Mutageneza i analiza funkcjonalna kanałów jonowych heterologicznie eksprymowanych w komórkach ssaków

Podsumowanie

Przedstawimy sposób badania wpływu pojedynczej mutacji punktowej na funkcję kanału jonowego.

Streszczenie

Zademonstrujemy, jak badać funkcjonalne efekty wprowadzenia mutacji punktowej w kanale jonowym. Badamy kanały potasowe wewnątrzstymulowane sterowane białkami G (zwane GIRK), które są istotne dla regulacji pobudliwości neuronów. Istnieją cztery różne podjednostki kanałów GIRK u ssaków (GIRK1-GIRK4) – skupiamy się na GIRK2, ponieważ tworzy on homotetramer. Stymulacja różnych typów receptorów sprzężonych z białkami G (GPCR), takich jak receptor muskarynowy (M2R), prowadzi do aktywacji kanałów GIRK. Alkohol również bezpośrednio aktywuje kanały GIRK. Pokażemy, jak zmutować jeden aminokwas poprzez specyficzną zmianę jednego lub większej liczby nukleotydów w cDNA kanału GIRK. Ta zmutowana sekwencja cDNA zostanie namnożona w bakteriach, oczyszczona, a obecność mutacji punktowej zostanie potwierdzona za pomocą sekwencjonowania DNA. cDNA dla zmutowanych i dzikich kanałów GIRK zostaną przetransfekowane do ludzkich komórek embrionalnej nerki HEK293T hodowanych in vitro. Na koniec zastosowana zostanie elektrofizjologia metodą patch-clamp w konfiguracji whole-cell, aby zbadać makroskopowe prądy potasowe przepływające przez ektopowo eksponowane kanały GIRK typu dzikiego lub zmutowane. W tym doświadczeniu zbadamy wpływ mutacji L257W w kanałach GIRK2 na aktywację zależną od M2R oraz zależną od alkoholu.

Protokół

1. Mutageneza ukierunkowana

Używamy ssaczego plazmidu ekspresyjnego pcDNA3.1 kodującego cDNA dla GIRK2 i wprowadzamy mutację punktową przy użyciu zestawu do mutagenezy kierowanej Stratagene (Agilent Technologies) Quikchange XL II, zgodnie z instrukcjami producenta.

Sekwencje starterów można łatwo wygenerować za pomocą programu do projektowania starterów dostępnego online pod adresem:
https://www.genomics.agilent.com/CollectionSubpage.aspx?PageType=Tool&SubPageType=ToolQCPD&PageID=15

Uwaga: Zamiast opisanych w protokole probówek BD 14 mL, stosujemy standardowe probówki Eppendorf 1,5 mL. Jednakże użycie ultrakompetentnych komórek E. coli XL10-Gold poddanych wstępnej obróbce β-merkaptoetanolem, 30-sekundowy czas szoku termicznego oraz pożywki NZY⁺ (lub NZYM⁺) są kluczowe dla pomyślnej mutagenezy. Jeśli to możliwe, wprowadzenie dodatkowej mutacji cichej, która tworzy nową stronę restrykcyjną, może być wygodne podczas poniższego przesiewania kolonii mutantów.

2. Miniprep, sekwencjonowanie DNA i maxiprep

2.1 Miniprep Qiagen i sekwencjonowanie.

Pojedyncze kolonie bakterii są wyizolowane i hodowane w pożywce LB z ampicyliną (AMP). Do oczyszczania cDNA stosujemy się do instrukcji producenta. W celu potwierdzenia pomyślnego wprowadzenia mutacji można przeprowadzić proste trawienie restrykcyjne, pod warunkiem że w kroku 1 powyżej włączono miejsce restrykcyjne. Automatyczne sekwencjonowanie DNA jest wykonywane poza laboratorium i jest niezbędne do potwierdzenia obecności mutacji w cDNA, a także do oceny, czy nie wystąpiły żadne niepożądane mutacje. Krok ten jest bardzo ważny. Sekwencjonujemy całą sekwencję kodującą GIRK, używając forwardowego promotora T7 oraz reverse'owej primera sekwencjonującej BGH, które flankują miejsce wielokrotnego klonowania plazmidu pcDNA3.1.

