Komary z gatunku Anopheles stephensi są wektorami malarii zamieszkującymi Indie oraz cały obszar Azji. Niniejszy film demonstruje technikę wykonywania mikroiniekcji u tego gatunku z wykorzystaniem transgenów, które nadadzą komarowi odporność na malarię. Większość metodologii przedstawionej w tym filmie ma zastosowanie w technikach mikroiniekcji u innych gatunków komarów.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Iniekcja embrionów An. stephensi w celu wytworzenia komarów odpornych na malarię
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Wprowadzanie egzogennych genów do genomów komarów wymaga zastosowania technik mikroiniekcyjnych dostosowanych do konkretnego gatunku. Niniejszy protokół wideo demonstruje metodę stosowaną w laboratorium Jamesa do mikroiniekcji konstruktów DNA do embrionów Anopheles stephensi w celu generowania przekształconych komarów. Przedstawiono techniki przygotowania igieł do mikroiniekcji, pobierania i przygotowania embrionów oraz przeprowadzania mikroiniekcji.
Protokół
Przygotowania przed mikroiniekcją:
- Karmienie komarów krwią: w celu przeprowadzenia iniekcji od poniedziałku do środy, nakarm samice w poprzedni piątek. Aby przeprowadzić iniekcje w czwartek i piątek, nakarm samice w poniedziałek tego samego tygodnia.
- Przygotuj igły kwarcowe, korzystając z programu 2 oraz buforu izotonicznego (patrz Materiały).
- „Probówka do składania jaj” dla embrionów to standardowa probówka do hodowli Drosophila. Na dnie powinna znajdować się zwilżona wata szklana przykryta mokrym dyskiem papieru filtracyjnego.
- Przygotuj plastikową szkiełko nakrywkę, przyklejając dwustronną taś....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze | |
|---|---|---|---|---|
| Kwarcowe igły do iniekcji | Sutter Instrument Co. | Przygotowuje się kapilary o średnicy zewnętrznej (O.D.) 1,0 mm, średnicy wewnętrznej (I.D.) 0,70 mm i długości 10 cm, wyciągając rurkę kapilarną za pomocą mikro-wyciągacza (micropipette puller) do uzyskania końcówki o średnicy 3–8 µm z trzonem o długości około 100–300 mm. | ||
| Wciągacz kwarcu | Narzędzie | Sutter Instrument Co. | P-2000 | Konfiguracja: Heat-275, Fil-3, Vel-38, Del-250, Pull-141 |
| zestaw do izolacji plazmidów EndoFree | Qiagen | |||
| Izopropanol | ||||
| kolumna Millex-GV | SLGV RO4 NL | do oczyszczania DNA | ||
| Konstrukt DNA | 0,5 mg/ml | |||
| Plazmid pomocniczy | 0,3 mg/ml | |||
| Roztwór do wstrzykiwań | Bufor | roztwór 1x: 5 mM KCl, 0,1 mM fosforanu sodu, pH 6,8 | ||
| Bufor izotoniczny | patrz na recepturę w sekcji protokołu | |||
| Olej do desykacji | Olej halokarbonowy 700:olej halokarbonowy 27 (1:1). Wymieszać dokładnie. Przygotować przed mikroiniekcją. | |||
| Krew | do karmienia komarów | |||
| *Anopheles stephensi* | Zwierzę | Komary, samce i samice. | ||
| Fiolka do hodowli Drosophila | do składania jaj | |||
| szalki Petriego | z buforem izotonicznym, do wykluwania zarodków | |||
| Precyzyjny pędzelek | Sable # 0000 | |||
| papier Whatmana 3 mm | ||||
| Pinceta nr 5 | ||||
| taśma dwustronna | ||||
| Mikroladowarka | Eppendorf | 5242 956.003 | ||
| Transjektor | Eppendorf | |||
| Mikroskop | Leica Microsystems | z ruchomym stolikiem i mikromanipulatorem, ustawionym przy 10-krotnym powiększeniu |
Przedruki i uprawnienia
