Analiza całogenomowa z wykorzystaniem metody ChIP w celu identyfikacji specyficznych dla izoform celów genowych

Podsumowanie

Przedstawiamy tutaj procedurę immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) służącą do analizy lokalizacji w całym genomie izoform białek różniących się domeną wiążącą histony. Zastosowaliśmy ją w analizie ChIP-Seq w celu zidentyfikowania celów demetylazy histonów KDM5A/JARID1A/RBP2.

Streszczenie

Rekrutacja czynników transkrypcyjnych i epigenetycznych do ich celów jest kluczowym etapem ich regulacji. Istotną rolę w rekrutacji odgrywają domeny białkowe wiążące specyficzne modyfikacje histonów. Jedną z takich domen jest domena homeodomeny roślinnej (PHD), występująca w kilku białkach wiążących chromatynę. Czynnik epigenetyczny RBP2 posiada wiele domen PHD, jednak pełnią one różne funkcje (Rycina 4). W szczególności domena PHD C-końcowa, występująca w onkogennej fuzji RBP2 w białaczce u ludzi, wiąże trimetylowaną lizynę 4 w histonie H3 (H3K4me3)¹. Transkrypty odpowiadające izoformie RBP2 zawierającej C-końcową domenę PHD kumulują się podczas różnicowania promonocytowych komórek U937 pochodzących z chłoniaka w monocyty². Zgodnie z obydwoma zestawami danych, analiza w skali całego genomu wykazała, że w zróżnicowanych komórkach U937 białko RBP2 lokalizuje się w regionach genomowych silnie wzbogaconych w H3K4me3³. Lokalizacja RBP2 w jego celach koreluje ze spadkiem poziomu H3K4me3 wynikającym z aktywności demetylazy histonowej RBP2 oraz ze spadkiem aktywności transkrypcyjnej. W przeciwieństwie do niej, dwie pozostałe domeny PHD białka RBP2 nie są w stanie wiązać H3K4me3. Co istotne, C-końcowa domena PHD białka RBP2 nie występuje w mniejszej izoformie RBP2⁴. Można przypuszczać, że mała izoforma RBP2, której brakuje oddziaływania z H3K4me3, różni się od większej izoformy pod względem lokalizacji genomowej. Różnica w lokalizacji genomowej izoform RBP2 może wyjaśniać obserwowaną różnorodność funkcji RBP2. Konkretnie, RBP2 jest kluczowym elementem różnicowania komórkowego pośredniczonego przez białko retinoblastomy (pRB). Zgodnie z tymi danymi, wcześniejsza analiza w skali całego genomu, bez rozróżnienia na izoformy, zidentyfikowała dwie odrębne grupy genów docelowych RBP2: 1) geny wiązane przez RBP2 w sposób niezależny od różnicowania; 2) geny wiązane przez RBP2 w sposób zależny od różnicowania.

W celu zidentyfikowania różnic w lokalizacji między izoformami przeprowadziliśmy analizę lokalizacji w całym genomie za pomocą metody ChIP-Seq. Używając przeciwciał wykrywających obie izoformy RBP2, zlokalizowaliśmy wszystkie cele RBP2. Dodatkowo dysponujemy przeciwciałami, które wiążą się wyłącznie z dużą, a nie z małą izoformą RBP2 (Rycina 4). Po zidentyfikowaniu celów dużej izoformy można je odjąć od wszystkich celów RBP2, aby ujawnić cele małej izoformy. Dane te wykazują wpływ domeny oddziałującej z chromatyną na rekrutację białka do jego miejsc wiązania w genomie.

