Mutageneza i analiza funkcjonalna kanałów jonowych heterologicznie eksprymowanych w komórkach ssaków

Podsumowanie

Przedstawimy sposób badania wpływu pojedynczej mutacji punktowej na funkcję kanału jonowego.

Streszczenie

Zademonstrujemy, jak badać funkcjonalne efekty wprowadzenia mutacji punktowej w kanale jonowym. Badamy kanały potasowe wewnątrzstymulowane sterowane białkami G (zwane GIRK), które są istotne dla regulacji pobudliwości neuronów. Istnieją cztery różne podjednostki kanałów GIRK u ssaków (GIRK1-GIRK4) – skupiamy się na GIRK2, ponieważ tworzy on homotetramer. Stymulacja różnych typów receptorów sprzężonych z białkami G (GPCR), takich jak receptor muskarynowy (M2R), prowadzi do aktywacji kanałów GIRK. Alkohol również bezpośrednio aktywuje kanały GIRK. Pokażemy, jak zmutować jeden aminokwas poprzez specyficzną zmianę jednego lub większej liczby nukleotydów w cDNA kanału GIRK. Ta zmutowana sekwencja cDNA zostanie namnożona w bakteriach, oczyszczona, a obecność mutacji punktowej zostanie potwierdzona za pomocą sekwencjonowania DNA. cDNA dla zmutowanych i dzikich kanałów GIRK zostaną przetransfekowane do ludzkich komórek embrionalnej nerki HEK293T hodowanych in vitro. Na koniec zastosowana zostanie elektrofizjologia metodą patch-clamp w konfiguracji whole-cell, aby zbadać makroskopowe prądy potasowe przepływające przez ektopowo eksponowane kanały GIRK typu dzikiego lub zmutowane. W tym doświadczeniu zbadamy wpływ mutacji L257W w kanałach GIRK2 na aktywację zależną od M2R oraz zależną od alkoholu.

Protokół

1. Mutageneza ukierunkowana

Używamy ssaczego plazmidu ekspresyjnego pcDNA3.1 kodującego cDNA dla GIRK2 i wprowadzamy mutację punktową za pomocą zestawu do mutagenezy ukierunkowanej Stratagene (Agilent Technologies) Quikchange XL II, zgodnie z instrukcjami producenta.

Sekwencje starterów można łatwo wygenerować, korzystając z internetowego programu do projektowania starterów dostępnego pod adresem:
https://www.genomics.agilent.com/CollectionSubpage.aspx?PageType=Tool&SubPageType=ToolQCPD&PageID=15

Uwaga: Zamiast opisanych w protokole probówek BD 14 mL stosujemy standardowe probówki Eppendorf 1,5 mL. Jednakże użycie ultrakompetentnych szczepów E. coli XL10-Gold poddanych wstępnemu traktowaniu β-merkaptoetanolem, 30 s czas szoku termicznego oraz pożywka NZY⁺ (lub NZYM⁺) są kluczowe dla pomyślnej mutagenezy. Jeśli to możliwe, wprowadzenie dodatkowej mutacji cichej tworzącej nową sekwencję rozpoznawaną przez enzym restrykcyjny może być pomocne podczas screeningu kolonii mutantów opisanego poniżej.

2. Miniprep, sekwencjonowanie DNA i maxiprep

2.1 Miniprep Qiagen i sekwencjonowanie.

Poszczególne kolonie bakteryjne są wyizolowane i hodowane w pożywce LB z ampicyliną (AMP). Oczyszczanie cDNA przeprowadzamy zgodnie z instrukcjami producenta. Do potwierdzenia pomyślnego wprowadzenia mutacji można zastosować prosty trawienie restrykcyjne, jeżeli w kroku 1 powyżej wbudowano miejsce restrykcyjne. Automatyczne sekwencjonowanie DNA jest wykonywane na zewnątrz i jest niezbędne do potwierdzenia obecności mutacji w cDNA, a także do oceny, czy nie wystąpiły żadne niepożądane mutacje. Ten etap jest bardzo ważny. Sekwencjonujemy całą sekwencję kodującą GIRK, używając forwardowego primera dla promotora T7 oraz reverse'owego primera BGH, które flankują miejsce wielokrotnego klonowania plazmidu pcDNA3.1.

