nie małą izoformę RBP2 (ryc. 4). Po zidentyfikowaniu dużych celów izoformy, można je następnie odjąć od wszystkich celów RBP2, aby ujawnić cele małej izoformy. Dane te pokazują udział domeny oddziałującej z chromatyną w rekrutacji białka do jego miejsc wiązania w genomie.

Protokół

Protokół został pierwotnie zaadaptowany z B. Ren, 2001. Stanowi on niewielką modyfikację protokołu autorstwa Odoma i wsp.5, którą można znaleźć pod adresem http://jura.wi.mit.edu/cgi-bin/young_public/navframe.cgi?s=22&f=appendices_downloads

1. Wstępna blokada i wiązanie przeciwciała z kulkami magnetycznymi (powinno być wykonane w noc przed następnym krokiem)

1. Przemyj 100 μl Dynabeads Protein G (na IP, połączyć dla wielu IP) w 1 ml świeżego roztworu BSA/PBS (50 mg BSA w 10 ml PBS - ten roztwór wystarczy na tydzień).
2. Zbierz koraliki za pomocą stojaka magnetycznego i powtórz procedurę prania jeszcze dwa razy.
3. Następnie dodać 10 μg przeciwciała do 250 μl zawiesiny kulek w roztworze PBS/BSA (na IP) i inkubować przez noc na platformie obrotowej w temperaturze 4°C.
4. Po zakończeniu przemyć kulki trzykrotnie w 1 ml roztworu PBS/BSA, a następnie ponownie zawiesić w 10 μl roztworu PBS/BSA (na IP).

2. Sieciowanie komórek

1. Aby rozpocząć tę procedurę, wyhoduj około 10⁸ komórek dla każdej immunoprecypitacji lub IP. Tutaj stosuje się rozlane komórki chłoniaka histocytarnego U937 i indukuje się je w celu różnicowania monocytowego z TPA przez 96 godzin.
2. Po wzroście komórek dodać roztwór formaldehydu bezpośrednio do pożywki do końcowego stężenia 1%. Następnie krótko zamieszać kolby i pozostawić je w temperaturze pokojowej na 10 minut. Następnie odessać pożywkę i przepłukać komórki 15 ml lodowatego PBS. Powtórz to pranie raz.
3. Następnie dodać 6 ml buforu do lizy 1 (50 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10% glicerolu, 0,5% NP-40, 0,25% Triton X-100, zawierającego inhibitory proteazy) do każdej z kolb na lodzie. Następnie kołysać kolby przez 20 minut w temperaturze 4°C.
4. Na koniec zbierz komórki za pomocą skrobaka do komórek i przenieś je do stożkowych probówek o pojemności 15 ml. W tym momencie ogniwa mogą być przechowywane w temperaturze -80°C.

3. Sonikacja komórek

1. Jeśli komórki zostały zamrożone, rozmroź je. Po rozmrożeniu odwirować komórki z prędkością 3 000 obr./min przez 10 minut w temperaturze 4°C i wyrzucić supernatant. Następnie ponownie zawieś komórki w 6 ml buforu do lizy 2 (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 200 mM NaCl, 1mM EDTA, 0,5 mM EGTA, zawierające inhibitory proteazy). Delikatnie kołysz rurkami w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
2. Powtórzyć wirowanie i ponownie zawiesić komórki w 2,5 ml buforu do lizy 3 (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,5 mM EGTA, 0,1% deoksycholan sodu, 0,5% N-lauroilsarkozyna, zawierające inhibitory proteazy).
3. Następnie przygotuj zawiesinę do sonikacji, umieszczając ją w zlewce z lodowatą wodą z mikrokońcówką soniku Branson 450 ustawioną na amplitudę od 50 do 60%.
4. Sonikuj roztwór przez 30 sekund i schładzaj na lodzie przez 1 minutę. Powtórz te impulsy od 10 do 15 razy. Następnie odpipetować zawartość probówki w górę i w dół i przenieść ją do nowej probówki. Kontynuuj pulsowanie i schładzanie roztworu dodatkowo 5 razy.
5. Po sonikacji dodać 10% Triton X-100 do 1/10 objętości roztworu. Przenieś lizaty do probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml i odwiruj zanieczyszczenia w mikrowirówce. Następnie przenieś lizat komórkowy do nowej probówki.