Uwaga: Ważne jest dokładne sprawdzenie elektroferogramu sekwencjonowania, aby upewnić się co do wystarczającej jakości danych. Wysokiej jakości elektroferogram charakteryzuje się ostrymi, niezachodzącymi na siebie pikami przy niskim poziomie szumu tła.

2.2 Maxiprep Qiagen.

Postępujemy zgodnie z instrukcjami producenta.

Uwaga: Krok ten został uwzględniony w naszych eksperymentach w celu zwiększenia czystości cDNA, co w naszej ocenie jest istotne dla wydajnej transfekcji.

3. Hodowla i transfekcja komórek HEK293T

Wszystkie te etapy powinny być wykonane w sterylnej komorze do hodowli tkanek.

3.1 Hodowla komórkowa

Komórki HEK293T są wygodne w użyciu, ponieważ są łatwe w hodowli (inkubator z nawilżaniem, 37°C, 5%CO₂), charakteryzują się krótkim czasem replikacji, wysoką wydajnością transfekcji oraz nadają się do elektrofizjologii metodą patch-clamp w konfiguracji whole-cell. Komórki HEK293T wykazują ekspresję dużego antygenu T wirusa SV40, co zapewnia episomalną replikację plazmidu pcDNA3.1.

Komórki HEK293T hoduje się w pożywce DMEM z niską zawartością glukozy, uzupełnionej o L-glutaminę i 10 % płodowej surowicy bydlęcej (FBS). W celu pasażowania komórek, do konfluentnych (90-95%) komórek HEK293T dodaje się 0,25% trypsyny/EDTA; po odczekaniu do momentu odklejenia się komórek od naczynia hodowlanego, aktywność enzymu zatrzymuje się poprzez dodanie świeżej pożywki zawierającej FBS. Do 12-dołkowej płytki hodowlanej wysiewa się ~ 1 X 10⁵ komórek/dołek w 1 mL pożywki hodowlanej bez antybiotyków na dołek. (1 X 10⁵ komórek odpowiada ~ 350 μL zawiesiny komórkowej uzyskanej z konfluentnej kolby T25 resuspendowanej w 10 mL pożywki).

3.2 Transfekcja

Po 8-24 h komórki HEK przylgną do plastiku i będą gotowe do transfekcji. Przetransfekuj komórki, używając 0,2 μg cDNA kanału, 0,4 μg cDNA receptora M2R oraz 0,04 μg cDNA YFP za pomocą Invitrogen Lipofectamine 2000. Uwaga: stosujemy niewielką ilość cDNA YFP, aby określić, które komórki zostały pomyślnie przetransfekowane (komórki zielone prawdopodobnie zawierają zarówno kanały GIRK, jak i receptory M2). Stężenie cDNA będzie wymagało dostosowania dla każdego klonu.

3.3 Wizualizacja fluorescencyjna transfektowanych komórek.

Umieść płytkę 12-dołkową na stoliku odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego i zbadaj komórki pod kątem ekspresji YFP. Porównaj wynik z obrazem DIC i zanotuj przybliżoną liczbę zielonych komórek. Pozwala to na oszacowanie wydajności transfekcji.

3.4 Przygotowanie płytek 24-dołkowych oraz szkiełek nakrywek powlekanych poli-D-lizyną

Szklane szkiełka nakrywkowe o średnicy 12 mm (Warner, CS-12R) należy oczyścić, potrząsając nimi przez noc w roztworze Radiacwash, a następnie przemyć wodą dejonizowaną i potrząsać przez noc w 95% etanolu. Oczyszczone szkiełka nakrywkowe przechowywać w 70% etanolu do momentu użycia.