Uwaga: Ważne jest dokładne przeanalizowanie elektroferogramu sekwencjonowania, aby upewnić się co do wystarczającej jakości danych. Wysokiej jakości elektroferogram charakteryzuje się ostrymi, niezachodzącymi na siebie pikami przy niskim poziomie szumu tła.

2.2 Maxiprep Qiagen.

Postępujemy zgodnie z instrukcjami producenta.

Uwaga: Krok ten został uwzględniony w naszych doświadczeniach w celu zwiększenia czystości cDNA, co w naszej ocenie jest istotne dla efektywnej transfekcji.

3. Hodowla i transfekcja komórek HEK293T

Wszystkie te kroki powinny być wykonane w sterylnym dygestorium do hodowli tkanek.

3.1 Hodowla komórkowa

Komórki HEK293T są wygodne w użyciu, ponieważ łatwo je hodować (inkubator z nawilżaniem, 37°C, 5%CO₂), charakteryzują się krótkim czasem replikacji, wysoką wydajnością transfekcji i nadają się do elektrofizjologicznych badań metodą patch-clamp całych komórek. Komórki HEK293T wykazują ekspresję dużego antygenu T SV40, który zapewnia replikację episomalną plazmidu pcDNA3.1.

Komórki HEK293T hoduje się w pożywce DMEM o niskiej zawartości glukozy, uzupełnionej o L-glutaminę i 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS). W celu pasażowania komórek, do konfluentnych (90-95%) komórek HEK293T dodaje się 0,25% trypsyny/EDTA, oczekuje się, aż komórki odkleją się od naczynia hodowlanego, a następnie hamuje aktywność enzymu poprzez dodanie świeżej pożywki zawierającej FBS. Do 12-dołkowej płytki do hodowli komórek wysiewa się ~ 1 X 10⁵ komórek/dołek wraz z 1 mL pożywki hodowlanej bez antybiotyków na dołek. (1 X 10⁵ komórek to ~ 350 μL zawiesiny komórkowej uzyskanej z konfluentnej kolby T25 resuspensowanej w 10 mL pożywki).

3.2 Transfekcja

Po 8-24 h komórki HEK przylgną do plastiku i będą gotowe do transfekcji. Przenieś do komórek 0,2 μg cDNA kanału, 0,4 μg cDNA receptora M2R oraz 0,04 μg cDNA YFP, korzystając z Invitrogen Lipofectamine 2000. Uwaga: używamy niewielkiej ilości cDNA YFP, aby określić, które komórki zostały pomyślnie transfektowane (komórki zielone prawdopodobnie zawierają zarówno kanały GIRK, jak i receptory M2). Stężenie cDNA będzie wymagało dostosowania dla każdego klonu.

3.3 Wizualizacja fluorescencyjna transfektowanych komórek.

Umieść płytkę 12-dołkową na stole odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego i zbadaj komórki pod kątem ekspresji YFP. Porównaj wynik z obrazem DIC i zanotuj przybliżoną liczbę zielonych komórek. Pozwala to na oszacowanie wydajności transfekcji.

3.4 Przygotowanie płytek 24-dołkowych oraz szkiełek nakrywkowych powlekanych poli-D-lizyną

Wyczyść szklane szkiełka nakrywki o średnicy 12 mm (Warner, CS-12R), potrząsając nimi przez noc w roztworze Radiacwash, a następnie przemyj je wodą dejonizowaną i potrząsaj przez noc w 95% etanolu. Przechowuj czyste szkiełka w 70% etanolu do momentu użycia.

