Ocena rozkładu przestrzennego $\gamma$H2AX po napromieniowaniu jonizującym

Podsumowanie

Analiza mikroskopowa ognisk γH2AX, które tworzą się po fosforylacji H2AX w Ser-139 w odpowiedzi na pęknięcia dwuniciowe DNA, stała się nieocenionym narzędziem w radiobiologii. W niniejszej pracy wykorzystaliśmy przeciwciało przeciwko monometylowanej histonie H3 w lizynie 4 jako marker epigenetyczny aktywnie transkrybowanej euchromatyny, aby ocenić przestrzenną dystrybucję powstawania indukowanych promieniowaniem ognisk γH2AX w jądrze komórkowym.

Streszczenie

Wczesną odpowiedzią molekularną na pęknięcia obu nici DNA (DSBs) jest fosforylacja reszty Ser-139 w terminalnym motywie SQEY histony H2AX^1,2. Fosforylacja H2AX jest pośredniczona przez białka z rodziny kinaz fosfatydyloinozytolo-3-fosfatazy (PI3K), kinazę ATM (ataxia telangiectasia mutated), katalityczną podjednostkę kinazy DNA-PK oraz kinazę ATR (ATM and RAD3-related)³. Fosforylowana forma H2AX, określana jako γH2AX, rozprzestrzenia się z miejsca pęknięcia DSB na sąsiednie regiony chromatyny, tworząc dyskretne ogniska, które można łatwo zwizualizować za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej³. Analiza i kwantyfikacja ognisk γH2AX jest szeroko stosowana do oceny powstawania i naprawy DSB, szczególnie w odpowiedzi na promieniowanie jonizujące oraz do oceny skuteczności różnych związków modyfikujących działanie promieniowania i związków cytotoksycznych⁴.

Biorąc pod uwagę wyjątkową specyficzność i czułość tego nowego markera DSB, dostarczył on nowych informacji na temat procesów uszkadzania i naprawy DNA w kontekście chromatyny. Na przykład w radiobiologii głównym paradygmatem jest przekonanie, że jądrowe DNA stanowi krytyczny cel w odniesieniu do wrażliwości na promieniowanie. Rzeczywiście, powszechny konsensus w tej dziedzinie w dużej mierze postrzegał chromatynę jako jednorodną matrycę dla uszkodzeń i naprawy DNA. Jednakże, przy użyciu γH2AX jako markera molekularnego DSB, zaobserwowano różnice w tworzeniu ognisk γH2AX indukowanych promieniowaniem gamma w euchromatynie i heterochromatynie^5-7. Niedawno wykorzystaliśmy panel przeciwciał przeciwko mono-, di- lub tri-metylowanej histonie H3 przy lizynie 9 (H3K9me1, H3K9me2, H3K9me3), które są epigenetycznymi odciskami konstytutywnej heterochromatyny i wyciszania transkrypcyjnego, oraz lizynie 4 (H3K4me1, H3K4me2, H3K4me3), które ściśle korelują z aktywnie transkrybowanymi regionami euchromatycznymi, aby zbadać przestrzenną dystrybucję γH2AX po promieniowaniu jonizującym⁸. Zgodnie z obowiązującymi koncepcjami dotyczącymi biologii chromatyny, nasze wyniki wykazały ścisłą korelację między formowaniem się γH2AX a aktywną transkrypcją⁹. W niniejszej pracy prezentujemy naszą metodę immunofluorescencji do wykrywania i ilościowego oznaczania ognisk γH2AX w komórkach nieprzytwierdzających, ze szczególnym uwzględnieniem kolokalizacji z innymi markerami epigenetycznymi, analizy obrazu i modelowania 3D.

Protokół

Przygotowanie komórek

1. Ludzkie komórki erytroleukemiczne K562 hoduje się w pożywce RPMI-1640 uzupełnionej o 10% (v/v) płodowej surowicy bydlęcej oraz 20 mg/ml gentamyciny, w wilgotnym środowisku z 5% CO₂ w temperaturze 37°C.
2. Około 18 godzin przed barwieniem komórki w fazie wzrostu wykładniczego (optymalnie 5 x 10⁵ komórek/ml) należy przemyć solą fizjologiczną z buforem fosforanowym (PBS), resuspender w świeżej pożywce i przenieść z powrotem do inkubatora w temperaturze 37°C i 5% CO₂.
3. Komórki należy przemyć dwukrotnie PBS-em poprzez wirowanie przy prędkości około 150 obr./min przez 5 minut, a następnie resuspender w świeżej pożywce.
4. Należy policzyć komórki i dostosować ich gęstość do wartości około 5 x 10⁵ komórek/ml.

