Wykrywanie aktywności sialidazy Neu1 w regulacji aktywacji receptorów Toll-podobnych

Podsumowanie

Test sialidazy to proste podejście techniczne, które pozwoli wyjaśnić nowe mechanizmy molekularne receptorów TLR w odpowiedzi na infekcje mikrobiologiczne oraz ich udział w chorobach zapalnych na poziomie receptorów na powierzchni komórek żywych makrofagów.

Streszczenie

Ssacze receptory Toll-podobne (TLRs) to rodzina receptorów rozpoznających wzorce molekularne związane z patogenami. TLRs są nie tylko kluczowymi sensorami infekcji drobnoustrojowych (np. wirusowych, bakteryjnych i pasożytniczych), ale odgrywają również istotną rolę w patofizjologii chorób zakaźnych, zapalnych, a być może także autoimmunologicznych. W związku z tym intensywność i czas trwania odpowiedzi TLR przeciwko chorobom zakaźnym muszą być ściśle kontrolowane. Wynika z tego, że zrozumienie integralności strukturalnej receptorów sensorowych, ich oddziaływań z ligandami oraz komponentów sygnałowych jest niezbędne dla późniejszej ochrony immunologicznej. Mogłoby to również stworzyć istotne możliwości modyfikacji chorób poprzez manipulację sensorami. Chociaż szlaki sygnałowe sensorów TLR są dobrze scharakteryzowane, parametry kontrolujące oddziaływania między sensorami a ich ligandami wciąż pozostają słabo zdefiniowane. Niedawno zidentyfikowaliśmy nowy mechanizm aktywacji TLR przez jego naturalny ligand, który nie był wcześniej obserwowany ^1,2. Sugeruje on, że indukowana ligandem aktywacja TLR jest ściśle kontrolowana przez aktywację sialidazy Neu1. Zgłosiliśmy również, że Neu1 ściśle reguluje receptory neurotrofinowe, takie jak TrkA i TrkB ³, co wiąże się z interakcją (cross-talk) między Neu1 a metaloproteinazą macierzy-9 (MMP-9) w kompleksie z receptorami ⁴. Test sialidazy został początkowo wykorzystany do znalezienia nowego liganda, tymochinonu, w aktywacji sialidazy Neu4 na powierzchni komórek makrofagów, komórek dendrytycznych i fibroblastów poprzez białka GPCR Gαi oraz MMP-9 ⁵. W przypadku receptorów TLR nasze dane wskazują, że sialidaza Neu1 znajduje się już w kompleksie z receptorami TLR-2, -3 i -4 i jest indukowana po związaniu liganda z którymkolwiek z tych receptorów. Aktywowana sialidaza Neu1 hydrolizuje reszty sjalilo α-2,3-związane β-galaktozylowe, oddalone od miejsca wiązania liganda, aby usunąć przeszkodę steryczną dla dimeryzacji TLR-4, rekrutacji kompleksu MyD88/TLR4, aktywacji NFkB oraz prozapalnych odpowiedzi komórkowych. W raporcie z badań kolaboracyjnych wykazano, że sialidaza Neu1 reguluje fagocytozę w komórkach makrofagów ⁶. Podsumowując, test sialidazy dostarczył nam cennych informacji na temat molekularnych mechanizmów indukowanej ligandem aktywacji receptorów. Chociaż dokładna relacja między sialidazą Neu1 a aktywacją TLR i receptorów Trk nie została jeszcze w pełni wyjaśniona, stanowiłaby ona nowe lub pionierskie podejście do szlaków regulacji komórkowej.