Umieść szkiełka nakrywkowe w szalce Petriego z etanolem, wypal etanol za pomocą pęsety i palnika, a następnie umieść szkiełko w jednym dołku sterylnej płytki 24-dołkowej.

Każdą studzienkę wypełnij 250 μL roztworu poli-D-lizyny (PDL) [0,2 mg/mL] i pozostaw szkiełka nakrywki zanurzone w roztworze PDL przez noc w sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza. Owiń płytkę 24-dołkową folią Parafilm, aby zapobiec odparowywaniu.

Następnego ranka odessać PDL i przemyć 2x sterylną wodą. Pozostawić płytki otwarte do wyschnięcia pod dygestorium, a następnie przykryć. Płytki 24-dołkowe z pokrytymi szkiełkami nakrywkowymi można owinąć sterylną folią aluminiową i przechowywać w temperaturze pokojowej przez kilka tygodni.

3.5 Wysiewanie przetransfekowanych komórek HEK293T na szkiełka podstawowe

24 h po transfekcji przenieść komórki do płytki 24-dołkowej (~4 X 10³ komórek/dołek) zawierającej szkiełka podstawowe pokryte poli-D-lizyną. Uwaga: przetransfekowane komórki można wykorzystać do 24–72 h po transfekcji. Komórki są przenoszone w celu uzyskania pojedynczych szkiełeczek do eksperymentów elektrofizjologicznych metodą patch-clamp.

4. Elektrofizjologia

4.1 Przygotowanie roztworów

Roztwór zewnątrzkomórkowy (kąpiel): 20 mM KCl, 140 mM NaCl, 0.5 mM CaCl₂, 2 mM MgCl₂ oraz 10 mM HEPES (pH 7.4 ustawione za pomocą NaOH).

Odpowiedź 20K roztworu kąpielowego i dodaj odpowiednie modulatory

• 20K + Ba²⁺: roztwór zawierający 1 mM BaCl₂: specyficzny inhibitor prądów prostujących do wewnątrz
• 20K + Karbachol: roztwór z 5 μM Karbacholu: specyficzny agonista M2R; M2R sprzęga się z białkami G, które otwierają kanały GIRK
• 20K + Etanol: roztwór kąpielowy zawierający 100 mM EtOH w celu bezpośredniej aktywacji kanałów GIRK

Należy umieścić roztwory kąpieli w strzykawkach (pojemnikach na roztwory) systemu perfuzji z szybką wymianą. Uwaga: Do kontrolowania roztworów kąpieli stosujemy system zaworów zaciskowych Warner. Zaleca się użycie drenów PE.

Roztwór wewnętrzny/elektrodowy: 140 mM KCl, 20 mM NaCl, 5 mM EGTA, 5.4 mM MgCl₂, 10 mM HEPES (pH 7.4) z 2.5 mM K₂ATP i 0.3 μM Li₂GTP.

Przygotowujemy roztwór elektrolityczny bez ATP i GTP. Oddzielnie przygotowujemy alikwoty ATP i GTP, które są przechowywane w temperaturze -80°C, a następnie dodajemy je do roztworu elektrolitycznego w dniu eksperymentu. Strzykawkę z końcowym roztworem elektrolitycznym przechowujemy w lodzie, aby zachować stabilność ATP/GTP. Roztwory wewnętrzne i zewnętrzne filtrujemy sterylnie (0,2 μm), aby zahamować wzrost drobnoustrojów i zmniejszyć ryzyko zapchania rurek oraz elektrody.

4.2 Wytwarzanie elektrod (wyciąganie kapilar)

Do otrzymania elektrod o oporności od 3-7 MΩ po wypełnieniu ich roztworem wewnątrzkomórkowym wykorzystujemy dwustopniową pionową wyciągarkę Narishige oraz elektrody z borokrzemianu firmy Warner Instrument (średnica zewnętrzna 1.5 mm, średnica wewnętrzna 0.86 mm i długość 7.5 cm).