Komórki można liczyć metodą zautomatyzowaną (np. za pomocą liczników Sysmex lub Coulter z filtrem o rozmiarze od 5 do 20 mikronów) lub stosując metodę wykluczania błękitu trypanowego i komorę countingową (haemocytometr). Zbyt duża liczba komórek (>80 cells/cm²) może prowadzić do niejednorodnego barwienia.

Naświetlanie i barwienie immunofluorescencyjne

1. Przygotuj klipy do wirówki cytospin, karty filtracyjne oraz szkiełka z odpowiednimi etykietami.

Podczas montażu aparatury do cytospinowania należy upewnić się, że otwór w karcie filtracyjnej pokrywa się z lejkiem.

2. Poddać komórki działaniu promieniowania γ lub promieni rentgenowskich (w tym przykładzie 2Gy).

Aby zapobiec powstawaniu ognisk podczas naświetlania, należy trzymać komórki w lodzie od 5 do 10 minut przed oraz w trakcie naświetlania.

Po napromieniowaniu inkubuj komórki w temperaturze 37°C, przy 5% CO₂ przez wymagany czas (aby uzyskać szczytowe poziomy γH2AX: od 30 minut do 1 godziny; w tym przykładzie 1 godzina).

3. Przemyć komórki dwukrotnie zimnym PBS poprzez wirowanie, a następnie zawiesić je ponownie w świeżym PBS.
4. Nanieść od 100 do 150 μL zawiesiny komórkowej do każdego lejka cytocentryfugi i wirować przy 500 rpm przez 5 minut.
5. Wyjąć preparaty z cytocentryfugi i pozostawić komórki do umiarkowanego wysuszenia na powietrzu przez około 15 minut.

Nie dopuścić do całkowitego wyschnięcia komórek, ponieważ może dojść do rozpadu morfologii komórkowej.

6. Obrysować komórki okręgiem za pomocą hydrodynamicznego pisaka.
7. Utrwalić komórki w 4% paraformaldehydzie przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT).

W naszym doświadczeniu utrwalanie paraformaldehydem jest skuteczniejsze niż utrwalanie etanolem lub metanolem. Komórki w zawiesinie wymagają utrwalania przez 5 minut w RT, natomiast w przypadku komórek adherentnych do optymalnego utrwalenia wymagany jest dłuższy czas (od 15 do 20 minut).

Stwierdzono, że barwienie bezpośrednio po utrwaleniu daje lepsze wyniki niż przechowywanie utrwalonych preparatów w temperaturze -20°C, co zazwyczaj skutkuje wysoką fluorescencją tła.

8. Przemyć komórki dwukrotnie buforem PBS, po 5 minut każdego płukania.
9. Przeprowadzić permeabilizację komórek przy użyciu 0,1% Triton-X 10 w temperaturze pokojowej przez 5 minut.

W porównaniu z Tween-80 zazwyczaj obserwujemy silniejsze sygnały w komórkach permeabilizowanych za pomocą Triton-X 100. W zależności od typu komórek może być konieczna zmiana czasu permeabilizacji. Na przykład w komórkach K562 permeabilizacja przez 5 minut w RT jest wystarczająca, podczas gdy w komórkach adherentnych wymagana jest 15-minutowa permeabilizacja.

10. Przemyć komórki trzy razy PBS, każdorazowo przez 5 minut.
11. Zablokować komórki w 1% BSA przez 30 minut (3 x 10 minut) w temperaturze pokojowej.

Porównaliśmy wydajność blokowania z użyciem surowicy (pochodzącej z tego samego gatunku co przeciwciała wtórne) oraz albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w PBS. BSA okazała się bardziej wydajna w minimalizowaniu niespecyficznego wiązania przeciwciał wtórnych w porównaniu z surowicą. Porównaliśmy różne czasy blokowania: blokowanie przez noc w temperaturze 4°C w zestawieniu z blokowaniem w trzech 10-minutowych oraz trzech 20-minutowych krokach w temperaturze pokojowej, i ustaliliśmy, że optymalnym rozwiązaniem było blokowanie w trzech 10-minutowych krokach.

12. Nanieść 50 μL przeciwciała pierwszorzędowego (rozcieńczonego 1:50 w 1% BSA) na każdy preparat.

Inkubacja z przeciwciałem pierwszorzędowym w temperaturze pokojowej przez 60 minut pozwala na zmniejszenie tła barwienia w porównaniu do inkubacji przez noc w temperaturze 4°C.