Protokół

1. Reanimacja zamrożonych makrofagów

1. Przed rozmrożeniem zamrożonych komórek z zamrażarki -80°C należy przygotować pożywkę hodowlaną, wykorzystując sterylnie filtrowaną pożywkę DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) uzupełnioną o 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) oraz 5 μg/mL plasmocyny. Plasmocyna jest roztworem antybiotyku stosowanym w naszych badaniach w celu eliminacji i zapobiegania kontaminacji kultur komórkowych mycoplasma.
2. Dla jednej fiolki zamrożonych komórek dodaje się 4 mL pożywki hodowlanej do kolby hodowlanej o powierzchni 25 cm² w sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza.
3. Po wyjęciu fiolki z zamrożonymi komórkami z zamrażarki -80°C, są one szybko rozmrażane poprzez ogrzewanie w dłoniach w sterylnej komorze, co zajmuje około 2-3 min.
4. Niezwłocznie po rozmrożeniu komórki są szybko przenoszone do kolby zawierającej pożywkę za pomocą sterylnej pipety 1 mL.
5. Kolba z komórkami zostaje umieszczona w inkubatorze do hodowli tkankowej w temperaturze 37°C i przy 5% CO₂.
6. Wzrost i adhezja komórek są sprawdzane codziennie przy użyciu mikroskopu odwróconego, aż do osiągnięcia konfluencji na poziomie od 75% do 90%.
7. Podczas inkubacji hodowli komórkowej, okrągłe szkiełka przedmiotowe o średnicy 12 mm są sterylizowane poprzez zanurzenie ich w 70% etanolu w dużej szklanej szalce Petriego na 1 h w komorze z laminarnym przepływem powietrza; następnie alkohol jest usuwany i przechowywany do ponownego użycia, a wilgotne szkiełka są pozostawione pod działaniem sterylnie filtrowanego strumienia powietrza w komorze pod lampą UV przez 24 h lub do całkowitego wyschnięcia.

2. Wysiewanie komórek do testu sialidazy

1. Przed wysianiem komórek, pojedyncze sterylną okrągłe szkiełko przedmiotowe umieszcza się ostrożnie w jednym dołku 24-dołkowej płytki BD Falcon z płaskim dnem i pokrywką, wykonanej z polistyrenu do hodowli tkankowych, używając do tego sterylizowanej przez opalanie, pełnej, zakrzywionej, 4-calowej ząbkowanej pęsety ze stali nierdzewnej. W przypadku jednej kolby komórek przy 75% konfluencji, zazwyczaj wykorzystuje się 12 dołków płytki hodowlanej.
2. W przypadku adherentnych komórek makrofagów, warunkowane podłoże DMEM usuwa się z kolby za pomocą sterylnej pipety 5 mL w sterylnej komorze laminarnej. Adherentne komórki przemywa się raz 1x sterylnym roztworem soli w buforze Tris o pH 7.4, aby usunąć wszelkie pozostałości podłoża zawierającego surowicę, a następnie dodaje się 1 mL fosforanowego roztworu buforowanego (PBS) bez wapnia i magnezu (CMF) o pH 7.4, w ilości wystarczającej do przykrycia komórek. Komórki umieszcza się w inkubatorze w temperaturze 37°C na około 10 min lub do momentu, aż komórki zaczną odrywać się od ścianek kolby. Kolbę można delikatnie kołysać lub potrząsać, aby poluzować pozostałe adherentne komórki.
3. Do 1 mL zawiesiny komórek w kolbie dodaje się 3 mL warunkowanego podłoża DMEM. Pobiera się 0.5 mL zawiesiny komórek i sterylnie przenosi do płytki do hodowli tkankowej zawierającej 12-milimetrowe okrągłe szkiełka przedmiotowe. Na okrągłe szkiełka przenosi się około 0.5 x 10⁶ komórek.
4. Płytkę do hodowli tkankowej z komórkami inkubuje się w temperaturze 37°C w 5% CO₂ przez 24 h, aby umożliwić adhezję komórek do okrągłych szkiełek przedmiotowych.

3. Analiza aktywności sialidazy

1. Przygotowanie kontroli

1. Umieścić szkiełko przedmiotowe (matowe: 1 koniec, 1 szkiełko, 25 x 75 x 1 mm) w komorze ochronnej lub na blacie laboratoryjnym i dodać, mieszając w następującej kolejności, poniższe związki: 1 μL DAKO + 1 μL 4-MUNANA oraz na koniec + 3 μL soli buforowanej triss pH 7.4 (TBS).
2. Po usunięciu medium z jednej studni zawierającej komórki, delikatnie przesunąć okrągłe szkiełko za pomocą 4-calowej pęsety do narożnika studni. Ostrożnie wyjąć szkiełko pęsetą i położyć je komórkami skierowanymi do dołu na roztwór mieszaniny znajdujący się na szkiełku przedmiotowym.
3. Natychmiast przenieść szkiełko przedmiotowe do mikroskopu epifluorescencyjnego, który został ustawiony na filtr UV i jest wyposażony w kamerę cyfrową do rejestracji obrazów fluorescencyjnych.
4. Ustawić ostrość mikroskopu w kontraście fazowym, aż do momentu widoczności komórek, a następnie przełączyć na tryb fluorescencji. Wykonać zdjęcia komórek w fluorescencji w 1 min, 2 min i 3 min. Wykonać pojedyncze zdjęcie komórek w kontraście fazowym.