Umieść szkiełka nakrywki w płytce Petriego z etanolem, wypal etanol za pomocą pęsety i palnika, a następnie przenieś szkiełko do jednego dołka sterylnej płytki 24-dołkowej.

Każdą studzienkę wypełnij 250 μL roztworu poli-D-lizyny (PDL) [0.2 mg/mL] i pozostaw szkiełka nakrywkowe przez noc w roztworze PDL pod sterylnym dygestorium. Owiń płytkę 24-dołkową Parafilmem, aby zapobiec parowaniu.

Następnego dnia rano odessać PDL i przemyć 2x sterylną wodą. Pozostawić płytki otwarte do wyschnięcia pod dygestorium, a następnie przykryć. Płytki 24-dołkowe z powleczonymi szkiełkami nakrywkowymi można owinąć sterylną folią aluminiową i przechowywać w temperaturze pokojowej przez kilka tygodni.

3.5 Wysiewanie transfekowanych komórek HEK293T na szkiełka podstawowe

24 h po transfekcji podzielone komórki należy przenieść do płytki 24-dołkowej (~4 X 10³ komórek/dołek), zawierającej szklane szkiełka nakrywki pokryte poli-D-lizyną. Uwaga: przetransfekowane komórki można wykorzystać do 24-72 h po transfekcji. Komórki są dzielone w celu przygotowania pojedynczych szkiełek nakrywek do eksperymentów elektrofizjologicznych metodą patch clamp.

4. Elektrofizjologia

4.1 Przygotowanie roztworów

Roztwór zewnątrzkomórkowy (kąpiel): 20 mM KCl, 140 mM NaCl, 0.5 mM CaCl₂, 2 mM MgCl₂ oraz 10 mM HEPES (pH 7.4 ustawione za pomocą NaOH).

Odmierz 20 K roztworu do kąpieli i dodaj odpowiednie modulatory

• 20K + Ba²⁺: roztwór zawierający 1 mM BaCl₂: specyficzny inhibitor prądów prostujących do wnętrza komórki
• 20K + Karbachol: roztwór z 5 μM karbacholu: specyficzny agonista M2R; M2R sprzęga się z białkami G, które otwierają kanały GIRK
• 20K + Etanol: roztwór kąpielowy zawierający 100 mM EtOH w celu bezpośredniej aktywacji kanałów GIRK

Nalej roztwory do kąpieli do strzykawek (pojemników na roztwory) systemu szybkiej wymiany perfuzyjnej. Uwaga: Do sterowania roztworami do kąpieli stosujemy system zaworów zaciskowych Warner. Zaleca się stosowanie przewodów PE.

Roztwór wewnętrzny/elektrodowy: 140 mM KCl, 20 mM NaCl, 5 mM EGTA, 5.4 mM MgCl₂, 10 mM HEPES (pH 7.4) z 2.5 mM K₂ATP i 0.3 μM Li₂GTP.

Przygotowujemy roztwór do elektrody bez ATP i GTP. Oddzielnie przygotowujemy alikwoty ATP i GTP, które są przechowywane w temperaturze -80°C, i dodajemy je do roztworu do elektrody w dniu eksperymentu. Strzykawkę z końcowym roztworem do elektrody przechowujemy na lodzie, aby zachować stabilność ATP/GTP. Roztwory wewnętrzne i zewnętrzne filtrujemy sterylnie (0,2 μm), aby zapobiec wzrostowi mikroorganizmów i zmniejszyć ryzyko zapchania rurek oraz elektrody.

4.2 Wytciąganie elektrod

Używamy dwustopniowej pionowej wyciągarki Narishige oraz elektrod z borokrzemianowego szkła firmy Warner Instrument (średnica zewnętrzna 1,5 mm, średnica wewnętrzna 0,86 mm i długość 7,5 cm), aby uzyskać elektrody o oporności od 3 do 7 MΩ po napełnieniu roztworem wewnątrzkomórkowym.