13. Aby jednocześnie barwić różne markery, należy użyć przeciwciał wytworzonych w różnych gatunkach (np. mysich anty-γH2AX i króliczych anty-metylowanych H3K4 w tym przykładzie).
14. Inkubować z przeciwciałami pierwszorzędowymi przez 90 minut w temperaturze pokojowej na platformie kołyszącej przy 250 rpm.

Wszystkie inkubacje przeprowadzane są w nawilżonej kuwecie do barwienia.

15. Przemyj komórki trzy razy buforem PBS, po 5 minut każdego płukania.
16. Dodaj 50 μL przeciwciała wtórnego (rozcieńczonego 1:10 w 1% BSA) na każdy preparat.

Aby barwić różne markery na tym samym preparacie, należy zastosować przeciwciała wtórne o różnej specyficzności gatunkowej (zgodnie z przeciwciałem pierwotnym) i różnej długości fali emisji fluorescencji (np. anty-mysi Alexa 48 (zielony) i anty-króliczy Alexa-546 (czerwony) w tym przykładzie).

17. Inkubować komórki przez 60 minut w temperaturze pokojowej (RT) na platformie kołyszącej przy 250 rpm.

Zaleca się inkubację komórek w ciemnej, wilgotnej komorze, aby zapobiec blaknięciu i wysychaniu przeciwciała wtórnego.

18. Przemyć komórki trzykrotnie PBS, każdorazowo przez 5 minut.
19. Do każdego preparatu dodać 50 μL TOPRO-3 (rozcieńczonego w PBS w stosunku 1:50).
20. Przemyć preparaty PBS trzykrotnie przez 5 minut.
21. Usunąć nadmiar wilgoci z preparatów i dodać roztwór przeciwpłowieniowy (anti-fade).

Zaleca się, aby nie wysuszać komórek całkowicie przed dodaniem roztworu przeciwblaknącego.

22. Przykryć szkiełkiem przedmiotowym, uszczelnić lakierem do paznokci i pozostawić preparaty na noc w ciemności w temperaturze pokojowej.

Zaleca się stosowanie specjalistycznych szkiełek nakrywkowych do mikroskopii konfokalnej nr 1,5 (o grubości 0,16-19 mikronów) oraz bezbarwnego lakieru do paznokci.

Podczas nakładania szkiełka nakrywkowego na preparat należy zachować ostrożność, aby uniknąć powstania pęcherzyków powietrza.

Akwizycja obrazu

1. Do obrazowania wykorzystano konfokalny mikroskop Zeiss LSM510 Meta z zastosowaniem standardowych laserów GFP (zielony, 48 nm), PI (czerwony, 543 nm) oraz dalekiej czerwieni (niebieski, 63 nm).

Obrazy uzyskane za pomocą mikroskopu konfokalnego wykazują lepszą rozdzielczość przestrzenną.

Ponieważ rozmiar ognisk γH2AX może być mniejszy niż 0,5 μm, zaleca się wykonywanie obrazowania z krokiem wzdłuż osi Z wynoszącym co najmniej 0,5 μm.

Zaleca się stosowanie obiektywu imersyjnego 63x zamiast większych lub mniejszych powiększeń. W przypadku obrazowania wielu komórek w celu zliczania ognisk (foci) preferowane jest zastosowanie prędkości skanowania 8 oraz rozmiaru obrazu 1024 x 1024 piksele. Aby zilustrować relacje przestrzenne między różnymi białkami jądrowymi, zaleca się zastosowanie prędkości skanowania 6 przy rozmiarze obrazu 2048 x 2048 piksele.

Przy obrazowaniu z wielu kanałów zaleca się stosowanie akwizycji skanowania liniowego zamiast skanowania klatkowego. Pozwala to uniknąć blaknięcia i uzyskać lepszą rozdzielczość. Skanowanie sekwencyjne jest stosowane w celu zapobiegania przenikaniu sygnału między kanałami.

Liczenie ognisk

Analizę obrazów i liczenie ognisk można przeprowadzić przy użyciu różnych pakietów oprogramowania (w tym Metamorph, Image-J i Imaris). Poniżej opisano procedurę liczenia ognisk z wykorzystaniem programu Metamorph.

