In utero elektroporacja jest cenną metodą transfekcji neuronalnych komórek progenitorowych in vivo. W zależności od rozmieszczenia elektrod oraz momentu rozwojowego przeprowadzenia elektroporacji, można ukierunkować proces na określone podgrupy komórek kory mózgowej. Następnie komórki docelowe można analizować in vivo lub in vitro pod kątem efektów modyfikacji genetycznych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Elektroporacja in utero z następującą po niej pierwotną hodowlą neuronów w celu badania funkcji genów w podzbiorze neuronów korowych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
In vitro badanie pierwotnych kultur neuronalnych umożliwia ilościową analizę wzrostu neurytów. W celu zbadania, w jaki sposób zmiany genetyczne wpływają na wzrost wypustek neuronalnych, do pierwotnych neuronów można wprowadzić konstrukty shRNA lub cDNA za pomocą transfekcji chemicznej lub transdukcji wirusowej. Jednak w przypadku pierwotnych komórek kory za pomocą tych metod transfekowana jest heterogeniczna populacja typów komórek (neurony glutaminergiczne z różnych warstw, neurony hamujące, komórki glejowe). Zastosowanie elektroporacji in utero w celu wprowadzenia konstruktów DNA do kory zarodka gryzonia pozwala na ukierunkowanie działań na określone podgrupy komórek: o ile elektroporacja wczesnej kory zarodkowej obejmuje głębokie warstwy kory, o tyle elektroporacja w późniejszych etapach rozwoju zarodkowego obejmuje warstwy bardziej powierzchowne. Ponadto zróżnicowane rozmieszczenie elektrod na głowach poszczególnych zarodków umożliwia ukierunkowanie na obszary grzbietowo-przyśrodkowe w przeciwieństwie do obszarów brzuszno-bocznych kory. Po elektroporacji transfekowane komórki mogą zostać wyizolowane, dysocjowane i wysiane in vitro do ilościowej analizy wzrostu neurytów. W niniejszej pracy przedstawiamy szczegółową metodę ilościowego pomiaru wzrostu wypustek neuronalnych w podgrupach komórek kory.
Podstawowy protokół elektroporacji in utero został szczegółowo opisany w dwóch innych artykułach JoVE z laboratorium Kriegsteina 1, 2. Przedstawimy przegląd naszego protokołu elektroporacji in utero, koncentrując się na najważniejszych szczegółach, a następnie opiszemy nasz protokół wykorzystujący elektroporację in utero do badania funkcji genów w obrastaniu wypustek neuronalnych.
Protokół
Podstawowy protokół elektroporacji in utero został szczegółowo opisany w innym artykule JoVE z laboratorium Kriegsteina 1, 2. Technika ta została pierwotnie opisana w laboratorium Osumiego 3, a nasz protokół opiera się na metodzie opracowanej w laboratorium LoTurco 4. Przedstawimy przegląd naszego protokołu elektroporacji in utero embrionów szczura, koncentrując się na najważniejszych szczegółach, a następnie opiszemy nasz protokół wykorzystujący elektroporację in utero do badania funkcji genów w obrastaniu wypustek neuronalnych.
1. Elektroporacja in utero
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
In vitro badanie pierwotnych kultur neuronalnych pozwala na ilościową analizę wzrostu neurytów. Aby zbadać, w jaki sposób zmiany genetyczne wpływają na wzrost wypustek neuronalnych, konstrukty shRNA lub konstrukty do nadekspresji można wprowadzić do pierwotnych neuronów poprzez transfekcję chemiczną lub transdukcję wirusową. Jednak w przypadku pierwotnych komórek korowych metodami tymi transfekowana jest heterogenna pula typów komórek (neurony glutaminergiczne z różnych warstw, neurony hamujące, komórki glejowe).......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.
Podziękowania
Autorzy chcieliby podziękować Josephowi LoTurco i Dennisowi Selkoe za pomocne dyskusje na temat tej techniki. Autorzy dziękują darczyńcom American Health Assistance Foundation za wsparcie tych badań.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 10X roztwór Hanksa’ Zrównoważony roztwór soli (HBSS) (Ca+2 /Mg +2 bezpłatny | GIBCO, by Life Technologies | 14185-052 | |
| 10X roztwór Hanksa’ Zrównoważony roztwór soli (HBSS) (z Ca)+2 /Mg +2 ) | GIBCO, firmy Life Technologies | 14065-056 | |
| 1M HEPES pH 7,4 | GIBCO, by Life Technologies | 15630-080 | |
| szalki Petri 100 x 15 mm | Fisher Scientific | 08-757-12 | |
| szalki Petri 60 x 15 mm | BD Biosciences | 351007 | |
| probówka stożkowa 15 ml | Sarstedt Ltd | 62-547-205 | |
| probówka stożkowa 50 ml | Sarstedt Ltd | 62-554-205 | |
| Nożyczki | Fine Science Tools | 91402-12 | |
| Standardowe pęsety | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| Pinceta zakrzywiona | Fine Science Tools | 11273-20 | |
| Pinceta precyzyjna | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| nożyczki sprężynowe Vannasa | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| 0,25% trypsyny-EDTA | GIBCO, by Life Technologies | 25200 | |
| Hemacytometr Reichert Bright-Line | Hausser Scientific | 1490 | |
| Ręczny licznik impulsów | Sigma-Aldrich | Z169021 | |
| Dulbecco’podłoże DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | GIBCO, by Life Technologies | 11960-051 | |
| Płodowa surowica bydlęca | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| Penicylina-streptomycyna | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | |
| L-glutamina | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | |
| pożywka NEUROBASAL | GIBCO, by Life Technologies | 21103-049 | |
| Suplement bezsurowiczy B-27 | GIBCO, by Life Technologies | 17504-044 | |
| Suplement GlutaMAX -I | GIBCO, by Life Technologies | 35050-061 | |
| Roztwór odczynnika z gentamycyną | GIBCO, firmy Life Technologies | 15750-060 | |
| Paraformaldehyd | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| roztwór soli fosforanowo-buforowany | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Surowica osła | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| przeciwciało przeciwko beta-III tubulinie | Chemicon International | MAB1637 | |
| przeciwciało przeciwko MAP2 | Chemicon International | AB15452 | |
| anty-mysi przeciwciało osiołkowe Cy3 | Jackson ImmunoResearch | 715-166-151 | |
| Przeciwciało osiołkowe anty-kurze Cy2 | Jackson ImmunoResearch | 703-226-155 | |
| DAPI | GIBCO, by Life Technologies | D3571 | |
| Powlekane szkiełka dwukomorowe CC2 | Lab-Tek | 154852 | |
| Media montażowe do fluorescencji | KPL Inc | 71-00-16 | |
| szkiełka nakrywkowe 24 x 60 mm | VWR international | 48393-106 | |
| Bezbarwny lakier do paznokci | Nauki o mikroskopii elektronowej | 72180 | |
| Ketamina | Henry Schein | 995-2949 | |
| Ksylazyna | Henry Schein | 4015809TV | |
| buprenorfina | Henry Schein | 1118217 | |
| Picospritzer III | Parker Hannifin Corporation | ||
| elektroporator BTX z falą prostokątną | Fisher Scientific | BTXECM830 | |
| Tweezertrody, 7 mm, platynowe | Harvard Apparatus | 450488 |
Bibliografia
- Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. J Vis Exp. , (2007).
- Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E16 rat embryos. J Vis Exp
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