Uwaga: Konieczne jest eksperymentalne ustalenie parametrów dla wyciągacza elektrod oraz rodzaju szkła elektrodowego w Twoim laboratorium. W przypadku naszego wyciągacza pionowego stosujemy ustawienie temperatury 60,2 dla pierwszego wyciągnięcia i ~43 dla drugiego wyciągnięcia.

4.3 Patch clamp w konfiguracji whole-cell

1. Zamocuj szkiełko nakrywkę w 35 mm szalce za pomocą niewielkiej ilości wazeliny, zalej roztworem zewnętrznym i umieść szalkę na stole odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego. Użyj DIC do ustawienia ostrości i znalezienia komórek, a następnie przełącz na fluorescencję YFP, aby zlokalizować komórki wykazujące ekspresję YFP.
2. Ustaw końcówkę manifoldu perfuzyjnego w pobliżu zielonej komórki (20-30 μm od komórki docelowej, co odpowiada 2-3 długościom komórki).
3. Wypełnij elektrody roztworem i podłącz je do głowicy wzmacniacza Axopatch 200B (Axon Instruments) z następującymi ustawieniami początkowymi: Gain 1, Configuration: whole-cell β=1, mode V-clamp.
4. Przyłoź dodatnie ciśnienie do elektrody, aby zapobiec zapchaniu pipety, a następnie za pomocą manipulatora umieść końcówkę elektrody tuż nad komórką.
5. Aby wyzerować potencjał pipety, wybierz przycisk Seal Test w celu podania testowego skoku napięcia. Prostokątny skok napięcia o wartości 5 mV pojawi się w oknie Seal Test programu Clampex. Dostosuj potencjometr Pipette Offset we wzmacniaczu, aby sprowadzić prąd bazowy do 0 nA. Alternatywnie, wyzeruj potencjał pipety, przełączając selektor trybu wzmacniacza na tryb V-track, a pokrętło miernika na Vtrack, i użyj potencjometru Pipette Offset we wzmacniaczu, aby ustawić wartość na wyświetlaczu miernika wzmacniacza na „0.00”.
6. Sprawdź rezystancję elektrody, korzystając z funkcji seal test w oprogramowaniu Clampex 8.2 (powinna wynosić 3-7 MΩ).
7. Otwórz zapisany plik protokołu lub utwórz nowy. Aby otworzyć plik protokołu, wybierz z menu głównego Acquire, następnie Open Protocol i wybierz zapisany plik protokołu napięciowego. W tym eksperymencie protokół został stworzony tak, aby utrzymywać potencjał błonowy na poziomie -40mV, podać pojedynczy 50 ms skok napięcia do -100 mV, a następnie rampę do +40 mV w czasie 200 ms. Protokół ten jest wykonywany co 2 sekundy. Protokół rampowy pozwala na obserwację potencjału odwrócenia i prostowania dośrodkowego kanałów GIRK. W przypadku kanałów jonowych sterowanych napięciem bardziej odpowiedni może być prostokątny skok napięcia.
8. Zbliż się do komórki, korzystając z precyzyjnej regulacji manipulatora, zwolnij dodatnie ciśnienie, a po dotknięciu powierzchni komórki przyłoź ciśnienie ujemne i monitoruj wzrost rezystancji w oknie oscyloskopu Seal Test. Gdy rezystancja osiągnie zakres GΩ, elektroda zostanie uszczelniona na błonie (powstał tzw. Gigaseal).
9. Przyłoź impuls ujemnego ciśnienia, aby przerwać błonę komórkową i uzyskać dostęp do wnętrza komórki. Po przejściu do konfiguracji whole-cell zarejestrujesz wzrost prądów pojemnościowych.
