W niniejszym opracowaniu przedstawiamy protokół montowania barwionych zarodków Drosophila w pozycji pionowej, co umożliwia obrazowanie przekrojów poprzecznych z wykorzystaniem mikroskopii konfokalnej.
Artykuł metodologiczny
Obrazowanie w układzie pionowym embrionów Drosophila
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Wzdłuż osi grzbietowo-brzusznej występuje kilka dobrze znanych gradientów morfogenetycznych oraz ruchów komórkowych w obrębieDrosophilazarodka. Jednakże obecnie stosowane techniki obrazowania takich procesów są w pewnym stopniu ograniczone. Poniższy protokół opisuje nową technikę montowania utrwalonych i znakowanychDrosophilazarodki do obrazowania w płaszczyźnie czołowej przy użyciu mikroskopii konfokalnej. Metoda ta polega na zatopieniu zarodków pomiędzy dwiema warstwami medium montażowego z galaretki glicerynowej i obrazowaniu pionowo ustawionych pasków galaretki. Pierwszym krokiem przygotowania takiej „kanapki” z zarodkami jest nałożenie cienkiej warstwy galaretki glicerynowej na szkiełko podstawowe. Następnie zarodki są ostrożnie ustawiane na tej powierzchni i przykrywane drugą warstwą galaretki. Po zestaleniu się drugiej warstwy wycina się paski galaretki i ustawia je pionowo do obrazowania. W zależności od rodzaju używanego statywu mikroskopu opisano alternatywne sposoby wizualizacji zarodków. Ponieważ wszystkie komórki wzdłuż osi grzbietowo-brzusznej są obrazowane w jednej płaszczyźnie Z mikroskopu konfokalnego, nasza metoda umożliwia precyzyjny pomiar i porównanie sygnałów fluorescencyjnych bez fotobielenia lub rozpraszania światła, które są powszechne w rekonstrukcjach 3D zarodków zamontowanych podłużnie.
Protokół
1. Metodyka obrazowania
- Rozpuść galaretkę glicerynową w kąpieli wodnej o temperaturze 55° C przez 20-30 minut, aż stanie się jednorodnym płynem. Delikatnie zakręć butelką, ale nie wstrząsaj nią, aby uniknąć powstawania pęcherzyków powietrza.
- Podczas rozpuszczania galaretki nanieś cienką warstwę glicerolu na czyste szkiełko przedmiotowe za pomocą chusteczki Kimwipe (opcjonalnie).
- Nanieś 1 do 1,5 mL rozpuszczonej galaretki glicerynowej za pomocą przyciętej końcówki pipety P1000 na powierzchnię szkiełka, aby utworzyć cienką pierwszą warstwę. Pipetuj ostrożnie, aby uniknąć pęcherzyków.
- Pozostaw galaretkę do stężenia przez 5 min na poziomej powierzchni, następnie umieść szkiełko w temperaturze -20°C na 5 min i przystąp do ustawiania zarodków. Alternatywnie, przykryj szkiełko folią Saran Wrap i przechowuj w temperaturze 4°C do 5 dni.
- Nanieś małą kroplę zabarwionych zarodków w 70% glicerolu/PBS lub innym glicerolowym medium montażowym zapobiegającym zanikaniu fluorescencji (np. Slowfade lub Vectashield) obok podłoża z galaretki.
- Rozpocznij wstępne ustawianie zarodków, przenosząc je pojedynczo z kropli na powierzchnię galaretki. Do przenoszenia użyj skośnej igły hipodermicznej, wykorzystując jej skośną stronę jako łyżeczkę.
- Rozmieść zarodki orientacyjnie w 2 do 3 kolumnach. Jeśli zarodek utknie w igle, zamieszaj go w kropli z pozostałymi zarodkami, aby go uwolnić. Na tym etapie nie poświęcaj czasu na precyzyjne wyrównywanie. Zachowaj odstępy między kolumnami.