2. Przygotowanie testu pozytywnego

1. Nanieś następujące związki w podanej kolejności na inny szkiełko przedmiotowe: 1 μL DAKO + 1 μL 4-MUNANA + 2 μL LPS + 1 μL TBS.
2. Powtórz kroki od 3.1.2 do 3.1.4 opisane powyżej.

3. Przygotowanie testu pozytywnego wraz z inhibitorem neuraminidazy Tamiflu

1. Nanieś następujące związki w podanej kolejności na kolejny szkiełko przedmiotowe: 1μL DAKO + 1μL 4-MUNANA + 2 μL LPS + 1 μL Tamiflu.
2. Stężenia Tamiflu zostały wcześniej przygotowane w 1x buforze Tris-NaCl pH 7.4; końcowe stężenie związków w kontakcie z żywymi komórkami na okrągłym szkiełku przedmiotowym będzie miało czynnik rozcieńczenia równy 5.
3. Powtórz kroki od 3.1.2 do 3.1.4 opisane powyżej.

4. Wyznaczenie stężenia inhibitora niezbędnego do zahamowania 50% aktywności sialidazy (IC₅₀)

1. Aby określić ilość fluorescencji wokół komórek, obrazy analizuje się za pomocą programu ImageJ 1.38x z wtyczką analyze do pomiaru RBG. Wykonuje się 50 pomiarów w losowych punktach fluorescencji otaczającej komórki, a następnie oblicza średnią całkowitej fluorescencji.
2. Wartość IC₅₀ wyznacza się na podstawie wykresu, w którym na osi x naniesiono stężenie inhibitora przekształcone na jednostki logarytmiczne (np. log ng/mL), a na osi y średnią fluorescencję, stosując regresję nieliniową.

5. Klucze do sukcesu

1. Upewnij się, że hodowane komórki są wolne od zanieczyszczeń mycoplasma. W celu kontroli tego parametru rutynowo stosujemy Plasmocin w pożywce hodowlanej.
2. Sztuczny substrat neuraminidazy, 4-MUNANA, należy stosować świeżo przygotowany. Przygotowany substrat może być wykorzystany do testu sialidazy w ciągu tygodnia.
3. Jeśli linia komórkowa wykazuje niską ekspresję receptorów na powierzchni komórek, do stymulacji można zastosować wyższą dawkę ligandu.
4. Zaobserwowaliśmy również, że komórki poddane więcej niż 6 pasażom mogą utracić swój fenotyp receptorowy. Należy hodować świeżo rozmrożone komórki.

6. Reprezentatywne wyniki

Animowany protokół testu sialidazy wraz z reprezentatywnymi wynikami znajduje się w załączonym pliku Powerpoint.

Dyskusja

Wykorzystując nowo opracowany test do wykrywania aktywności sialidazy w żywych komórkach makrofagów ², zastosowaliśmy tę technologię do wykrycia aktywności sialidazy indukowanej ligandem w żywych komórkach makrofagów BMC-2 w sposób zależny od dawki, a także w żywych komórkach dendrytycznych DC-2.4, HEK-TLR4/MD2, HEK293, komórkach gruczolakoraka piersi SP1 oraz ludzkich komórkach fibroblastów typu dzikiego (WT) i z sjalidozą typu I (1140F01 i WG0544). Inhibitory neuraminidazy, takie jak Tamiflu (fosforan oselta...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
DMEM	GIBCO, by Life Technologies
4-MUNANA	Biosynth International, Inc
Płodowe serum cielęce	Hyclone
DakoCytomation, Fluorescencyjne medium do montowania	Dako	S3023	15 mL
Tamiflu (fosforan oseltamiwiru)	Hoffmann-La Roche AG