Uwaga: Konieczne jest eksperymentalne określenie parametrów dla wyciągarki elektrod oraz rodzaju szkła elektrodowego stosowanego w danym laboratorium. W przypadku naszej wyciągarki pionowej stosujemy ustawienie temperatury 60.2 dla pierwszego wyciągnięcia i ~43 dla drugiego wyciągnięcia.

4.3 Rejestracja prądów metodą patch-clamp w konfiguracji whole-cell

1. Zamocuj szkiełko nakrywkowe w szalce 35 mm, używając niewielkiej ilości wazeliny, zalej roztworem zewnętrznym i umieść szalkę na stoliku odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego. Użyj DIC do ustawienia ostrości i znalezienia komórek, a następnie przełącz na fluorescencję YFP, aby zlokalizować komórki pozytywne pod kątem YFP.
2. Ustaw końcówkę manifoldu perfuzyjnego w pobliżu zielonej komórki (20-30 μm od komórki docelowej = 2-3 długości komórki odległości).
3. Wypełnij elektrody roztworem i podłącz je do headstage'u wzmacniacza Axopatch 200B (Axon Instruments) z następującymi ustawieniami początkowymi: Gain 1, Configuration: whole-cell β=1, mode V-clamp.
4. Przyłoż nadciśnienie do elektrody, aby zapobiec zapchaniu pipety, a następnie za pomocą manipulatora umieść końcówkę elektrody tuż nad komórką.
5. Aby wyzerować potencjał pipety, wybierz przycisk Seal Test, aby podać testowy skok napięcia. Prostokątny skok napięcia 5 mV pojawi się w oknie Seal Test programu Clampex. Dostosuj potencjometr Pipette Offset we wzmacniaczu, aby sprowadzić prąd linii bazowej do 0 nA. Alternatywnie, wyzeruj potencjał pipety, przełączając selektor trybu wzmacniacza na tryb V-track, a pokrętło miernika na Vtrack, i użyj potencjometru Pipette Offset we wzmacniaczu, aby ustawić napięcie na wyświetlaczu miernika wzmacniacza na „0.00”.
6. Sprawdź rezystancję elektrody za pomocą komendy seal test w oprogramowaniu Clampex 8.2 (powinna wynosić 3-7 MΩ).
7. Otwórz zapisany plik protokołu lub utwórz nowy protokół. Aby otworzyć plik protokołu, wybierz z menu głównego Acquire, a następnie Open Protocol i wybierz zapisany plik protokołu napięciowego. Dla tego eksperymentu protokół został stworzony tak, aby utrzymać potencjał błony na poziomie -40 mV, podać pojedynczy 50 ms skok napięcia do -100 mV i rampę do +40 mV w czasie 200 ms. Protokół ten jest wykonywany co 2 sekundy. Protokół rampowy pozwala na obserwację potencjału odwrócenia i prostowania do wewnątrz kanałów GIRK. W przypadku napięciowo zależnych kanałów jonowych bardziej odpowiedni może być prostokątny skok napięcia.
8. Zbliż się do komórki, korzystając z regulacji precyzyjnej manipulatora, zwolnij nadciśnienie, a po dotknięciu powierzchni komórki przyłóż podciśnienie i monitoruj wzrost rezystancji w oknie oscyloskopu Seal Test. Gdy rezystancja osiągnie zakres GΩ, elektroda uszczelniła się z błoną (powstał Gigaseal).
9. Przyłóż impuls podciśnienia, aby przerwać błonę komórkową i uzyskać dostęp do wnętrza komórki. Po przejściu w konfigurację whole-cell zarejestrujesz zwiększone prądy pojemnościowe.