- Wyrównaj zarodki, przesuwając je poziomo po medium galaretkowym za pomocą igły hipodermicznej. Podczas przesuwania skieruj głowy i ogony w tym samym kierunku. Ustaw je równolegle względem siebie wzdłuż kolumny. Usuń nadmiar PBS z glicerolem, który pozostał w formie śladu, za pomocą skręconej chusteczki Kimwipe.
Uwaga: Nadmiar glicerolu spowoduje, że zarodki będą luźno osadzone w żelu, co doprowadzi do rozdzielenia dwóch warstw galaretki, utrudniając wycinanie i montaż. Z kolei usunięcie zbyt dużej ilości glicerolu doprowadzi do wyschnięcia i spłaszczenia zarodków. - Używając przyciętej żółtej końcówki, rozprowadź cienką warstwę galaretki nad zarodkami (50-150 μL, w zależności od liczby ustawionych zarodków).
- Umieść szkiełko w zamrażarce -20°C na 10-20 min lub przechowuj w temperaturze 4°C przez noc. Upewnij się, że galaretka jest całkowicie sztywna przed wycinaniem. W przeciwnym razie blok zarodków będzie bardzo trudny do wycięcia. Najlepsze wyniki wycinania uzyskuje się następnego dnia.
- Pod stereomikroskopem, za pomocą żyletki, przetnij galaretkę całkowicie po obu stronach ustawionych zarodków. Trzymaj żyletkę pod kątem 90°, aby wykonać proste cięcia. Cięcia powinny być wykonane bardzo blisko bieguna przedniego i tylnego zarodków, aby uniknąć nadmiaru galaretki, która mogłaby utrudniać obrazowanie.
- Dodaj 100-200 μL zimnego PBT (4°C, PBS+0,1% Tween 20) obok nacięć i ostrożnie zeskrob galaretkę między zarodkami za pomocą szpatułki.
Uwaga: Detergent w PBT ułatwia usuwanie galaretki ze szkiełka bez uszkadzania zarodków. - Za pomocą igły przenieś blok galaretki z zatopionymi zarodkami na czyste szkiełko w celu dalszego wycinania. Wytnij mniejsze bloki zawierające 5-7 zarodków. Użyj PBT, aby łatwiej przesuwać blok galaretki. Alternatywnie, umieść blok na suchej powierzchni szklanej, aby przylgnął do szkła, co zapewni większą stabilność przy precyzyjnym przycinaniu galaretki, jeśli jest to konieczne.
- Odwróć zarodki zatopione w galaretce do pozycji pionowej za pomocą żyletki i igły. W celu wizualizacji pod mikroskopem wykonaj jeden z dwóch poniższych kroków, w zależności od rodzaju statywu mikroskopowego.
- Mikroskop odwrócony: umieść gotowe bloki zarodków na długim szkiełku nakrywkowym, z zarodkami w pozycji pionowej. Upewnij się, że strona zarodka z najmniejszą ilością galaretki znajduje się w bliższym kontakcie z obiektywem.
- Mikroskop prosty: przygotuj dwa stosy z czterech szkiełek nakrywkowych nr 1 sklejonych superglue, które będą służyć jako „podpory”, i umieść blok zarodków w glicerolu pomiędzy „podporami”. Połącz stosy za pomocą długiego szkiełka nakrywkowego.
- Do analizy konfokalnej sprawdź odległość roboczą używanych obiektywów, aby dowiedzieć się, czy można obrazować cały zarodek, czy tylko częściowo. Na przykład zarodki D. melanogaster mają długość ok. 0,55 mm i mogą być w całości obrazowane przy użyciu obiektywu Zeiss 20x Plan-Apo lub 40x LD Neo-Fluor. Poniższa strona internetowa zawiera informacje o dostępnych obiektywach Zeiss i umożliwia wyszukiwanie obiektywów według odległości roboczych: https://www.micro-shop.zeiss.com/us/us_en/objektive.php
2. Reprezentatywne wyniki
Ponieważ embriony pozostają w całości, metodę tę można wykorzystać do dokładnych pomiarów wielkości embrionów oraz odległości między wzorami ekspresji genów. Na rysunku 1 przedstawiamy embriony w stadium blastodermy zabarwione barwnikiem jądrowym DAPI (niebieski), przeciwciałem anty-Dorsal (czerwony), mRNA sog (żółty) oraz mRNA sna (zielony). Za pomocą tej metody można również wizualizować procesy morfologiczne, takie jak inwagynacja mezodermy (rysunek 2A, B) i migracja komórek mezodermalnych (rysunki 3 i 4). Różne pozycje Z wzdłuż osi DV można uzyskać poprzez zmianę płaszczyzny ogniskowania, co pokazano na rysunkach 2-4.