Protokół

Protokół został pierwotnie zaadaptowany z pracy B. Ren, 2001. Stanowi on niewielką modyfikację protokołu opracowanego przez Odom i wsp.⁵, który znajduje się pod adresem http://jura.wi.mit.edu/cgi-bin/young_public/navframe.cgi?s=22&f=appendices_downloads

1. Preblokowanie i wiązanie przeciwciał z kulkami magnetycznymi (Należy przeprowadzić wieczorem w dniu poprzedzającym kolejny etap)

1. Przemyj 100 μL kulek Dynabeads Protein G (na jedną IP, połącz w przypadku wielu IP) w 1 mL świeżego roztworu BSA/PBS (50 mg BSA w 10 mL PBS – roztwór ten zachowuje stabilność przez jeden tydzień).
2. Zbierz kulki za pomocą statywu magnetycznego i powtórz procedurę płukania jeszcze dwa razy.
3. Następnie dodaj 10 μg przeciwciała do 250 μl zawiesiny kulek w roztworze PBS/BSA (na jedną IP) i inkubuj przez noc na platformie rotacyjnej w temperaturze 4°C.
4. Po zakończeniu przemyj kulki trzy razy w 1 ml roztworu PBS/BSA, a następnie resuspenduj w 10 μl roztworu PBS/BSA (na jedną IP).

2. Sieciowanie komórek

1. Aby rozpocząć tę procedurę, należy wyhodować około 10⁸ komórek na każdą immunoprecypitację (IP). W tym przypadku zastosowano komórki chłoniaka histiocytarnego U937, których różnicowanie w kierunku monocytarnym indukowano za pomocą TPA przez 96 godzin.
2. Po namnożeniu komórek należy dodać roztwór formaldehydu bezpośrednio do pożywki do stężenia końcowego 1%. Następnie krótko zakręcić kolbami i pozostawić je w temperaturze pokojowej na 10 minut. Po tym czasie należy odessać pożywkę i wypłukać komórki 15 mL lodowatego PBS. Czynność tę należy powtórzyć raz.
3. Następnie do każdej kolby, znajdującej się w lodzie, należy dodać 6 mL Buforu Lizującego 1 (50 mM HEPES-KOH, pH 7.5, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10% glicerolu, 0.5% NP-40, 0.25% Triton X-100, zawierającego inhibitory proteaz). Następnie kolby należy inkubować na wytrząsarce przez 20 minut w temperaturze 4°C.
4. Na koniec komórki należy zebrać za pomocą skrobaka do komórek i przenieść do 15 mL probówek stożkowych. Na tym etapie komórki można przechowywać w temperaturze -80°C.

3. Sonikacja komórek

1. Jeśli komórki były zamrożone, należy je rozmrozić. Po rozmrożeniu odwirować komórki przy 3,000 rpm przez 10 minut w 4°C i odrzucić nadsącz. Następnie zawiesić komórki ponownie w 6 mL Buforu Lizującego 2 (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 200 mM NaCl, 1mM EDTA, 0.5 mM EGTA, zawierającego inhibitory proteaz). Delikatnie inkubować probówki na wytrząsarce w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
2. Powtórzyć wirowanie i zawiesić komórki ponownie w 2,5 mL Buforu Lizującego 3 (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.5 mM EGTA, 0,1% dejksykolanu sodu, 0,5% N-lauroylosarkozyny, zawierającego inhibitory proteaz).
3. Następnie przygotować zawiesinę do sonikacji, umieszczając ją w zlewce z lodowatą wodą, używając mikrokońcówki sonikatora Branson 450 ustawionego na amplitudę od 50 do 60%.
4. Sonikować roztwór w jednym stałym impulsie przez 30 sekund, a następnie chłodzić na lodzie przez 1 minutę. Powtórzyć te cykle od 10 do 15 razy. Następnie pipetować zawartość probówki w górę i w dół, a potem przenieść ją do nowej probówki. Kontynuować pulsacyjne sonikowanie i chłodzenie roztworu jeszcze 5 razy.
5. Po sonikacji dodać 10% Triton X-100 w ilości odpowiadającej 1/10 objętości roztworu. Przenieść lizaty do probówek wirówek o pojemności 1,5 mL i odwirować resztki komórkowe w mikrowirówce. Następnie przenieść lizat komórkowy do nowej probówki.