4. Immunoprecypitacja chromatyny

1. Przed immunoprecypitacją chromatyny lub ChIP zachowaj 50 μl lizatu komórkowego jako próbkę wejściową. Następnie połącz oczyszczony lizat komórkowy z Dynabeads wstępnie związanymi z przeciwciałem, które zostało wcześniej przygotowane w sposób opisany powyżej. Mieszaninę należy rozdrabniać wraz z próbką wejściową o objętości 50 μl w temperaturze 4°C przez noc.
2. Przemyj kulki 1 ml buforu do przemywania (50 mM HEPES-KOH, pH 7,6, 0,5 M LiCl, 1 mM EDTA, 0,7% deoksycholanu sodu, 1% NP-40). Następnie użyj podstawki magnetycznej, aby zebrać koraliki i usunąć supernatant. Powtórz to pranie od 6 do 8 razy.
3. Wykonaj końcowe płukanie 1 ml TE-plus-50 mM NaCl (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA). Wirować kulki w mikrowirówce z prędkością 3 000 obr./min przez 2 minuty w temperaturze 4°C. Po odwirowaniu odessać resztki buforu TE.
4. Następnie dodać 100 μl buforu elucyjnego (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM EDTA, 1% SDS) do próbek. Bezpośrednio po tym należy inkubować próbki w temperaturze 65 °C przez 10–15 minut. Zdrapuj probówki o stojak na probówki o pojemności 1,5 ml co 2 minuty, aby kulki pozostały w zawiesinie.
5. Zebrać kulki za pomocą wirówki i podstawki magnetycznej, a następnie przenieść supernatant do probówki do PCR. Następnie należy pobrać wcześniej zapisaną próbkę wejściową i dodać 3 objętości buforu elucyjnego.
6. Na koniec należy umieścić IP i próbki wejściowe w termocyklerze na noc w temperaturze 65 °C, aby odwrócić wiązania krzyżowe.
7. Następnego dnia dodać 1 objętość buforu TE do próbek. Następnie dodać RNazę A do końcowego stężenia 0,2 μg/μl. Inkubować próbki w termocyklerze przez 1 do 2 godzin w temperaturze 37 °C.
8. Po inkubacji dodać proteinazę K do końcowego stężenia 0,2 μg/μL. Następnie inkubować próbki w termocyklerze w temperaturze 55 °C przez 2 godziny.
9. Następnie należy raz wyekstrahować próbki jedną objętością fenolu. Ekstrahować próbki po raz drugi za pomocą jednej objętości alkoholu fenolo-chloroformowego:izoamylowego. Na koniec ponownie wyekstrahować próbki jedną objętością chloroformu: alkoholu izoamylowego.
10. Następnie dodaj 30 μg glikogenu do każdej próbki. Należy również dodać NaCl do końcowego stężenia 0,2 mola i dwie objętości etanolu do próbek. Inkubować je przez 30 minut w temperaturze -80 °C. Po inkubacji odwirować próbki i zdekantować supernatant. Umyj granulki 500 μl 75% etanolu. Następnie wysusz granulki i ponownie zawieś je w 40 μl wody.
11. Aby sprawdzić rozmiary fragmentów DNA wytworzonych w procedurze sonikacji, należy załadować 5 μg oczyszczonej próbki wejściowej do 1,8% żelu agarozowego i uruchomić żel. Procedura sonikacji powinna wytworzyć fragmenty w zakresie 150-350 par zasad. Jeśli jednak fragmenty nie mieszczą się w tym zakresie, procedurę sonikacji należy dostosować, zmieniając liczbę impulsów i amplitudę.
12. W celu sprawdzenia odporności i swoistości ChIP, wzbogacenie w kontrolnych regionach wiążących poprzez wykonanie specyficznego dla genu PCR z 1 μl próbek IP i serią rozcieńczeń próbki wejściowej. Należy wybrać dwa do trzech "związanych" regionów i niezwiązany region kontrolny w celu zbadania jakości IP i próbek wejściowych.