Rysunek 1. Pionowy przekrój optyczny nienaruszonego zarodka w stadium blastodermy. Podwójne barwienie na mRNA i białko. Na rysunku wskazano docelowe mRNA dla sond in situ (sog oraz sna) oraz białko barwione przeciwciałem pierwszorzędowym (anty-Dorsal). DAPI zastosowano do znakowania jąder komórkowych. Należy zauważyć, że ekspresja sog i sna znajduje się apikalnie w cytoplazmie, natomiast ekspresja Dorsal ma charakter jądrowy. Przy tym powiększeniu widoczne są również silne sygnały z nowo powstałych transkryptów sog zlokalizowanych w jądrach.
Rysunek 2. Obrazowanie w pozycji pionowej nienaruszonego zarodka w fazie gastrulacji. Na rysunku wskazano użyte sondy mRNA oraz odpowiadające im kolory. A) Należy zauważyć, że na tym etapie trzy geny barwiono tym samym fluoroforem (Analiza sieci społecznościowych (SNA), SOG i dpp, w kolorze zielonym), są wyrażane w przestrzennie oddzielonych domenach. Inwaginujące mezodermum wyraża SNA, warstwa neuroblastów wykazuje ekspresję ind a ektoderma wykazuje ekspresję dpp, podczas gdy SOG (ang. *Statement of Goals* – Deklaracja celów) ekspresja jest nadal obecna w obszarach brzusznych układu nerwowego. B) W głębszej płaszczyźnie konfokalnej tego samego zarodka zauważamy, że podstawa ulegającego ewaginacji mezodermy wykazuje silną ekspresję SNA, ale w jego regionie apikalnym poziomy te są niższe.
Rysunek 3. Obrazowanie w pozycji pionowej nienaruszonego zarodka z rozciągniętym pasmem zarodkowym. RNA sog (żółty); mRNA snail, ind oraz dpp (zielone), białko Dorsal (czerwone). Jądra komórkowe zabarwiono DAPI (niebieski). A) Płaszczyzna ogniskowania w pobliżu głowy zarodka. B) Inna płaszczyzna ogniskowania w obszarze tułowia tego samego zarodka. Zwróć uwagę na skupisko komórek mezodermalnych przed migracją boczna (porównaj z Rysunkiem 4), położone blisko brzusznej linii środkowej po obu stronach zarodka z rozciągniętym pasmem zarodkowym. Delaminujące neuroblasty są zaznaczone na zielono (ind i sna).
Rycina 4. Obrazowanie pionowe nienaruszonego zarodka podczas wydłużania pasma zarodkowego. RNA sog (żółty); mRNA snail, ind oraz dpp (zielony), białko Dorsal (czerwone). A) Zwrócono uwagę na delaminujące neuroblasty z nabłonka (strzałka), zabarwione na tym etapie zarówno dla ind, jak i sna (zielony). Zwrócono również uwagę na ograniczoną ekspresję sog do brzusznej linii środkowej (żółty). Ekspresja dpp na tym etapie jest widoczna po bokach zarodka (gwiazdka). B) Przekrój optyczny w tym samym zarodku co w A, w pobliżu końca długości zarodka, co odpowiada regionowi środkowo-tylnemu. Komórki brzusznej linii środkowej są zabarwione dla sog.