1. Otwórz stosy obrazów γH2AX bezpośrednio z menu plików lub korzystając z opcji budowania stosów numerowanych (build number stacks).
2. Przejdź do menu Process i wybierz Stack Arithmetic.
3. Wybierz Maximum projection, zaznacz płaszczyzny, które mają zostać uwzględnione, i kliknij OK.
4. Zapisz otrzymany obraz jako plik γH2AX Tiff. i otwórz obraz TOPRO-3 (niebieski).
5. Przejdź do sekcji Regions, wybierz narzędzie do rysowania obszarów i obrysuj jądra komórkowe.
6. Kliknij obraz γH2AX Tiff, przejdź do menu Process i wybierz Morphological Filters.
7. Wybierz Top-Hat i wskaż obraz γH2AX jako obraz źródłowy.
8. Zastosuj filtr Top-Hat; otrzymany obraz będzie obrazem binarnym z mniejszą ilością szumów i zredukowaną zmiennością intensywności ognisk (foci).

Należy zachować ostrożność podczas wyboru wartości Top-Hat. Optymalne wartości można uzyskać poprzez wizualne porównanie obrazów przed i po zastosowaniu filtrów.

9. Przejdź do menu procesów (process menu) i wybierz progowanie obrazu (threshold image).
10. Wybierz progowanie inkluzywne (inclusive threshold) i określ wartości dolnego oraz górnego progu.

Zazwyczaj to wartości progowe wpływają na liczbę ognisk. Dlatego podczas wyboru wartości progowych należy zachować szczególną ostrożność. Najlepiej można to osiągnąć, licząc liczbę ognisk przy użyciu różnych wartości progowych w komórkach poddanych promieniowaniu γ poniżej 2 Gy, a następnie porównując otrzymane wyniki z liczeniem ręcznym (wizualnym). Optymalna wartość progowa to taka, która minimalizuje uwzględnienie tła i maksymalizuje wykrywalność ognisk.

11. Wybierz obraz TOPRO-3, przejdź do menu regionów i wybierz opcję przenoszenia regionów (transfer regions). Jako obraz źródłowy wybierz TOPRO-3, jako obraz docelowy wybierz Top-Hat, a następnie kliknij OK.
12. Po przeniesieniu obszarów jąder na obraz Top-Hat należy przejść do menu pomiarów (measure menu) i wybrać Zintegrowaną Analizę Morfometryczną (Integrated Morphometry Analysis).
13. W oknie wyskakującym wybierz obraz źródłowy – Top-Hat i pomiar według powierzchni.
14. Wybierz opcję „measure all regions” (pomierz wszystkie obszary) i kliknij „measure” (pomierz), aby uzyskać liczbę ognisk we wszystkich odpowiadających im jądrach na obrazie Top-Hat.
15. Liczba ognisk z każdego regionu może zostać wyeksportowana do pliku MS-Excel przy użyciu opcji log-data.

Rekonstrukcja 3D obrazów

Aby stworzyć obraz 3D ze stosu zdjęć za pomocą programu Metamorph:

1. Przejdź do menu stosu (stack menu) i wybierz rekonstrukcję 3D.
2. Wybierz kąt obrotu (np. 160°, 320°).
3. Wybierz typ rekonstrukcji 3D – maksimum (maximum).
4. Wybierz płaszczyznę obrotu (poziomą lub pionową).
5. Wybierz odległość kalibracji osi Z.

Zaleca się stosowanie określonej przez użytkownika odległości Z (optymalna wartość to 0,5 μicrons).

6. Wybierz OK, aby utworzyć rekonstrukcję 3D.

Analiza skanowania liniowego

W przypadku analizy skanowania liniowego przy użyciu programu Metamorph:

1. Otwórz obraz z jednej płaszczyzny lub plik typu stack.
2. Przejdź do paska narzędzi pomiarowych i wybierz opcję analizy skanowania liniowego (line scan analysis).
3. Narysuj linię przecinającą komórkę, co automatycznie wyświetli intensywność fluorescencji oraz odległość każdego markera wzdłuż przebiegu linii.

Aby wyjaśnić zależności przestrzenne między różnymi markerami chromatyny, na przykład ogniskami γH2AX a metylacją histonów, zaleca się wyznaczenie linii przechodzących przez obszary zarówno o dużym, jak i niskim zagęszczeniu tych markerów.

Reprezentatywne dane

Na potrzeby niniejszej demonstracji wykorzystano przeciwciała przeciwko ogniskom γH2AX oraz H3K4me, aby ocenić rozmieszczenie przestrzenne DSB względem epigenetycznego wyznacznika aktywnie transkrybowanej euchromatyny. Jak pokazano na rysunku 1, po napromieniowaniu dawką 2Gy, ogniska γH2AX tworzyły się głównie w obszarach słabo barwionych zarówno dla H3K4me, jak i dla barwnika DNA TOPRO-3 (intensywnie zabarwione obszary DNA wskazują na obecność heterochromatyny).