10. Przełącz się na Membrane Test w programie Clampex i zapisz rezystancję dostępu Ra, rezystancję błony Rm, pojemność błony Cm oraz zweryfikuj wzrokowo dopasowanie wykładnicze teoretycznej krzywej do rzeczywistego prądu pojemnościowego. Pojemność błony jest proporcjonalna do wielkości komórki i zostanie wykorzystana później do obliczenia gęstości prądu.
11. Powróć do Seal Test, ustaw V-Out (potencjał błony) na -40 mV i filtr na 10 kHz.
12. Kompensuj pojemność błony i rezystancję szeregową we wzmacniaczu w następujących krokach:
    1. Włącz przełącznik WHOLE CELL CAP. Reguluj pokrętłami WHOLE CELL CAP i SERIES RESISTANCE w przód i w tył, aż uzyskasz płaski impuls testowy. Może być również konieczna regulacja pokrętła pojemności pipety FAST CAP.
    2. Ustaw pokrętło % PREDICTION na około 60-80%, ponownie regulując WHOLE CELL CAP i pokrętło SERIES RESISTANCE (może być konieczna również regulacja pokrętła kompensacji pojemności pipety FAST CAP).
    3. Ustaw % COMP- na 100% bez wywoływania oscylacji komórki, starając się utrzymać płaski impuls poprzez ponowną regulację WHOLE CELL CAP i SERIES RESISTANCE (może być konieczna również regulacja pokrętła kompensacji pojemności pipety FAST CAP). Dostosuj opóźnienie (lag), zmniejszając stałą czasową.
    4. Zapisz w notatniku wartości Cm (pojemność błony), Rs (rezystancja szeregowa), %COMP, %PRED i czas opóźnienia (Lag time) ustawione we wzmacniaczu. Wartości Cm i Rs powinny być zbliżone do wartości Cm i Rm zmierzonych wcześniej w Membrane Test.
13. Otwórz zawór roztworu zewnętrznego, aby kontrolować roztwór w kąpieli. Ustaw 8-biegunowy filtr Bessela we wzmacniaczu na 2 kHz, otwórz protokół clamp napięciowego i rozpocznij rejestrację prądów.
14. Rejestrujemy prądy GIRK przy użyciu protokołu rampowego, który wykonuje skok do -100 mV przez 50 ms, a następnie rampę od -100 mV do +40 mV w czasie 200 ms, podawaną co 2 sekundy. Protokół rampowy pozwala na obserwację potencjału odwrócenia i właściwości prostowania do wewnątrz kanałów GIRK. W temperaturze pokojowej (22-25° C) prąd GIRK powinien odwrócić się w pobliżu -50 mV (przy 20 mM KCl w kąpieli), co jest bliskie obliczonemu potencjałowi równowagi dla K (E_K = -50 mV), a następnie pozostać dość płaski przy potencjałach dodatnich względem E_K.
15. Protokół eksperymentalny: Po zarejestrowaniu stabilnej linii bazowej, przełącz na roztwór 20K + karbachol i poczekaj na szczyt odpowiedzi, wróć do roztworu kąpieli 20K, następnie podaj 20K + etanol i poczekaj na szczyt odpowiedzi, potem wróć do roztworu kąpieli 20K i na koniec do roztworu 20K + Ba²⁺. Podczas aplikacji tych leków zaobserwujesz zmiany amplitudy prądów GIRK (najbardziej wyraźne przy -100 mV). Zanotuj w notatniku numer śladu odpowiadający aplikacji różnych roztworów zewnątrzkomórkowych. Pojedynczy plik Clampfit będzie zawierał wszystkie przebiegi (sweeps) dla całego eksperymentu.