Dyskusja
Wykonywanie obrazów przekrojów poprzecznych embrionów Drosophila może być trudne, ponieważ wymaga albo starannego ręcznego preparowania plastrów2, albo zastosowania mediów zatapiających do obróbki mikrotomem, co zazwyczaj jest niekorzystne dla barwień fluorescencyjnych. Alternatywnie, do stworzenia rekonstrukcji 3D obrazów przekroju poprzecznego można wykorzystać stosy Z (Z-stacks) wykonane za pomocą mikroskopu konfokalnego. Jednakże wykonanie wielu cienkich warstw konfokalnych w celu uzyskania dokładnej rekonstrukcji 3D jest czasochłonne, a problematyczny staje się fotobieling. Kolejną kwestią przy obrazowaniu embrionów zamocowanych wzdłużnie jest rozproszenie światła występujące przy docieraniu do głębszych sekcji embrionu, co utrudnia również dokonywanie precyzyjnych pomiarów sygnałów fluorescencyjnych w celu kwantyfikacji poziomów ekspresji białek lub mRNA1. Nawet przy użyciu dwufotonowego mikroskopu konfokalnego rozproszenie światła nadal stanowi problem ze względu na nieprzezroczystość materiału żółtka w środkowej części embrionu, co ogranicza wybór mediów montażowych zapewniających optymalną przejrzystość próbki.
Aby rozwiązać te problemy, opracowano niedawno nową technikę obrazowania tzw. „End-on”, polegającą na pionowym pozycjonowaniu embrionów, która umożliwia obrazowanie próbek żywych oraz utrwalonych 4. W niniejszej pracy opracowaliśmy nowy protokół dla embrionów zamontowanych pionowo, który pozwala na prostą preparatykę i wizualizację utrwalonych embrionów lub tkanek o dowolnym rozmiarze i kształcie, zabarwionych wieloma sondami in situ 3. Nasza metoda polega na zastosowaniu medium montażowego o konsystencji żelowej, w którym zamyka się wyrównane embriony. Wycięte bloki tego medium montażowego zawierające zatopione embriony można ustawić pionowo przed obrazowaniem w dowolnym typie mikroskopu konfokalnego.
Poprzez osadzenie embrionów w galaretce i ustawienie ich pionowo, jesteśmy w stanie wykonać poziome przekroje poprzeczne przy użyciu mikroskopii konfokalnej, w których komórki wzdłuż osi grzbietowo-brzusznej embrionu są prezentowane jednocześnie. Stanowi to istotną poprawę w celach ilościowych, ponieważ wyeliminowano problemy z rozpraszaniem światła i fotowyblakaniem barwników fluorescencyjnych, które występują podczas konwencjonalnej rekonstrukcji Z-stack embrionów zamontowanych podłużnie. W związku z tym ilościowe określanie ekspresji genów lub poziomów białek wzdłuż osi grzbietowo-brzusznej jest dokładne, ponieważ komórki znajdujące się w przeciwnych pozycjach grzbietowo-brzusznych są obrazowane w tym samym czasie i w tej samej konfokalnej pozycji Z. Dodatkowo opisana metoda pozwala nam uzyskać kompletny obraz 2-D w poprzek osi grzbietowo-brzusznej z embrionu 3-D bez konieczności stosowania złożonych komputerowych metod rozwijania (unrolling) w celu wizualizacji komórek w różnych pozycjach wzdłuż osi DV 6.
Do krytycznych etapów należy usunięcie nadmiaru glicerolu po ustawieniu zarodków, aby zapobiec rozwarstwieniu dwóch warstw galaretki. Jednakże, jeśli próbka zostanie zbyt mocno odwodniona, uzyskany obraz będzie zniekształcony i będzie charakteryzować się nieprawidłową morfologią. Ponadto, jeśli medium galaretkowe wokół zarodka zostanie odcięte pod kątem zamiast prostopadle, uzyskany obraz może wydawać się mniej okrągły i bardziej owalny, co wynika z nieprawidłowego ustawienia zarodków pod kątem innym niż 90 stopni. Wreszcie, jeśli galaretka nie zostanie odcięta wystarczająco blisko zarodka na końcach przednim/tylnym, nie będzie możliwe uzyskanie właściwego obrazu, ponieważ odległość robocza obiektywu byłaby wykorzystana głównie do ustawienia ostrości na galaretce, a nie na zarodku.