Rycina 1. Ogniska γH2AX tworzą się przede wszystkim w euchromatynie w odpowiedzi na promieniowanie jonizujące. (A) Wizualizacja immunofluorescencyjna ognisk γH2AX (zielone) w ludzkich komórkach erytroleukemicznych K562, 1 godzinę po naświetlaniu promieniami γ (2 Gy). Ogniska γH2AX przedstawiono w relacji do H3K4me, reprezentującego aktywnie transkrybowaną euchromatynę (czerwone). DNAa znakowano TOPRO-3 (niebieskie). Nałożony obraz (niebieski, czerwony i zielony) wykazuje brak ognisk γH2AX w obszarach heterochromatycznych. Analiza skanu liniowego (intensywność fluorescencji względem odległości) wskazuje względny rozkład markerów w jednej płaszczyźnie. (B) Przekroje w różnych płaszczyznach z rekonstrukcji 3D opisanego powyżej nałożonego obrazu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Roswell Park Memorial Institute -1640 (RPMI-1640)	Pożywka wzrostowa	Invitrogen	22400071	pożywka RPMI-1640, pH 7,4 uzupełniona o 10% (v/v) płodowej surowicy bydlęcej, 2 mM L-glutaminy, 20μg/ml gentamycyny, 20mM (HEPES) N-2-hydroksyetylopiperazyna-N’Kwas 2-etanosulfonowy
płodowa surowica bydlęca (FBS)		Sigma-Aldrich	F2442
Albumin surowicy bydlęcej (BSA)		Sigma-Aldrich	A7906	BSA (1%) stosuje się w celu zablokowania nieswoistego wiązania przeciwciał. Przeciwciała pierwotne i wtórne rozcieńcza się w BSA.
PBS (bez Ca2+)2+ oraz Mg2+)		Invitrogen	17-517Q
Błękit trypanowy		Sigma-Aldrich	T6146	Stosowane do rozróżnienia komórek żywych i martwych.
Triton X-100	Odczynnik	Sigma-Aldrich	T8787	Triton X-100 (0,1%) stosowany do permeabilizacji komórek.
Paraformaldehyd	Odczynnik	Sigma-Aldrich	158127	Paraformaldehyd (4%) stosowany do utrwalania komórek.
Mysia monoklonalna przeciwciało anty-fosfo histone-H2AX	Przeciwciało pierwotne	EMD Millipore	16193	Rozcieńczenie przeciwciała pierwszorzędowego (1:500) w 1% BSA.
Histona H3 (monometylok4)	Przeciwciało pierwszorzędowe	Abcam	AB8895
Alexa Fluor 488 kozie przeciwciało przeciwko mysiemu IgG (H+L)	Przeciwciało wtórne	Invitrogen	11029	Rozcieńczenie przeciwciała wtórnego (1:500) w 1% BSA.
przeciwciało kozie anty-królicze IgG (H+L) znakowane Alexa Fluor 546	Przeciwciało wtórne	Invitrogen	11035
TOPRO3	Barwienie DNA	Invitrogen	T3605	TOPRO3 jest barwnikiem do DNA o maksymalnych długościach fali absorpcji i emisji (Abs/Em) wynoszących odpowiednio 642 i 661 nm. W przypadku, gdy mikroskop konfokalny jest wyposażony w laser o długości fali 405 nm, można zastosować DAPI.
ProLong Gold	Roztwór przeciwwyblakaniowy	Invitrogen	P36930	Tego medium montażowego na bazie glicerolu należy używać z obiektywem imersyjnym olejowym o dopasowanym współczynniku załamania światła.
Lamelki pokryte polilizyną		Menzel-Glaser
Kryszalki (22x50 mm)	Szkiełka nakrywki	Menzel-Glaser	CS2250100
Kolba do hodowli tkankowych, z nakrętką z filtrem	Kolba hodowlana	BD Biosciences	353112
Shandon Cytospin 4		Thermo Fisher Scientific, Inc.
Cytolejki		Shandon, Inc.
Karty filtrujące		Shandon, Inc.	353025
naczynie Coplin, szklane		Grale Scientific P/L	1771-OG
Kuweta do barwienia		Grale Scientific P/L	V1991.99
pisak PAP		Zymed Laboratories, Inc.	008877
Naświetlacz Gammacell 1000 Elite	Naświetlacz gamma	Nordion International Inc.
Konfokalny mikroskop Zeiss LSM 510 Meta	Mikroskop konfokalny			Wyposażony w 3 lasery: 488 nm, 543 nm i 633 nm.
Metamorfaza	Oprogramowanie do analizy obrazowania	Molecular Devices