5. Analiza danych

Do analizy danych dotyczących prądów GIRK przy -100 mV wykorzystujemy oprogramowanie Clampfit 9.2.

1. Otwórz plik z zapisem, ustaw kursor na -100 mV. Domyślnie wszystkie ślady będą wyświetlane na ekranie w formie nałożonej. Po kliknięciu ikony „Write cursors” zostanie utworzony arkusz podobny do programu Excel z danymi numerycznymi.
2. Przypisując kolumnę numeru śladu do osi X, a kolumnę kursora do osi Y i klikając ikonę „Create Graph”, można szybko narysować wykres przebiegu czasowego eksperymentu.
3. Oblicz prąd bazalny, odejmując prąd w obecności Ba²⁺ od prądu zarejestrowanego w samym zewnętrznym roztworze perfuzyjnym (prąd „20K” minus prąd „20K + Ba²⁺”). Oblicz prądy indukowane, odejmując prąd bazalny w 20K od prądów aktywowanych (prąd „20K + Carbachol” minus prąd „20K”; prąd „20K + Ethanol” minus prąd „20K”). Oblicz gęstość prądu (pA/pF), dzieląc prąd przez pojemność błony (odczytaną bezpośrednio z wzmacniacza). Oblicz procent aktywacji, dzieląc prądy indukowane przez prądy bazalne i mnożąc wynik przez 100.

6. Reprezentatywne wyniki

Powinieneś być w stanie zarejestrować prąd z komórek transfektowanych kanałami typu dzikiego. W przypadku kanałów GIRK mierzonych w roztworze zewnątrzkomórkowym zawierającym 20 mM K⁺ (i 145 mM K⁺ wewnątrzkomórkowo), powinny one wykazywać silną prostowanie do wewnątrz oraz potencjał odwracania wynoszący ~ -50 mV, co jest kluczową właściwością kanałów potasowych. Prąd typu dzikiego gwałtownie wzrośnie po zastosowaniu karbacholu (3-5 krotny wzrost w stosunku do prądu bazalnego) i podobnie zareaguje na 100 mM etanolu. Uwaga: zgodnie z konwencją przyjętą w elektrofizjologii, prąd do wewnątrz jest uznawany za ujemny, a prąd na zewnątrz za dodatni. W przypadku mutacji L257W w kieszeni wiążącej alkohol kanału GIRK2, zaobserwujesz osłabione odpowiedzi zarówno na karbachol, jak i etanol. Sugeruje to, że L257 bierze udział w aktywacji kanałów GIRK2 przez alkohol oraz białka G. Dalsze przykłady wyników mutagenezy GIRK2 można znaleźć w niedawnej publikacji Aryal et al.¹.

Rysunek 1. Okno programu Clampfit 8.0 przedstawia plik danych z rejestracji GIRK2 typu dzikiego. Panel w lewym górnym rogu pokazuje nałożone na siebie przebiegi zarejestrowane w odpowiedzi na protokół rampowy napięcia w obecności różnych zewnętrznych roztworów kąpieli. Kursor 1 jest ustawiony na -100 mV. Wartości kursorów są zapisywane w arkuszu kalkulacyjnym (panel prawy). Panel w lewym dolnym rogu przedstawia wykres numeru przebiegu w funkcji prądu. Zwróć uwagę na wzrost prądu (odchylenie w dół) przy zastosowaniu etanolu (EtOH) i karbacholu (Carb) oraz inhibicję prądu przez Ba²⁺.

Rycina 2. Okno programu Clampfit 8.0 przedstawia plik danych z rejestracji dla mutanta GIRK2-L257W. Opisy są takie same jak na Rycinie 1. Należy zwrócić uwagę na utratę aktywacji przez karbachol (Carb) oraz redukcję prądów indukowanych przez EtOH w kanałach zmutowanych.

