$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Przygotowania przed mikroiniekcją:
- Karmienie komarów krwią: w celu przeprowadzenia iniekcji od poniedziałku do środy, nakarm samice w poprzedni piątek. Aby przeprowadzić iniekcje w czwartek i piątek, nakarm samice w poniedziałek tego samego tygodnia.
- Przygotuj igły kwarcowe, korzystając z programu 2 oraz buforu izotonicznego (patrz Materiały).
- „Probówka do składania jaj” dla embrionów to standardowa probówka do hodowli Drosophila. Na dnie powinna znajdować się zwilżona wata szklana przykryta mokrym dyskiem papieru filtracyjnego.
- Przygotuj plastikową szkiełko nakrywkę, przyklejając dwustronną taśmę do jednego z końców. Przytnij taśmę do rozmiaru szkiełka tak, aby kończyła się na jego krawędzi.
- Przygotuj olej do desykacji.
- Przygotuj szalkę Petriego z buforem izotonicznym do przeniesienia embrionów w celu ich wyklucia.
Przygotowanie do wymuszania niesienia jaj:
- Zebrać 6-10 samic po karmieniu krwią za pomocą aspiratora i przenieść je do fiolki hodowlanej Drosophila z watą i papierem filtracyjnym zwilżonym buforem izotonicznym.
- Komary zostają następnie umieszczone w warunkach insektarium w ciemności, gdzie pozostawia się je na 1 h i 15 min w celu złożenia jaj.
- Pozwolić dorosłym osobnikom wlecieć do klatki i wyjąć dysk z papieru filtracyjnego z embrionami.
- Ustawianie jaj należy przeprowadzić pod stereomikroskopem. Zbierać skupiska jaj za pomocą cienkiego pędzla (sobolowy, nr 0000) i przenosić je na przygotowany kwadrat papieru Whatman 3MM nasączony buforem izotonicznym. Papier musi być przez cały czas wilgotny. Nie dopuszczać do wyschnięcia jaj. Usunąć egzochoryon pędzlem, co ułatwia przyleganie jaj do taśmy.
- Używając precyzyjnej pęsety nr 5 lub cienkiego pędzla, wybrać ciemnoszare embriony i ułożyć je w linii na kwadracie papieru Whatman 3MM zwilżonym buforem izotonicznym. Ułożyć od 20-30 embrionów. Wszystkie embriony muszą być w tej samej orientacji, ponieważ wstrzyknięcie ma nastąpić na biegunie tylnym. Przedni koniec embrionów jest nieco szerszy niż tylny. Następnie, używając pasków papieru Whatman 3MM, osuszyć filtr, na którym ułożone są jaja, mocno dociskając papier po obu stronach linii jaj, nie dotykając samych jaj.
- Aby przenieść jaja, odwrócić szkiełko zawierające dwustronną taśmę klejącą (Medicine) i delikatnie docisnąć do jaj. Tylny koniec jaj musi znajdować się bardzo blisko krawędzi taśmy dwustronnej. Wilgotność papieru jest w tym procesie krytyczna; jeśli będzie on zbyt mokry, jaja nie przylgną. Przeprowadzam wysuszanie embrionów przez 5-10 sekund, jednak czas wysuszania zależy od wilgotności i temperatury w pomieszczeniu do mikrowstrzyknięć.
- Wysuszanie jest kluczowe dla jaj: zbyt długi proces spowoduje, że embriony nie wyklują się. Bez wysuszenia DNA nie dostanie się do wnętrza embrionu.
- Przykryć wysuszone embriony olejem halokarbonowym, aby zapobiec dalszemu wysychaniu.
Mikroiniekcja zarodków:
Najważniejszym aspektem prawidłowego wstrzykiwania jest jakość igły (patrz Uwaga).
- Za pomocą mikroładownika (Eppendorf #5242 956.003) napełnij igłę roztworem DNA przeznaczonym do wstrzyknięcia. Wymagana jest bardzo mała ilość roztworu do iniekcji, od 1 do 2 ml.
- Podłącz igłę do urządzenia Eppendorf Transjector, które kontroluje czas i ciśnienie wtrysku, a także ciśnienie zwrotne. Mikroiniekcję wykonuje się przy użyciu mikromanipulatora (Leica) oraz mikroskopu z ruchomym stolikiem (Leica) przy powiększeniu x 10. W razie potrzeby można przygotować podwyższenie stolika mikroskopu, układając 4-5 szkiełek przedmiotowych. Umieść szkiełko nakrywowe z embrionami na podwyższonym stoliku. Iniekcję embrionów wykonuje się pod kątem 150°; nakłucie powinno nastąpić w biegunie tylnym. Podczas wtryskiwania utrzymuję igłę w miejscu i poruszam stolikiem mikroskopu. W przypadku nowej igły końcówka jest zamknięta i zazwyczaj pęka podczas pierwszej iniekcji. Przed każdym wtryskiem zawsze sprawdzam ciśnienie niezbędne do wypchnięcia małej kropli DNA do oleju.
- W przypadku nowej igły ustawiam czas wtrysku na 0,2 - 0,9 sec oraz ciśnienie 1000 hPa. Zmieniam ciśnienie i czas do momentu pojawienia się małej kropli wypływającej z igły do oleju. Ciśnienie zwrotne należy ustawić na około 100. W miarę zużywania się końcówki igły należy zmniejszać ciśnienie wtrysku, aby utrzymać niską objętość iniekcji (około 300 hPa). Po tym etapie otwór w końcówce igły staje się zbyt duży, co prowadzi do śmierci większości embrionów.
- Po iniekcji usuń olej za pomocą papierowego ręcznika, przykryj szkiełko z embrionami i umieść je w szalce Petriego z buforem izotonicznym. Umieść szalki w insektarium i pozostaw je tam do momentu wyklucia embrionów. Wyklucie rozpoczyna się po 2-6 dniach. Przenieś larwy do wody destylowanej ze szczyptą mielonego pokarmu dla ryb.
Uwagi
DNA do wstrzykiwania: Roztwór plazmidowego DNA do wstrzykiwania wyizolowano za pomocą zestawu EndoFree plasmid kit. Plazmid konstrukcyjny oraz plazmid pomocniczy zmieszano w odpowiednim stężeniu, a następnie wytrącono izopropanolem. Osad przemyto 70% etanolem przed ponownym zawieszeniem w buforze do wstrzykiwania. Przed wstrzyknięciem DNA oczyszczono za pomocą kolumny Millex-GV.
Bufor izotoniczny:
1.68 M NaCl - 88.3 ml
1.68 M NaCl - 2.9 m
1 M Hepes -10.7 ml
1.12 M CaCl2 - 2.2 ml
dH2O - 896 ml | LUB | 5 M NaCl - 29.67 ml
1 M KCl - 4.87 ml
1 M Hepes - 10.7 ml
1.12 M CaCl2 - 2.2 ml
dH2O - 952.56 ml |
Dostosować pH do 7.2