5. Amplifikacja genomowego DNA

1. Zaczynając od 34 μl próbki IP lub 200 ng próbki wejściowej, wykonaj naprawę końcową, dodanie ogona "A" i ligację adapterów do fragmentów DNA za pomocą zestawu do przygotowania próbki genomowego DNA http://www.illumina.com/systems/genome_analyzer.ilmn (Illumina, Inc., San Diego, CA).
2. Oczyść DNA za pomocą zestawu do oczyszczania MinElute PCR, a następnie eluuj je w buforze EB (10 mM Tris Cl, pH 8,5), który został wstępnie podgrzany do 50 °C. Na przykład użyj 23 μl i 46 μl odpowiednio do końcowej elucji IP i wejściowych próbek DNA.
3. Przeprowadzić reakcję PCR, używając 23 μl DNA z adapterami i 25 μl polimerazy Phusion DNA z zestawu, 1 μl 20 μM Sol_PCR_1 i 1 μL 20 μM Sol_PCR_2. Przeprowadzić reakcję PCR w następujący sposób: 1) 30 sekund w temperaturze 98°C; 2) 10 sekund w temperaturze 98°C; 3) 30 sekund w temperaturze 65°C; 4) 30 sekund w temperaturze 72°C; powtarzanie kroków 2-4 18 razy, a następnie 5 minut w temperaturze 72°C, na koniec trzymając w temperaturze 4°C.
4. Po amplifikacji PCR oczyść DNA za pomocą zestawu do oczyszczania QIAGEN MinElute PCR. Podgrzać 15 μl buforu EB do temperatury 50 °C i wymyć DNA. Rozcieńczyć 0,5 μl próbki w stosunku 1:4 i wykonać odczyt Nanodrop.

6. Oczyszczanie żelu produktów amplifikowanych

1. Aby oczyścić amplifikowane produkty, przygotuj 1,8% żel agarozowy o pojemności 50 ml przy użyciu wody klasy HPLC. Dodać TAE i bromek etydyny po stopieniu się agarozy. Następnie wlej żel. Załadować żel po dodaniu 4 μl buforu ładującego do próbek wejściowych i IP. Następnie uruchom żel pod napięciem 120 woltów przez 45 minut.
2. Przeanalizuj żel po jego spuszczeniu. Żel powinien ujawnić, że wytwarzane są fragmenty w zakresie od 150 do 350 par zasad. Reprezentują one fragmenty genomowego DNA o długości od 50 do 250 par zasad i adaptera.
3. Za pomocą skalpela należy wyciąć obszar żelu zawierający materiał z zakresu 150 350 par zasad. Uważaj, aby nie wyciąć pasma adapter-adapter, które działa przy około 120 parach zasad. Odzyskaj DNA za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu QIAquick zgodnie z instrukcjami producenta. W szczególności użyj jednej kolumny z zestawu do ekstrakcji żelu QIAquick dla plastra żelu 400 mg lub mniej. Aby rozpocząć proces ekstrakcji, dodaj 3 objętości buforu QG do 1 objętości żelu. Dodać 1 objętość izopropanolu i załadować mieszaninę na kolumnę. Użyć 0,5 ml QG do przepłukania kolumny, a następnie wykonać standardową procedurę opisaną w instrukcji zestawu. Użyj_H2Opodgrzanego do 50°C, aby wymyć DNA. Inkubować kolumnę z 30 μl_H2Oprzez 5 minut w temperaturze 37 °C przed jej odwirowaniem.
4. Wysuszyć próbkę dokładnie do 11 μl w odkurzaczu Speedvac bez podgrzewania. Usunąć 1 μl próbki i zmierzyć stężenie DNA za pomocą spektrofotometru Nanodrop.
5. Na koniec zidentyfikuj wzbogacone produkty genów za pomocą Illumina Genome AnalyzerIIe, jak opisano w http://genesdev.cshlp.org/content/suppl/2008/12/15/22.24.3403.DC1/GuentherSuppMat.pdf ⁶.

