W niniejszym materiale przedstawiamy metodę wewnątrzczaszkowej iniekcji wektorów AAV w celu fluorescencyjnego znakowania neuronów i gleju w korze wzrokowej.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wewnątrzczaszkowe wstrzykiwanie wektorów wirusowych opartych na wirusach adeno-zależnych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Wewnątrzczaszkowe wstrzykiwanie wektorów wirusowych zaprojektowanych do ekspresji białka fluorescencyjnego jest wszechstronną techniką znakowania służącą do wizualizacji specyficznych podzbiorów komórek w różnych obszarach mózgu, zarówno in vivo, jak i w przekrojach mózgowych. W przeciwieństwie do wstrzykiwania barwników fluorescencyjnych, znakowanie wirusowe umożliwia ukierunkowanie na poszczególne typy komórek i jest mniej kosztowne oraz mniej czasochłonne niż tworzenie transgenicznych linii myszy. W tej technice wektor wirusa towarzyszącego adenowirusom (AAV) jest wstrzykiwany wewnątrzczaszkowo z wykorzystaniem współrzędnych stereotaktycznych, mikropipety oraz pompy automatycznej, co pozwala na precyzyjne dostarczenie AAV do pożądanego obszaru przy minimalnym uszkodzeniu otaczającej tkanki. Parametry wstrzykiwania można dostosować do poszczególnych eksperymentów poprzez zmianę wieku zwierzęcia w momencie iniekcji, miejsca wstrzyknięcia, objętości wstrzykniętej dawki, szybkości podawania, serotypu AAV oraz promotora sterującego ekspresją genu. W zależności od wybranych warunków, indukowana wirusowo ekspresja transgenu może umożliwić wizualizację grup komórek, pojedynczych komórek lub drobnych wypustek komórkowych, aż do poziomu kolców dendrytycznych. Przedstawiony tutaj eksperyment obrazuje wstrzyknięcie dwuniciowego AAV wykazującego ekspresję zielonego białka fluorescencyjnego w celu znakowania neuronów i gleju w pierwotnej korze wzrokowej myszy.
Protokół
1. Obsługa i przechowywanie wirusa
- Odpowiednie techniki ochrony i obchodzenia się z materiałem należy dobrać na podstawie poziomu biosafety wirusa, który będzie wykorzystywany. Praktyki te opisano w publikacji Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 5th edition, dostępnej na stronie CDC
(http://www.cdc.gov/od/OHS/biosfty/bmbl5/bmbl5toc.htm). Wykorzystanie wektorów AAV jest zatwierdzone dla poziomu biosafety 1 (BSL-1). W eksperymencie przedstawionym w niniejszym materiale, podczas pracy z wirusem należy nosić fartuch laboratoryjny i rękawiczki, zgodnie z procedurami obchodzenia się z czynnikami BSL-1. - Aby zachować aktywność wirusa, najlepiej podzielić go na małe alikwoty, aby uniknąć wielokrotnego zamrażania i rozmrażania.
- Przygotuj komorę z laminarnym przepływem powietrza (BSC) klasy II do alikwotowania wirusa, usuwając z niej zbędne przedmioty i sterylizując powierzchnię 70% EtOH. Umieść w komorze zlewkę zawierającą 10% roztwór wybielacza do zbierania odpadów skażonych AAV. W BSC należy również umieścić sterylne probówki 0,5 mL oraz pojemnik z suchym lodem.
- Rozmroź zapas wirusa na lodzie poza komorą BSC.
- Wymieszaj wirusa w wirówce wortexowej i otwórz probówkę wewnątrz komory BSC.
- Pipetuj pożądaną objętość alikwotu (np. 5 μL) do probówki 0,5 mL, zamknij probówkę i umieść ją w suchym lodzie, aby gwałtownie zamrozić wirusa.
- Po rozdzieleniu całego wirusa na alikwoty, wyrzuć probówkę z wirusem oraz końcówki do pipet do pojemnika z odpadami zawierającego 10% wybielacz.