4. Immunoprecypitacja chromatyny

1. Przed immunoprecypitacją chromatyny, czyli ChIP, należy odstawić 50 μL lizatu komórkowego jako próbkę wejściową (input). Następnie oczyszczony lizat komórkowy należy połączyć z Dynabeads uprzednio związanymi z przeciwciałem, przygotowanymi zgodnie z powyższym opisem. Mieszaninę, a także próbkę wejściową 50 μL, należy inkubować na wytrząsarce w temperaturze 4°C przez noc.
2. Kuleczki należy przemyć 1 mL Buforu do Mycia (50 mM HEPES-KOH, pH 7.6, 0.5 M LiCl, 1mM EDTA, 0.7% deoksycholan sodu, 1% NP-40). Następnie, przy użyciu statywu magnetycznego, należy zebrać kuleczki i usunąć nadsącz. Czynność tę należy powtórzyć od 6 do 8 razy.
3. Należy przeprowadzić końcowe przemycie przy użyciu 1 mL TE-plus-50 mM NaCl (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA). Kuleczki należy wirować w mikrowirówce przy 3,000 rpm przez 2 minuty w temperaturze 4°C. Po wirowaniu należy odessać resztki buforu TE.
4. Następnie do próbek należy dodać 100 μL Buforu do Elucji (50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 10 mM EDTA, 1% SDS). Bezpośrednio po tym próbki należy inkubować w temperaturze 65 °C przez 10 do 15 minut. Co 2 minuty należy potrząsnąć probówkami o statyw do probówek 1,5 mL, aby utrzymać kuleczki w zawiesinie.
5. Kuleczki należy zebrać poprzez wirowanie i przy użyciu statywu magnetycznego, a nadsącz przenieść do probówki PCR. Następnie należy pobrać wcześniej odstawioną próbkę wejściową i dodać do niej 3 objętości Buforu do Elucji.
6. Na koniec próbki IP i wejściowe należy umieścić w termocyklerze na noc w temperaturze 65 °C w celu odwrócenia wiązań krzyżowych.
7. Następnego dnia do próbek należy dodać 1 objętość buforu TE. Następnie należy dodać RNazę A do stężenia końcowego 0.2 μg/μL. Próbki należy inkubować w termocyklerze przez 1 do 2 godzin w temperaturze 37 °C.
8. Po inkubacji należy dodać proteinazę K do stężenia końcowego 0.2 μg/μL. Następnie próbki należy inkubować w termocyklerze w temperaturze 55 °C przez 2 godziny.
9. W kolejnym kroku próbki należy poddać jednokrotnej ekstrakcji jedną objętością fenolu. Próbki należy ekstrahować po raz drugi jedną objętością mieszaniny fenol:chloroform:alkohol izoamylowy. Na koniec próbki należy ekstrahować jeszcze raz jedną objętością mieszaniny chloroform:alkohol izoamylowy.
10. Następnie do każdej próbki należy dodać 30 μg glikogenu. Należy również dodać NaCl do stężenia końcowego 0.2 M oraz dwie objętości etanolu. Próbki należy inkubować przez 30 minut w temperaturze -80 °C. Po inkubacji próbki należy odwirować, a nadsącz odlać. Osady należy przemyć 500 μL 75% etanolu. Następnie osady należy wysuszyć i resuspenderować w 40 μL wody.
11. Aby sprawdzić wielkość fragmentów DNA powstałych w wyniku sonikacji, należy nałożyć 5 μg oczyszczonej próbki wejściowej na żel agarozowy 1.8% i przeprowadzić elektroforezę. Procedura sonikacji powinna generować fragmenty w zakresie 150-350 par zasad. Jeśli jednak fragmenty nie mieszczą się w tym zakresie, należy skorygować parametry sonikacji, zmieniając liczbę impulsów oraz amplitudę.
12. Aby sprawdzić powtarzalność i swoistość ChIP, należy ocenić wzbogacenie w kontrolnych regionach wiązania, przeprowadzając genowo-specyficzną PCR z użyciem 1 μl próbek IP oraz serii rozcieńczeń próbki wejściowej. W celu przetestowania jakości próbek IP i wejściowych należy wybrać od dwóch do trzech regionów „związanych” oraz jeden niezwiązany region kontrolny.