Kolejnym ważnym krokiem, który może być konieczny podczas obrazowania embrionów w późnej fazie gastrulacji, jest staranna selekcja interesujących nas stadiów pod mikroskopem przed ich ustawieniem. Zazwyczaj stadia embrionów określa się na podstawie cech morfologicznych, które są najłatwiejsze do rozpoznania w pozycji podłużnej.
Jedną z alternatywnych modyfikacji, które można wprowadzić w tej metodzie, jest dodanie odczynnika zapobiegającego blaknięciu (np. p-fenylenodiaminy lub PPD) do drugiej warstwy galaretki, aby pomóc chronić barwniki fluorescencyjne przed fotobleakowaniem.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Autorzy są szczególnie wdzięczni Deborah Harris i Danielle MacKay. Wsparcie dla niniejszej pracy zapewnił Departament Biologii oraz College of Arts and Sciences CWRU, a także grant HHMI numer 52005866 przeznaczony na wsparcie edukacji studiów licencjackich w zakresie nauk biologicznych.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Medium montażowe Glycerin Jelly | Electron Microscopy Sciences | 17998-10 | Zawiera niskie stężenie fenolu jako konserwantu i powinno być stosowane w dygestorium lub w dobrze wentylowanym pomieszczeniu. Przepis na samodzielne przygotowanie medium opisano w Zander, 1997. |
| Konfokalny mikroskop Zeiss LSM 700 | Carl Zeiss, Inc. | Użyto następujących obiektywów: Plan-Apo 20x 0.8 M27 (WD 0.55mm); EC Plan-Neofluar 40x 1.3 oil (WD 0.21mm); LD Plan-Neofluar 0.6 Korr 40X (WD 2.9mm). | |
| Fosforanowy bufor solny z 0.1% Tween 20 (PBT) | |||
| Szklane preparaty mikroskopowe | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Szklane laminki | Electron Microscopy Sciences | 72204-02 | Rozmiar 1 ½ (specyficzne dla obiektywów użytych w tej pracy). |
| Szklane laminki (do tworzenia podpórek) | Fisher Scientific | 12-544-10 | Należy użyć czterech laminek sklejonych superglue. |
| Mikroskop sekcyjny | M5 Wild Heerbrugg Wild Makroskop | M420 | |
| Żyletka | Stalowe jednoostrzniowe ostrza przemysłowe | ||
| Spatułka | Fisher Scientific | 21-401-10 | |
| Igły hipodermiczne | Fisher Scientific | 1482610 | Rozmiar 26 Gauge |
| Pipety | Labnet International |
Bibliografia
- Ay, A., Fakhouri, W. D., Chiu, C., Arnosti, D. N. Image processing and analysis for quantifying gene expression from early Drosophila embryos. Tissue Engineering. 14, 1517-1526 (2008).
- Grβhans, J., Wieschaus, E. A genetic link between morphogenesis and cell division during formation of the ventral furrow in Drosophila. Cell. 101, 523-531 (2000).
- Kosman, D., Mizutani, C. M., Lemons, D., Cox, W. G., McGinnis, W., Bier, E. Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos. Science. 305, 846-846 (2004).
- Witzberger, M. M., Fitzpatrick, J. A. J., Crowley, J. C., Minden, J. S. End-on imaging: a new perspective on dorsoventral development in Drosophila embryos. Developmental Dynamics. 237, 3252-3259 (2008).
- Zander, R. H. On mounting delicate bryophytes in glycerol. The Bryologist. 100, 380-382 (1997).
- Liberman, L. M., Reeves, G. T., Stathopoulos, A. Quantitative imaging of the Dorsal nuclear gradient reveals limitations to threshold-dependent patterning in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (52), 22317-2222 (2009).
Przedruki i uprawnienia