7. Reprezentatywne wyniki

Rysunek 1. Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest identyfikacja celów genomowych demetylazy histonowej KDM5A/JARID1A/RBP2.

(P1) Osiąga się to poprzez przygotowanie usieciowanej chromatyny, która jest sonikowana w celu wytworzenia fragmentów DNA o odpowiedniej wielkości. (P2) W drugim etapie fragmenty DNA związane z RBP2 są poddawane immunoprecypitacji przeciwciałami RBP2. (P3) Następnie odzyskane fragmenty DNA są naprawiane na końcach, a adaptery są ligowane na końcach genomowego DNA w celu przygotowania bibliotek genomowego DNA do analizy na komórkach przepływowych w Stacji Klastrowej Illumina. Biblioteki DNA są amplifikowane metodą PCR przy użyciu małej liczby cykli. (P4) Wreszcie, krótkie odczyty sekwencjonowane przez illumina są unikalnie dostosowane do ludzkiego genomu, znaczące piki są identyfikowane i opisywane do najbliższych genów w celu identyfikacji regionów wzbogaconych w RBP2. (P5) Uzyskano wyniki, które pokazują funkcje molekularne związane z docelowymi genami RBP2 w oparciu o identyfikację całego genomu regionów wzbogaconych w RBP2.

Rysunek 2. Sprawdzanie wyników sonikacji chromatyny Aby sprawdzić rozmiary fragmentów DNA wytworzonych w procesie sonikacji, 5 μg (1/10) oczyszczonej próbki wejściowej załadowano na 1,8% żel agarozowy. Zgodnie z oczekiwaniami, nasza procedura sonikacji wytworzyła fragmenty w zakresie 150-350 pz. Jeśli jednak fragmenty nie mieszczą się w tym zakresie, procedura sonikacji powinna być odpowiednio dostosowana, poprzez zmianę liczby impulsów i amplitudy.

Rysunek 3. Oczyszczanie żelowe produktów amplifikowanych. Produkty PCR są uruchamiane na żelu w celu usunięcia adapterów i wybrania zakresu rozmiarów szablonów dla platformy generowania klastrów. Żel ten pokazuje, że wyprodukowano fragmenty w zakresie od 150 do 350 par zasad. Reprezentują one fragmenty genomowego DNA o długości od 50 do 250 par zasad i adaptera. Wybrany obszar żelu wycinamy skalpelem. Należy uważać, aby uniknąć pasma adapter-adapter, które działa na około 120 parach podstaw.

Rysunek 4. Przeciwciało specyficzne dla izoformy pozwala na rozróżnienie dużych i małych izoform RBP2. Struktura białka RBP2 jest przedstawiona w widoku domenowym. RBP2 zawiera kilka domen: domenę JmjC katalitycznej demetylacji histonów i związaną z nią domenę JmjN, domenę ARID zdolną do wiązania DNA specyficznego dla sekwencji, palec cynkowy C5HC2, który może potencjalnie wchodzić w interakcje z DNA lub innymi białkami oraz wiele domen PHD. Dwa przeciwciała anty-RBP2, które umożliwiają rozróżnienie izoform RBP2, uzyskano w stosunku do fragmentów RBP2 oznaczonych grubymi liniami.

Ryc. 5a. Przegląd regionów wiążących RBP2 wraz z chromosomami i genami Ensembl. Współrzędne genomowe zidentyfikowanych wzbogaconych regionów wiążących RBP2 (wszystkie izoformy i duże izoformy) przedstawiono pod względem chromosomów. Zajętość genów Ensembl (wersja 54; hg18) w chromosomach (chromosom 10 na tym zdjęciu) jest przedstawiona jako czarne paski (górny panel). Każdy region wiązania RBP2 jest reprezentowany jako pionowa linia, gdzie środkowy panel pokazuje wszystkie regiony wiążące izoformy RBP2 na chromosomie 10, a dolny panel pokazuje duże regiony wiążące izoformy RBP2. Środkowy i dolny panel dają przegląd nakładających się na siebie i specyficznych zajęć izoform RBP2 na chromosomie 10.