5. Amplifikacja DNA genomowego

1. Rozpoczynając od 34 μl próbki IP lub 200 ng próbki wejściowej (input), przeprowadzić naprawę końców, dodanie ogona 'A' oraz ligację adapterów do fragmentów DNA przy użyciu zestawu Genomic DNA Sample Prep Kit http://www.illumina.com/systems/genome_analyzer.ilmn (Illumina, Inc., San Diego, CA).
2. Oczyścić DNA za pomocą zestawu MinElute PCR Purification Kit, a następnie eluować je w buforze EB (10 mM Tris Cl, pH 8.5) uprzednio podgrzanym do 50 °C. Na przykład użyć odpowiednio 23 μL i 46 μL do końcowej elucji próbek DNA IP oraz wejściowych.
3. Przygotować reakcję PCR, używając 23 μL DNA z adapterami, 25 μL polimerazy DNA Phusion z zestawu, 1 μL 20 μM Sol_PCR_1 oraz 1 μL 20 μM Sol_PCR_2. Reakcję PCR przeprowadzić w następujący sposób: 1) 30 sekund w 98°C; 2) 10 sekund w 98°C; 3) 30 sekund w 65°C; 4) 30 sekund w 72°C; powtarzać kroki 2-4 18 razy, następnie 5 minut w 72°C i na koniec inkubować w 4°C.
4. Po amplifikacji PCR oczyścić DNA za pomocą zestawu QIAGEN MinElute PCR Purification Kit. Podgrzać 15 μL buforu EB do 50 °C i eluować DNA. Rozcieńczyć 0,5 μL próbki w stosunku 1:4 i wykonać pomiar spektrofotometrem Nanodrop.

6. Oczyszczanie produktów amplifikacji za pomocą żelu

1. Aby oczyścić produkty amplifikacji, przygotuj 50 mL 1,8% żelu agarozowego, używając wody klasy HPLC. Po roztopieniu agarozy dodaj bufor TAE oraz bromek etydyny. Następnie wlej żel do formy. Po dodaniu 4 μL buforu do ładowania do próbek wejściowych (input) oraz IP, nałóż je na żel. Następnie prowadź elektroforezę przy napięciu 120 V przez 45 minut.
2. Przeanalizuj żel po zakończeniu elektroforezy. Na żelu powinny być widoczne fragmenty w zakresie od 150 do 350 par zasad. Reprezentują one fragmenty DNA genomicznego o długości od 50 do 250 par zasad oraz adapter.
3. Za pomocą skalpela wytnij z żelu obszar zawierający materiał w zakresie od 150 do 350 par zasad. Należy uważać, aby nie wyciąć prążka adapter-adapter, który znajduje się na poziomie około 120 par zasad. Odzyskaj DNA za pomocą zestawu QIAquick Gel Extraction Kit zgodnie z instrukcjami producenta. W szczególności użyj jednej kolumny z zestawu QIAquick Gel Extraction Kit dla fragmentu żelu o masie 400 mg lub mniej. Aby rozpocząć proces ekstrakcji, dodaj 3 objętości buforu QG do 1 objętości żelu. Dodaj 1 objętość izopropanolu i nałóż mieszaninę na kolumnę. Do przemycia kolumny użyj 0,5 ml buforu QG, a następnie postępuj zgodnie ze standardową procedurą opisaną w instrukcji zestawu. Do elucji DNA użyj H₂O wstępnie podgrzanej do 50°C. Inkubuj kolumnę z 30 μl H₂O przez 5 minut w temperaturze 37°C przed wirowaniem.
4. Odparuj próbkę w Speedvacu bez użycia ciepła do objętości dokładnie 11 μL. Pobierz 1 μL próbki i zmierz stężenie DNA za pomocą spektrofotometru Nanodrop.
5. Na koniec zidentyfikuj wzbogacone produkty genowe przy użyciu Illumina Genome AnalyzerIIe, zgodnie z opisem w http://genesdev.cshlp.org/content/suppl/2008/12/15/22.24.3403.DC1/GuentherSuppMat.pdf ⁶.

7. Reprezentatywne wyniki

Rysunek 1. Ogólnym celem następnego eksperymentu jest zidentyfikowanie celów genomicznych demetylazy histonowej KDM5A/JARID1A/RBP2.