- Wyjmij pojemnik z odpadami z komory i dodaj dodatkowy 10% wybielacz, a następnie wylej roztwór do zlewu. Odpady plastikowe wyrzuć do pojemnika na odpady biologiczne zgodnie z instrukcjami oficera ds. biosafety w Twoim instytucie.
- Wyczyść wszelki sprzęt lub powierzchnie, które miały kontakt z wirusem, za pomocą 10% wybielacza. Usuń rękawiczki.
- Przechowuj alikwoty w zamrażarce -80°C.
2. Zabieg chirurgiczny
- Przykryj obszar zabiegowy chłonnym papierem laboratoryjnym. Narzędzia chirurgiczne powinny być wysterylizowane, a zabieg przeprowadzony w warunkach aseptycznych, zgodnie z wytycznymi Twojej instytucji dotyczącymi bezpieczeństwa biologicznego i wykorzystania zwierząt.
- Wybierz obszar przylegający do miejsca zabiegu, który zostanie przeznaczony do pobierania wirusa do mikropipet, i przykryj go chłonnym papierem laboratoryjnym. Umieść alikwot wirusa w pojemniku z lodem w tym obszarze i pozwól wirusowi rozmrozić się na lodzie w trakcie wykonywania zabiegu.
- W wyznaczonym obszarze do manipulacji z wirusem przygotuj pojemnik z odpadami zawierający 10% roztwór wybielacza do utylizacji końcówek pipet itp., które miały kontakt z wirusem.
- Wytnij szklaną mikropipetę Wiretrol tak, aby średnica końcówki wynosiła około 20 mikronów. Nanieś małą kroplę oleju mineralnego na tępy koniec mikropipety i włóż dostarczony do mikropipet tłok druciany.
- Zamocuj mikropipetę w zacisku ramienia mikropompy.
- Wstrzyknij myszy podskórnie buprenorfinę w dawce 0.5 mg/kg. Znieczul mysz Avertinem poprzez wstrzyknięcie domięśniowe w dawce 200 mg/kg i usuń sierść z górnej części głowy za pomocą nożyczek chirurgicznych, dbając o pozostawienie marginesów wystarczająco dużych, aby zapobiec przedostaniu się sierści do nacięcia.
- Przymocuj matę grzewczą do podstawy stereotaksy, aby utrzymać temperaturę ciała 37°C przez cały czas trwania zabiegu, a następnie unieruchom mysz w stereotaksie.
- Przemyj głowę trzykrotnie, naprzemiennie stosując etanol i betadynę, aby wysterylizować obszar.
- Nałóż kroplę maści do oczu Tobradex do każdego oka, aby utrzymać ich wilgotność podczas zabiegu.
- Wykonaj nacięcie wzdłuż linii środkowej głowy i odsun skórę, aby odsłonić czaszkę.
- Ostrożnie usuń powięź z czaszki za pomocą pęsety o cienkich końcówkach.
- Zlokalizuj miejsce wstrzyknięcia, korzystając z współrzędnych stereotaktycznych, i zaznacz czaszkę pisakiem chirurgicznym.
- Używając wiertarki stomatologicznej z wiertłem 1.4mm, zeszlifuj obszar czaszki o średnicy około 2mm, aż czaszka pęknie, dzieląc zeszlifowany obszar na kilka segmentów.
- Przez cały czas trwania tej procedury utrzymuj wilgotność czaszki, aplikując sterylną sól fizjologiczną.
- Wykonaj kraniotomię, delikatnie usuwając zeszlifowane fragmenty czaszki za pomocą pęsety o ekstra cienkich końcówkach.
3. Przygotowanie do wstrzyknięcia
- Przykrywając wieczko chusteczką KimWipe, otwórz probówkę z wirusem i naniosób 1,5µL (dla iniekcji 1µL) wirusa na mały fragment parafilmu.
- Wprowadź końcówkę mikropipety do roztworu wirusa i ręcznie odciągnij tłok. Jeśli wystąpią trudności z pobraniem roztworu wirusa do mikropipety, można delikatnie powiększyć otwór końcówki, przebijając chusteczkę KimWipe mikropipetą, aby odłupać niewielki fragment szkła.