Dyskusja

Mutageneza celowana jest klasycznym podejściem do badania relacji struktura-funkcja kanałów jonowych. Opiera się ona na założeniu, że poprzez zmianę krytycznego reszty aminokwasowej kanału jonowego powinno być możliwe zaobserwowanie wyraźnych zmian w funkcji kanału. W przeciwieństwie do tego, wiele mutacji w pozycjach niekrytycznych można wprowadzić bez istotnych zaburzeń funkcji kanału. Typowo, rozważaną resztę mutuje się najpierw na alaninę, mały aminokwas niepolarny, a następnie na tryptofan, największy z aminokwasów². Jeśli reszta jest istotna dla funkcji kanału, obie mutacje zmienią aktywność kanału. W przypadku zmutowania reszty mniej istotnej, efekty mutacji, zwłaszcza na alaninę, są często niezauważalne. Mutacje na tryptofan częściej powodują zmiany ze względu na zawadę steryczną związaną z rozmiarem tryptofanu. Często, w przypadku braku informacji strukturalnych, do zlokalizowania krytycznych reszt można wykorzystać systematyczną mutację na alaninę lub tryptofan w obrębie fragmentu kanału (tzw. skanowanie alaninowe lub tryptofanowe). Ważne jest, aby zauważyć, że równolegle można przygotować wiele klonów z różnymi mutacjami punktowymi, co pozwala na przetestowanie wielu reszt w stosunkowo krótkim czasie. Niedawno udostępnionych zostało wiele struktur krystalicznych kanałów^3,4,5. Mogą one służyć do zaproponowania potencjalnych kluczowych reszt do przetestowania przy użyciu podejścia opisanego w niniejszym protokole.

Pomiary kanału typu dzikiego powinny zawsze towarzyszyć pomiarom kanału zmutowanego, aby służyć jako kontrola pozytywna potwierdzająca prawidłowe przeprowadzenie transfekcji oraz eksperymentów elektrofizjologicznych. Mutacje punktowe mogą prowadzić do braku funkcjonalnego prądu, prądu zbliżonego do typu dzikiego lub zmienionej regulacji aktywności kanału. Brak mierzalnego prądu może wynikać z nieprawidłowego fałdowania białka lub zaburzonego transportu wewnątrzkomórkowego. W takim przypadku pomocne może być ustalenie, czy kanał jest prawidłowo transportowany na powierzchnię komórki, z wykorzystaniem testu z biotinylacją lub barwienia immunofluorescencyjnego przeciwko znacznikowi zewnątrzkomórkowemu (bez permeabilizacji komórek), aby odróżnić niefunkcjonalne kanały znajdujące się w błonie plazmatycznej od kanałów zatrzymanych wewnątrz komórki. Na koniec zaleca się zbadanie nie tylko aktywności podstawowej kanału, ale także wpływu mutacji na jego regulację. W zależności od badanego kanału jonowego można badać różne mechanizmy modulacji funkcji kanału, w tym regulację przez białka G, PIP2, jony, stężenie ATP, fosforylację (przy użyciu mutacji tyrozyny, seryny lub treoniny), ubikwitynację lub sumoilację (przy użyciu mutacji lizyny) oraz bezpośrednie otwieracze lub blokery kanałów.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Odczynniki chemiczne	Sigma	Różne
Zestaw do Mini Prep	Qiagen	27104
Radiacwash	Biodex	005-100
Hydrobromek poli-D-lizyny	BD Biosciences	CB40210	Można również stosować poli-L-lizynę
Zestaw do Maxi Prep	Qiagen	12263
Zestaw do mutagenezy ukierunkowanej QuickChange XL II	Stratagene	200512-5
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668-027
Szkiełka nakrywkowe ˆ… 12 mm	Warner Instruments	CS-12R
Kapilary szklane borokrzemowe o standardowej ściance	Warner Instruments	G150-3
Odwrócony mikroskop fluorescencyjny	Leica	DMI3000 B
Elektrofizjologia	Nikon/ Leica/ Zeiss	Dowolny odwrócony mikroskop DIC (Hoffmann) z fluorescencją
Wzmacniacz	Molecular Devices	Wzmacniacz Axon Axopatch 200B
System perfuzyjny	Warner Instruments	VC-6 Perfusion MM-6
Digityzer	Molecular Devices	Digityzer Digidata 1320
Manipulatory	Sutter Instruments	Manipulator: MP-85
Wytwornica elektrod	Narishige	Pionowa wytwornica elektrod PC10
Stół izolacyjny	Technical Manufacturing Corporation	Stół pneumatyczny