(P1) Osiąga się to poprzez przygotowanie sieciowo powiązanej chromatyny, która jest poddawana sonikacji w celu uzyskania fragmentów DNA o odpowiedniej wielkości. (P2) W drugim kroku fragmenty DNA związane z RBP2 są immunoprecypitowane przy użyciu przeciwciał przeciwko RBP2. (P3) Następnie odzyskane fragmenty DNA są naprawiane na końcach, a do końców DNA genomicznego ligowane są adaptery w celu przygotowania bibliotek DNA genomicznego do analizy w komórkach przepływowych w systemie Illumina Cluster Station. Biblioteki DNA są amplifikowane metodą PCR z wykorzystaniem niewielkiej liczby cykli. (P4) Na koniec krótkie odczyty sekwencjonowane w systemie Illumina są jednoznacznie mapowane do genomu ludzkiego, a następnie identyfikowane są istotne piki i przypisywane im najbliższe geny w celu zidentyfikowania regionów wzbogaconych w RBP2. (P5) Wyniki pozwalają na określenie funkcji molekularnych związanych z genami docelowymi RBP2 na podstawie ogólnogenomowej identyfikacji regionów wzbogaconych w RBP2.

Rycina 2. Kontrola wyników sonikacji chromatyny W celu sprawdzenia wielkości fragmentów DNA powstałych w wyniku procedury sonikacji, na żel agarozowy 1,8% naniesiono 5 μg (1/10) oczyszczonej próbki wejściowej. Zgodnie z oczekiwaniami, zastosowana procedura sonikacji doprowadziła do powstania fragmentów w zakresie 150-350 bp. Jeżeli jednak fragmenty nie mieszczą się w tym zakresie, należy odpowiednio skorygować procedurę sonikacji, zmieniając liczbę cykli oraz amplitudę.

Rysunek 3. Oczyszczanie produktów amplifikacji za pomocą żelu. Produkty PCR są rozdzielane w żelu w celu usunięcia adapterów i wyselekcjonowania zakresu wielkości matryc dla platformy generowania klastrów. Żel ten pokazuje, że powstały fragmenty o wielkości od 150 do 350 par zasad. Reprezentują one fragmenty genomowego DNA o długości od 50 do 250 par zasad oraz adapter. Wycinamy wybrany obszar żelu za pomocą skalpela. Należy zachować ostrożność, aby uniknąć prążka adapter-adapter, który znajduje się na wysokości około 120 par zasad.

Rycina 4. Przeciwciała specyficzne dla izoform pozwalają na rozróżnienie dużych i małych izoform RBP2. Struktura białka RBP2 przedstawiona jest w widoku domen. RBP2 zawiera kilka domen: katalityczną domenę JmjC odpowiedzialną za demethylację histonów wraz z powiązaną domeną JmjN, domenę ARID zdolną do swoistego wiązania sekwencji DNA, palec cynkowy C5HC2, który może potencjalnie oddziaływać z DNA lub innymi białkami, oraz liczne domeny PHD. Dwa przeciwciała anty-RBP2, które umożliwiają rozróżnienie izoform RBP2, zostały opracowane przeciwko fragmentom RBP2 wskazanym pogrubionymi liniami.

Rycina 5a. Przegląd regionów wiązania RBP2 wraz z chromosomem i genami Ensembl. Współrzędne genomiczne zidentyfikowanych wzbogaconych regionów wiązania RBP2 (wszystkie izoformy oraz izoforma długa) przedstawiono w układzie chromosomowym. Położenie genów Ensembl (wersja 54; hg18) w chromosomach (na tym obrazku chromosom 10) przedstawiono w formie czarnych pasków (górny panel). Każdy region wiązania RBP2 jest reprezentowany przez linię pionową, gdzie panel środkowy pokazuje regiony wiązania wszystkich izoform RBP2 na chromosomie 10, a panel dolny pokazuje regiony wiązania długiej izoformy RBP2. Panele środkowy i dolny zapewniają przegląd nakładających się i specyficznych obszarów zajmowania chromosomu 10 przez izoformy RBP2.