10. Przełącz się na Membrane Test w programie Clampex i zapisz rezystancję dostępu Ra, rezystancję błony Rm, pojemność błony Cm oraz zweryfikuj wzrokowo dopasowanie wykładnicze teoretycznej krzywej do rzeczywistego prądu pojemnościowego. Pojemność błony jest proporcjonalna do wielkości komórki i zostanie później wykorzystana do obliczenia gęstości prądu.
11. Przełącz się z powrotem na Seal Test, ustaw V-Out (potencjał błonowy) na -40 mV i filtr na 10 kHz.
12. Kompensuj pojemność błony i rezystancję szeregową we wzmacniaczu w następujących krokach:
    1. Włącz przełącznik WHOLE CELL CAP. Reguluj pokrętłami WHOLE CELL CAP i SERIES RESISTANCE w przód i w tył, aż uzyskasz płaski impuls testowy. Może być konieczna również regulacja pokrętła pojemności pipety FAST CAP.
    2. Ustaw pokrętło % PREDICTION na około 60-80%, ponownie regulując WHOLE CELL CAP oraz pokrętło SERIES RESISTANCE (może być konieczna również regulacja pokrętła kompensacji pojemności pipety FAST CAP).
    3. Ustaw % COMP- na 100% bez wywoływania oscylacji komórki, starając się utrzymać płaski impuls poprzez ponowną regulację WHOLE CELL CAP i SERIES RESISTANCE (może być konieczna również regulacja pokrętła kompensacji pojemności pipety FAST CAP). Dostosuj lag, zmniejszając stałą czasową.
    4. Zapisz w notatniku wartości Cm (pojemność błony), Rs (rezystancja szeregowa), %COMP, %PRED oraz czas opóźnienia (Lag time) ustawione we wzmacniaczu. Wartości Cm i Rs powinny być w przybliżeniu takie same jak Cm i Rm zmierzone wcześniej w Membrane Test.
13. Otwórz zawór roztworu zewnętrznego, aby kontrolować roztwór w kąpieli. Ustaw 8-biegunowy filtr Bessela we wzmacniaczu na 2kHz, otwórz protokół clampy napięciowej i rozpocznij rejestrację prądów.
14. Rejestrujemy prądy GIRK przy użyciu protokołu rampowego, który obejmuje skok do -100 mV przez 50 ms, a następnie rampę od -100 mV do +40 mV w czasie 200 ms, podawaną co 2 sekundy. Protokół rampowy pozwala na obserwację potencjału odwrócenia i właściwości prostowania dośrodkowego kanałów GIRK. W temperaturze pokojowej (22-25° C) prąd GIRK powinien odwrócić się w pobliżu -50 mV (przy 20 mM KCl w kąpieli), co jest bliskie obliczonemu potencjałowi równowagi dla K (E_K = -50 mV), a następnie pozostać w miarę płaski przy potencjałach dodatnich względem E_K.
15. Protokół eksperymentalny: Po zarejestrowaniu stabilnej linii bazowej przełącz na roztwór 20K + Karbachol i poczekaj na szczyt odpowiedzi, wróć do roztworu kąpieli 20K, następnie przyłoź 20K + Etanol i poczekaj na szczyt odpowiedzi, wróć do roztworu kąpieli 20K, a na koniec przełącz na roztwór 20K + Ba²⁺. Podczas aplikacji tych leków zauważysz zmiany w amplitudzie prądów GIRK (najbardziej wyraźne przy -100 mV). Zanotuj w notatniku numer śladu odpowiadający aplikacji różnych roztworów zewnątrzkomórkowych. Pojedynczy plik Clampfit będzie zawierał wszystkie przebiegi dla całego eksperymentu.

