Test sialidazy to proste podejście techniczne, które pozwoli wyjaśnić nowe mechanizmy molekularne receptorów TLR w odpowiedzi na infekcje mikrobiologiczne oraz ich udział w chorobach zapalnych na poziomie receptorów na powierzchni komórek żywych makrofagów.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wykrywanie aktywności sialidazy Neu1 w regulacji aktywacji receptorów Toll-podobnych
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Ssacze receptory Toll-podobne (TLRs) to rodzina receptorów rozpoznających wzorce molekularne związane z patogenami. TLRs są nie tylko kluczowymi sensorami infekcji drobnoustrojowych (np. wirusowych, bakteryjnych i pasożytniczych), ale odgrywają również istotną rolę w patofizjologii chorób zakaźnych, zapalnych, a być może także autoimmunologicznych. W związku z tym intensywność i czas trwania odpowiedzi TLR przeciwko chorobom zakaźnym muszą być ściśle kontrolowane. Wynika z tego, że zrozumienie integralności strukturalnej receptorów sensorowych, ich oddziaływań z ligandami oraz komponentów sygnałowych jest niezbędne dla późniejszej ochrony immunologicznej. Mogłoby to również stworzyć istotne możliwości modyfikacji chorób poprzez manipulację sensorami. Chociaż szlaki sygnałowe sensorów TLR są dobrze scharakteryzowane, parametry kontrolujące oddziaływania między sensorami a ich ligandami wciąż pozostają słabo zdefiniowane. Niedawno zidentyfikowaliśmy nowy mechanizm aktywacji TLR przez jego naturalny ligand, który nie był wcześniej obserwowany 1,2. Sugeruje on, że indukowana ligandem aktywacja TLR jest ściśle kontrolowana przez aktywację sialidazy Neu1. Zgłosiliśmy również, że Neu1 ściśle reguluje receptory neurotrofinowe, takie jak TrkA i TrkB 3, co wiąże się z interakcją (cross-talk) między Neu1 a metaloproteinazą macierzy-9 (MMP-9) w kompleksie z receptorami 4. Test sialidazy został początkowo wykorzystany do znalezienia nowego liganda, tymochinonu, w aktywacji sialidazy Neu4 na powierzchni komórek makrofagów, komórek dendrytycznych i fibroblastów poprzez białka GPCR Gαi oraz MMP-9 5. W przypadku receptorów TLR nasze dane wskazują, że sialidaza Neu1 znajduje się już w kompleksie z receptorami TLR-2, -3 i -4 i jest indukowana po związaniu liganda z którymkolwiek z tych receptorów. Aktywowana sialidaza Neu1 hydrolizuje reszty sjalilo α-2,3-związane β-galaktozylowe, oddalone od miejsca wiązania liganda, aby usunąć przeszkodę steryczną dla dimeryzacji TLR-4, rekrutacji kompleksu MyD88/TLR4, aktywacji NFkB oraz prozapalnych odpowiedzi komórkowych. W raporcie z badań kolaboracyjnych wykazano, że sialidaza Neu1 reguluje fagocytozę w komórkach makrofagów 6. Podsumowując, test sialidazy dostarczył nam cennych informacji na temat molekularnych mechanizmów indukowanej ligandem aktywacji receptorów. Chociaż dokładna relacja między sialidazą Neu1 a aktywacją TLR i receptorów Trk nie została jeszcze w pełni wyjaśniona, stanowiłaby ona nowe lub pionierskie podejście do szlaków regulacji komórkowej.
Protokół
1. Reanimacja zamrożonych makrofagów
- Przed rozmrożeniem zamrożonych komórek z zamrażarki -80°C należy przygotować pożywkę hodowlaną, wykorzystując sterylnie filtrowaną pożywkę DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) uzupełnioną o 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) oraz 5 μg/mL plasmocyny. Plasmocyna jest roztworem antybiotyku stosowanym w naszych badaniach w celu eliminacji i zapobiegania kontaminacji kultur komórkowych mycoplasma.
- Dla jednej fiolki zamrożonych komórek dodaje się 4 mL pożywki hodowlanej do kolby hodowlanej o powierzchni 25 cm2 w sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza.
- Po wyjęciu fiolki z zamroż....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Wykorzystując nowo opracowany test do wykrywania aktywności sialidazy w żywych komórkach makrofagów 2, zastosowaliśmy tę technologię do wykrycia aktywności sialidazy indukowanej ligandem w żywych komórkach makrofagów BMC-2 w sposób zależny od dawki, a także w żywych komórkach dendrytycznych DC-2.4, HEK-TLR4/MD2, HEK293, komórkach gruczolakoraka piersi SP1 oraz ludzkich komórkach fibroblastów typu dzikiego (WT) i z sjalidozą typu I (1140F01 i WG0544). Inhibitory neuraminidazy, takie jak Tamiflu (fosforan oselta.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
S.R.A. i P.J. przyczynili się w równym stopniu jako pierwsi autorzy.
Podziękowania
Częściowe wsparcie grantowe dla MRS pochodzi z Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC), Harry Botterell Foundation for Neuroscience Research, ARC oraz Garfield Kelly Cardiovascular Research and Development Fund. S.R.A. jest laureatem Queen's University Research Award oraz Robert J. Wilson Fellowship. P.J. jest laureatem Queen's Graduate Award oraz Robert J. Wilson Fellowship. A.G. i S.A. są laureatami Queen's Graduate Award. S.F. był laureatem Ontario Graduate Scholarship in Science and Technology (OGSST). A.G. jest laureatem Queen's Franklin Bracken Graduate Scholarship. S.A. jest laureatem Queen's R.S. McLaughlin Graduate Scholarship.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| DMEM | GIBCO, by Life Technologies | ||
| 4-MUNANA | Biosynth International, Inc | ||
| Płodowe serum cielęce | Hyclone | ||
| DakoCytomation, Fluorescencyjne medium do montowania | Dako | S3023 | 15 mL |
| Tamiflu (fosforan oseltamiwiru) | Hoffmann-La Roche AG |
Bibliografia
- Amith, S. R. Neu1 desialylation of sialyl alpha-2,3-linked beta-galactosyl residues of TOLL-like receptor 4 is essential for receptor activation and cellular signaling. Cell Signal. 22, 314-324 (2010).
- Amith, S. R.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