Rycina 5b. Analiza wzbogacenia funkcjonalnego genów docelowych RBP2. Mapa ciepła przedstawiająca istotnie (p-value ≤0.05) wzbogacone kategorie GO Molecular Function po korekcie FDR wśród genów wiązanych przez RBP2 (wszystkie izoformy oraz izoformy duże; geny położone najbliżej regionu wiązania RBP2). Kolory w stronę czerwieni wskazują wysoką istotność statystyczną, żółty wskazuje niską istotność statystyczną, a szary brak istotności statystycznej. Analiza wzbogacenia pokazuje wspólne oraz specyficzne dla danej izoformy funkcje molekularne genów docelowych RBP2.

Dyskusja

Różnice funkcjonalne między izoformami RBP2 nie zostały jeszcze określone. Zastosowaliśmy kompleksowe podejście w celu zidentyfikowania regionów genomicznych związanych z izoformami RBP2 oraz zdefiniowania kategorii funkcjonalnych reprezentowanych przez te regiony. Osiągnięto to poprzez analizę ChIP-Seq, a następnie bioinformatyczną analizę uzyskanych odczytów sekwencji.

RBP2 modyfikuje zmetylowane reszty lizyny w ogonach histonów. Stwierdziliśmy, że duża izoforma RBP2, zawierająca moduł rozpoznawania zmetylowanej lizyny histonowej, oraz mała izoforma RBP2, pozbawiona tego modułu, wiążą się z różnymi regionami w ludzkim genomie (Rycina 5A). Co istotne, regiony specyficzne dla danych izoform oraz regiony nakładające się należą do genów o różnych funkcjach molekularnych (Rycina 5B). Na przykład funkcje „wiązania chromatyny” oraz „wiązania czynników transkrypcyjnych” można przypisać genom będącym celami małej izoformy RBP2, ale nie dużej izoformy RBP2 (Rycina 5B). Porównując rzeczywiste zestawy genów wygenerowane dla wszystkich izoform oraz dla dużej izoformy RBP2 (dane nie pokazano), możemy również określić, czy duża izoforma jest specyficznie rekrutowana do określonych genów.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
37% roztwór formaldehydu	Fisher Scientific	F79500
BSA	USB Corp., Affymetrix	10852
chloroform/alkohol izoamylowy	Sigma-Aldrich	C0549
Dynabeads Protein G	Invitrogen	100.04D
EDTA	Fisher Scientific	BP120-500
EGTA	Sigma-Aldrich	E3889
Zestaw do przygotowania próbek genomowego DNA	Illumina	FC-102-1001
glicerol	Sigma-Aldrich	G5516
glikogen	Boehringer Ingelheim	901393
Hepes	Invitrogen	15630080
KOH	Fisher Scientific	P250-500
LiCl	Sigma-Aldrich	L9650
Marker wielkości DNA o niskiej masie cząsteczkowej	New England Biolabs	N3233S
deoksycholan sodu	Sigma-Aldrich	D6750
N-lauroilosarkozyna	MP Biomedicals	194008
NP-40	Sigma-Aldrich	I3021
PBS	Fisher Scientific	mt21040cv
fenol	Sigma-Aldrich	P-4557
Polimeraza DNA Phusion	New England Biolabs	F-540S
proteinaza K	GIBCO, by Life Technologies	25530-049
Zestaw QIAquick PCR purification Kit	Qiagen	28104
Zestaw do oczyszczania PCR MinElute	Qiagen	28004
Zestaw QIAquick Gel Extraction Kit	Qiagen	28704
RNaza A	Sigma-Aldrich	R4642
SDS	Invitrogen	24730020
bufor TE (z zestawu endofree do maxi-prep)	Qiagen	19048
Tris	Sigma-Aldrich	154563
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151100
Ultra Agarose, certyfikowana o niskim zakresie rozdzielczości	Bio-Rad	161-3106
Sekwencje oligonukleotydów 2006 Illumina, Inc. Wszelkie prawa zastrzeżone. Sol_PCR_1 Sekwencja 5’-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACT CTT TCC CTA CAC GAC GCT CTT CCG ATC T-3’ Sol_PCR_2 Sekwencja 5’-CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GCT CTT CCG ATC T-3’