Ryc. 5b. Analiza wzbogacenia funkcjonalnego docelowych genów RBP2. Mapa cieplna pokazująca, że FDR znacznie się skorygował (wartość p ≤0,05) wzbogacił kategorie funkcji molekularnych GO wśród genów związanych (geny najbliższe regionowi wiązania RBP2) przez RBP2 (wszystkie i duże izoformy). Kolory w kierunku czerwonego oznaczają wysoką istotność statystyczną, żółty oznacza niską istotność statystyczną, a szary oznacza brak istotności statystycznej. Analiza wzbogacenia pokazuje nakładające się na siebie i specyficzne dla izoform funkcje molekularne docelowych genów RBP2.

Dyskusja

Różnice funkcjonalne pomiędzy izoformami RBP2 nie zostały określone. Zastosowaliśmy kompleksowe podejście do identyfikacji regionów genomu związanych przez izoformy RBP2 i zdefiniowania kategorii funkcjonalnych, które te regiony reprezentują. Udało się to osiągnąć za pomocą analizy ChIP-Seq, a następnie analizy bioinformatycznej uzyskanych odczytów sekwencji.

RBP2 modyfikuje metylowane reszty lizyny na ogonach histonów. Odkryliśmy, że duża izoforma RBP2 zawierająca moduł rozpoznawania metylowanej lizyny histonowej i mała izoforma RBP2 pozbawiona tego modułu wiążą się z różnymi regionami w ludzkim genomie (Figura 5A). Co ważne, regiony specyficzne dla izoform i nakładające się regiony należą do genów o różnych funkcjach molekularnych (ryc. 5B). Na przykład funkcje "wiązania chromatyny" i "wiązania czynnika transkrypcyjnego" można przypisać celom genów małej izoformy RBP2, ale nie dużej izoformy RBP2 (Figura 5B). Porównując rzeczywiste zestawy genów wygenerowane dla wszystkich izoform i dużych izoform RBP2 (dane nie pokazane), możemy również określić, czy duża izoforma jest specyficznie rekrutowana do określonych genów.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
37% roztwór formaldehydu	Fisher Scientific	F79500
BSA	USB Corp., Affymetrix	10852
chloroform/alkohol izoamylowy	Sigma-Aldrich	C0549
Dynabeads Białko G	Invitrogen	100.04D
EDTA	Fisher Scientific	BP120-500
EGTA	Sigma-Aldrich	E3889
Zestaw do przygotowania próbek genomowego DNA	Illumina	FC-102-1001
glicerol	Sigma-Aldrich	G5516
glikogen	Boehringer Ingeheim	901393
Hepes	Invitrogen	15630080
KOH	Fisher Scientific	P250-500
LiCl	Sigma-Aldrich	L9650
Drabinka DNA o niskiej masie cząsteczkowej	New England Biolabs	N3233S
deoksycholan sodu	Sigma-Aldrich	D6750
N-lauroilosarkozyna	MP Biomedicals	194008
NP-40	Sigma-Aldrich	I3021
PBS	Fisher Scientific	mt21040cv
fenol	Sigma-Aldrich	P-4557
Polimeraza DNA Phusion	New England Biolabs	F-540S
proteinaza K	GIBCO, firmy Life Technologies	25530-049
Zestaw do oczyszczania QIAquick PCR	Qiagen	28104
MinElute Zestaw do oczyszczania PCR	Qiagen	28004
QIAquick Zestaw	do ekstrakcji żeluQiagen	28704
RNAzywa A	Sigma-Aldrich	R4642
SDS	Invitrogen	24730020
TE (endofree for maxi-prep kit)	Qiagen	19048
Tris	Sigma-Aldrich	154563
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151100
Ultra Agarose, Certyfikowany niski zasięg	Bio-Rad	161-3106
Sekwencje oligonukleotydowe 2006 Illumina, Inc. Wszelkie prawa zastrzeżone. Sol_PCR_1 Sequence 5'-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACT CTT TCC CTA CAC GAC GCT CCG ATC TC T-3' Sol_PCR_2 Sekwencja 5'-CAA, GCA, GAA, GAC, GGC, ATA, CGA, GCT, CCT, CCG, ATC, T-3'