5. Analiza danych

Do analizy danych dotyczących prądów GIRK przy -100 mV wykorzystujemy oprogramowanie Clampfit 9.2.

1. Otwórz plik z zapisem, ustaw kursor na -100 mV. Domyślnie wszystkie ślady będą widoczne na ekranie w formie nałożonej. Po kliknięciu ikony „Write cursors” zostanie utworzony arkusz kalkulacyjny z danymi numerycznymi w formacie Excel.
2. Przypisując oś X do kolumny z numerami śladów, a oś Y do kolumny z kursorami i klikając ikonę „Create Graph”, można szybko narysować wykres przebiegu czasowego eksperymentu.
3. Oblicz prąd podstawowy, odejmując prąd w obecności Ba²⁺ od prądu zarejestrowanego w samym roztworze perfuzyjnym („prąd 20K” minus „prąd 20K + Ba²⁺”). Oblicz prądy indukowane, odejmując prąd podstawowy w 20K od prądów aktywowanych („prąd 20K + karbachol” minus „prąd 20K”; „prąd 20K + etanol” minus „prąd 20K”). Oblicz gęstość prądu (pA/pF), dzieląc prąd przez pojemność błony (odczytaną bezpośrednio z wzmacniacza). Oblicz procent aktywacji, dzieląc prądy indukowane przez prądy podstawowe i mnożąc wynik przez 100.

6. Reprezentatywne wyniki

Powinieneś być w stanie zarejestrować prądy z komórek transfekowanych kanałami typu dzikiego. W przypadku kanałów GIRK mierzonych w roztworze zewnątrzkomórkowym zawierającym 20 mM K⁺ (oraz 145 mM K⁺ wewnątrzkomórkowo), powinny one wykazywać silną prostowanie do wewnątrz oraz potencjał odwrócenia wynoszący ~ -50 mV, co jest kluczową właściwością kanałów potasowych. Prąd typu dzikiego będzie silnie wzrastał po zastosowaniu karbacholu (3-5 krotny wzrost w stosunku do prądu bazowego) i podobnie reagował na 100 mM etanolu. Uwaga: w elektrofizjologii przyjęto konwencję znaków, zgodnie z którą prąd wewnątrzkomórkowy jest ujemny, a prąd zewnątrzkomórkowy jest dodatni. W przypadku mutacji L257W w kieszeni wiążącej alkohol kanału GIRK2, zaobserwujesz osłabione odpowiedzi zarówno na karbachol, jak i etanol. Sugeruje to, że L257 bierze udział w aktywacji kanałów GIRK2 przez alkohol i białka G. Dalsze przykłady wyników mutogenezy GIRK2 można znaleźć w niedawnej publikacji Aryal et al.¹.

Rycina 1. Okno programu Clampfit 8.0 przedstawia plik danych z rejestracji GIRK2 typu dzikiego. Górny lewy panel pokazuje nałożone na siebie przebiegi zarejestrowane w odpowiedzi na protokół rampowy napięcia w obecności różnych zewnętrznych roztworów Ba. Kursor 1 jest ustawiony na -100 mV. Wartości kursora są zapisane w arkuszu kalkulacyjnym (prawy panel). Dolny lewy panel przedstawia wykres numeru przebiegu w funkcji prądu. Zwróć uwagę na wzrost prądu (odchylenie w dół) przy zastosowaniu etanolu (EtOH) i karbacholu (Carb) oraz inhibicję prądu przez Ba²⁺.

Rycina 2. Okno programu Clampfit 8.0 przedstawia plik danych z pomiaru mutantu GIRK2-L257W. Opisy są takie same jak na Rycini 1. Zwróć uwagę na brak aktywacji karbacholem (Carb) oraz redukcję prądów indukowanych przez EtOH w kanałach mutantowych.