- Opuść ramię mikropompy na tłok, aż z końcówki mikropipety zostanie wypchnięta niewielka ilość wirusa. Usuń tę małą kroplę za pomocą aplikatora z bawełnianym końcem i wyrzuć aplikator do pojemnika na odpady.
- Nanieś kroplę oleju mineralnego na końcówkę mikropipety, aby zapobiec zapchaniu się podczas wprowadzania mikropipety do mózgu.
4. Iniekcja wirusa
- Wykorzystując współrzędne stereotaktyczne X i Y, ustaw mikropipetę nad obszarem przeznaczonym do iniekcji. W tym eksperymencie współrzędne stereotaktyczne użyte do zlokalizowania pierwotnej kory wzrokowej to 2,7 mm w kierunku tylnym od bregmy i 2,5 mm bocznie od linii środkowej. Bardzo powoli opuść mikropipetę (z prędkością około 1 mm/1 minuta) do właściwej pozycji Z.
- Wprowadź żądane parametry iniekcji do sterownika mikropompy SYS Micro4 i rozpocznij wtryskiwanie. W tym eksperymencie jako tempo iniekcji zastosuje się 1 µL w ciągu 10 minut.
- Po zakończeniu iniekcji pozostaw pipetę na jedną do dwóch minut, aby zapobiec wypływowi wirusa podczas wycofywania. Po tym czasie bardzo powoli wyjmij mikropipetę z mózgu (z tą samą prędkością co powyżej).
- Zaszyj skórę głowy i zabezpiecz ją klejem tkankowym. Podaj zwierzęciu podskórnie buprenorfinę w dawce 0,1 mg/kg co 8-12 godzin przez kolejne 72 godziny lub dopóki zwierzę wykazuje oznaki bólu. Pozostaw zwierzę do regeneracji pod lampą grzewczą, aż zacznie się poruszać i będzie gotowe do powrotu do klatki. Eksperymenty obrazowe można rozpocząć po żądanym czasie inkubacji (od kilku dni do kilku tygodni po iniekcji wirusa).
5. Sprzątanie
- Opłucz mikropipetę 10% roztworem wybielacza, a następnie wyrzuć ją do pojemnika na odpady ostre.
- Zutylizuj pojemnik na odpady w ten sam sposób, co w Sekcji 1.
- Wyrzuć papier z blatu laboratoryjnego do pojemnika na odpady biologiczne i przetrzyj wszystkie powierzchnie oraz instrumenty, które mogły mieć kontakt z wirusem, 10% roztworem wybielacza.
- Niewykorzystany wirus może zostać ponownie zamrożony, pamiętając, że powtarzające się cykle zamrażania i rozmrażania powodują degradację wirusa.
6. Reprezentatywne wyniki
Rysunek 1. Przetransdukowany neuron po wstrzyknięciu dwuniciowego wirusa adeno-zależnego serotypu 1 (dsAAV S1) niosącego zielone białko fluorescencyjne (GFP) pod kontrolą promotora CMV. Ciało komórki oraz dendryty proksymalne i dystalne są wyraźnie widoczne w utrwalonych przekrojach obrazowanych za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego. Pasek skali = 100 μm.
Rycina 2. Znakowanie typowe dla wewnątrzczaszkowej iniekcji wirusa do pierwotnej kory wzrokowej z użyciem dsAAV S1, pokazujące zakres rozprzestrzeniania się wirusa oraz oznakowane neurony, glej i wypustki. Pasek skali = 250 μm.
Rycina 3. znakowanie komórek w hipokampie przy użyciu dsAAV S1. Pasek skali = 250 μm. Ryciny zostały zaadaptowane z Lowery et al. 20091
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Dostarczanie genów za pomocą wirusów niesie ogromny potencjał w badaniu procesów neurologicznych oraz leczeniu schorzeń mózgu1,2,3. Duża wszechstronność tej techniki może być również wykorzystana do fluorescencyjnego znakowania komórek w celu obrazowania zarówno in vitro, jak i in vivo4. W niniejszej pracy przedstawiamy szczegółową procedurę transdukcji neuronów i gleju w korze wzrokowej myszy przy użyciu dwuniciowego wirusa adeno-zależnego wykazującego ekspresję ulepszonego zielon...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Protokoły dotyczące zwierząt i eksperymentów zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Zasobów Zwierzęcych Uniwersytetu w Rochester (UCAR) zgodnie z polityką PHS w zakresie humanitarnych opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych.
Podziękowania
Niniejsza praca była możliwa dzięki grantom z NIH (EY012977), nagrodzie Career Award in the Biomedical Sciences z funduszu Burroughs Wellcome Fund, fundacji Whitehall oraz fundacji Sloan (A.K.M.).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Adapter do unieruchamiania myszy i szczurów noworodkowych St–lting | Stoelting Co. | 51625 | Można zastąpić standardowym przyrządem stereotaktycznym do unieruchamiania zwierząt podczas operacji |
| Nożyczki Bonn ekstra precyzyjne, 8,5 cm, końcówka prosta, krawędź tnąca 13 mm | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Kleszczyki do opatrunków oka, 10 cm, szerokość końcówki 0,5 mm, zakrzywione | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Pinceta Dumont #5/45- standardowa końcówka Dumoxel, 11 cm, pod kątem | Fine Science Tools | 11251-35 | Pinceta z ekstra precyzyjną końcówką do wykonywania kraniotomii |
| Pinceta o standardowym wzorze, prosta, końcówka 2,5 mm x 1,35 mm, 12 cm | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| Sterownik Microtorque i końcówka Tech2000 | Ram Products, Inc. | TECH2000ON/OFF | Wiertarka stomatologiczna |
| Wiertła ze stali nierdzewnej do mikrotrepanacji, średnica końcówki 1,4 mm | Fine Science Tools | 19008-14 | |
| Mikropipety Wiretrol, do dozowania 1-5 µL | VWR international | 5-000-1001 lub 53480-287 | |
| Olej mineralny | VWR international | 29447-338 | |
| Ręczny mikromanipulator i podstawa z regulacją nachylenia (praworęczny) | World Precision Instruments, Inc. | M3301-M3-R | Używany do wyznaczania współrzędnych stereotaktycznych |
| UltraMicroPump (UMP3) (sztuka) z kontrolerem SYS-Micro4 | World Precision Instruments, Inc. | UMP3-1 | |
| Szycie chirurgiczne | VWR international | 95056-952 | |
| Wytciągacz mikropipet P-97 Flaming/Brown | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Tobradex | Dostępny w weterynaryjnych służbach pomocniczych danej instytucji’ |
Bibliografia
- Kaplitt, M. G., Leone, P., Samulski, R. J., Xiao, X., Pfaff, D. W., O'Malley, K. L., During, M. J. Long-term gene expression and phenotypic correction using adeno-associated virus vectors in the mammalian brain. Nat Genet. 8, 148-154 (1994).
- Harding, T. C., Dickinson, P. J., Roberts, B. N., Yendluri, S., Gonzalez-Edick, M., Lecouteur, R. A., Jooss, K. U. Enhanced gene transfer efficiency in the murine striatum and an orthotopic glioblastoma tumor model, using AAV-7- and AAV-8-pseudotyped vectors. Hum Gene Ther. 17, 807-820 (2006).
- Lo, W. D., Qu, G., Sferra, T. J., Clark, R., Chen, R., Johnson, P. R. Adeno-associated virus-mediated gene transfer to the brain: duration and modulation of expression. Hum Gene Ther. 10, 201-213 (1999).
- Lowery, R. L., Zhang, Y., Kelly, E. A., Lamantia, C. E., Harvey, B. K., Majewska, A. K. Rapid long-term labeling of cells in the developing and adult rodent visual cortex using double-stranded adeno-associated viral vectors. Dev Neurobiol. 69, 674-688 (2009).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