Dyskusja

Mutageneza celowana jest klasycznym podejściem do badania relacji struktura-funkcja kanałów jonowych. Opiera się ona na założeniu, że poprzez zmianę krytycznego reszty aminokwasowej kanału jonowego powinno być możliwe zaobserwowanie wyraźnych zmian w funkcji kanału. W przeciwieństwie do tego, wiele mutacji w pozycjach niekrytycznych można wprowadzić bez istotnych zaburzeń funkcji kanału. Typowo, rozważaną resztę mutuje się najpierw na alaninę, mały aminokwas niepolarny, a następnie na tryptofan, największy z aminokwasów². Jeśli reszta jest istotna dla funkcji kanału, obie mutacje zmienią aktywność kanału. W przypadku zmutowania reszty mniej istotnej, efekty mutacji, zwłaszcza na alaninę, są często niezauważalne. Mutacje na tryptofan częściej powodują zmiany ze względu na zawadę steryczną związaną z rozmiarem tryptofanu. Często, w przypadku braku informacji strukturalnych, do zlokalizowania krytycznych reszt można wykorzystać systematyczną mutację na alaninę lub tryptofan w obrębie fragmentu kanału (tzw. skanowanie alaninowe lub tryptofanowe). Ważne jest, aby zauważyć, że równolegle można przygotować wiele klonów z różnymi mutacjami punktowymi, co pozwala na przetestowanie wielu reszt w stosunkowo krótkim czasie. Niedawno udostępnionych zostało wiele struktur krystalicznych kanałów^3,4,5. Mogą one służyć do zaproponowania potencjalnych kluczowych reszt do przetestowania przy użyciu podejścia opisanego w niniejszym protokole.

Pomiary kanału typu dzikiego powinny zawsze towarzyszyć pomiarom kanału zmutowanego, aby służyć jako kontrola pozytywna potwierdzająca prawidłowe przeprowadzenie transfekcji oraz eksperymentów elektrofizjologicznych. Mutacje punktowe mogą prowadzić do braku funkcjonalnego prądu, prądu zbliżonego do typu dzikiego lub zmienionej regulacji aktywności kanału. Brak mierzalnego prądu może wynikać z nieprawidłowego fałdowania białka lub zaburzonego transportu wewnątrzkomórkowego. W takim przypadku pomocne może być ustalenie, czy kanał jest prawidłowo transportowany na powierzchnię komórki, z wykorzystaniem testu z biotinylacją lub barwienia immunofluorescencyjnego przeciwko znacznikowi zewnątrzkomórkowemu (bez permeabilizacji komórek), aby odróżnić niefunkcjonalne kanały znajdujące się w błonie plazmatycznej od kanałów zatrzymanych wewnątrz komórki. Na koniec zaleca się zbadanie nie tylko aktywności podstawowej kanału, ale także wpływu mutacji na jego regulację. W zależności od badanego kanału jonowego można badać różne mechanizmy modulacji funkcji kanału, w tym regulację przez białka G, PIP2, jony, stężenie ATP, fosforylację (przy użyciu mutacji tyrozyny, seryny lub treoniny), ubikwitynację lub sumoilację (przy użyciu mutacji lizyny) oraz bezpośrednie otwieracze lub blokery kanałów.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Odczynniki chemiczne	Sigma	Zmienne
Zestaw do mini-preparacji	Qiagen	27104
Radiacwash	Biodex	005-100
Hydrobromek poli-D-lizyny	BD Biosciences	CB40210	Można również zastosować poli-L-lizynę
Zestaw do Maxi Prep	Qiagen	12263
Zestaw do mutagenezy kierowanej QuickChange XL II Site Directed Mutagenesis Kit	Stratagene	200512-5
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668-027
Szkiełka nakrywki ˆ… 12 mm	Warner Instruments	CS-12R
Kapilary szklane borokrzemianowe o standardowej ściance	Warner Instruments	G150-3
Odwrócony mikroskop fluorescencyjny	Leica	DMI3000 B
Elektrofizjologia	Nikon/ Leica/ Zeiss	Dowolny odwrócony mikroskop DIC (Hoffmann) mikroskop fluorescencyjny
Wzmacniacz	Molecular Devices	Wzmacniacz Axon Axopatch 200B
System perfuzyjny	Warner Instruments	VC-6 Perfusja MM-6
Digitalizator	Molecular Devices	digitalizator Digidata 1320
Manipulatory	Sutter Instruments	Manipulator: MP-85
Wyciągacz elektrod	Narishige	pionowy wyciągacz elektrod PC10
Tabela izolacji	Technical Manufacturing Corporation	Stół pneumatyczny