$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Przygotowanie komórek
- Ludzkie erytrolokemiczne komórki K562 są hodowane w pożywce RPMI-1640 uzupełnionej 10% (v/v) płodowej surowicy bydlęcej i 20 mg/ml gentamycyny w wilgotnym środowisku o stężeniu 5% CO2 w temperaturze 37°C.
- Około 18 godzin przed barwieniem przemyć wykładniczo rosnące komórki (optymalne przy 5 x 105 komórek/ml) solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), ponownie zawiesić w świeżej pożywce i powrócić do temperatury 37°C, 5% CO2 .
- Przemyć komórki dwukrotnie PBS przez odwirowanie z prędkością około 1500 obr./min przez 5 minut i ponownie zawiesić w świeżych pożywkach.
- Policz komórki i dostosuj gęstość komórek do około 5 x 105 komórek/ml.
Komórki mogą być liczone albo metodą automatyczną (np. licznik Sysmex lub Coulter z filtrem o rozmiarze od 5 do 20 mikronów), albo za pomocą metody wykluczania błękitu trypanowego i hemocytometru.
Nadmierna liczba komórek (>800 komórek/cm2) może prowadzić do niejednorodnego zabarwienia.
Naświetlanie i barwienie immunofluorescencyjne
- Zmontuj klipsy cytospinowe, karty filtracyjne i szkiełka z odpowiednim oznakowaniem.
Podczas montażu aparatu cytospinowego upewnij się, że otwór w karcie filtra pokrywa się z lejkiem.
- Wystaw komórki na działanie promieniowania γ lub promieniowania rentgenowskiego (w tym przykładzie 2Gy).
Aby zapobiec powstawaniu ognisk podczas napromieniowania, trzymaj komórki na lodzie przez 5 do 10 minut przed i podczas napromieniowania.
Po napromieniowaniu inkubuj komórki w temperaturze 37°C, 5% CO2 przez wymagany czas (dla szczytowych poziomów γH2AX 30 minut do 1 godziny; 1 godzina w tym przykładzie).
- Umyć komórki dwukrotnie zimnym PBS przez odwirowanie i ponownie zawiesić w świeżym PBS.
- Dozować od 100 do 150 μl zawiesiny komórek do każdego lejka cytospinowego i wirować z prędkością 500 obr./min przez 5 minut.
- Oddziel szkiełka od cytospinów i pozwól komórkom umiarkowanie wyschnąć na powietrzu przez około 15 minut.
Nie pozwól, aby komórki całkowicie wyschły, ponieważ morfologia komórkowa może ulec dezintegracji.
- Narysuj okrąg wokół komórek za pomocą hydrofobowego pisaka.
- Utrwal komórki za pomocą 4% paraformaldehydu przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT).
Z naszego doświadczenia wynika, że utrwalenie za pomocą paraformaldehydu jest lepsze niż utrwalenie za pomocą etanolu czy metanolu.
Komórki zawiesinowe wymagają utrwalenia przez 5 minut w temperaturze pokojowej, podczas gdy dłuższe czasy fiksacji (15 do 20 minut) są potrzebne do optymalnego utrwalenia przylegających komórek.
Stwierdzamy, że barwienie natychmiast daje lepsze wyniki niż przechowywanie stałych szkiełek w temperaturze -20°C, co zazwyczaj skutkuje wysoką fluorescencją tła.
- Umyj komórki dwukrotnie PBS przez 5 minut każda.
- Przepuszczalność komórek za pomocą 0,1% Triton-X 100 w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
W porównaniu do Tween-80 zazwyczaj obserwujemy lepsze sygnały w komórkach przesiąkniętych Triton-X 100. W zależności od typu ogniwa może być konieczna zmiana czasu przenikania. Na przykład w komórkach K562 wystarczająca jest przepuszczalność przez 5 minut w RT, podczas gdy w komórkach przylegających wymagana jest przepuszczalność 15 minut.
- Przemyj komórki trzykrotnie PBS przez 5 minut każda.
- Zablokuj komórki w 1% BSA na 30 minut (3 x 10 minut) w temperaturze pokojowej.
Porównaliśmy skuteczność blokowania za pomocą surowicy (pochodzącej z tego samego gatunku co przeciwciała drugorzędowe) i albuminy surowicy bydlęcej w PBS. BSA było bardziej skuteczne w minimalizowaniu niespecyficznego wiązania przeciwciał drugorzędowych w porównaniu z surowicą. Porównaliśmy różne czasy blokowania, blokowanie przez noc w temperaturze 4°C w porównaniu z 3 x 10 minut i 3 x 20 minut blokowaniem w temperaturze pokojowej i ustaliliśmy, że blokowanie przez 3 x 10 minut było optymalne.
- Dodać 50 μl przeciwciała pierwszorzędowego (1:500 rozcieńczonego w 1% BSA) do każdego szkiełka.
Inkubacja z pierwotnym przeciwciałem w RT przez 60 minut powoduje zmniejszenie barwienia tła w porównaniu do inkubacji przez noc w temperaturze 4°C.
- Do barwienia różnych markerów jednocześnie stosuje się przeciwciała wyhodowane u różnych gatunków (np. mysi anty-γH2AX i królik anty-metylowany H3K4 w tym przykładzie).
- Inkubować z przeciwciałami pierwszorzędowymi przez 90 minut w temperaturze pokojowej na platformie kołyszącej z prędkością 250 obr./min.
Wszystkie inkubacje wykonywane są w nawilżonym korycie do barwienia.
- Przemyj komórki trzykrotnie PBS przez 5 minut każda.
- Dodać 50 μl (1:1000 rozcieńczonego w 1% BSA) przeciwciała drugorzędowego do każdego szkiełka.
Aby zabarwić różne markery na tym samym szkiełku, użyj przeciwciał wtórnych o różnej specyficzności gatunkowej (zgodnie z przeciwciałem pierwotnym) i długości fali emisji fluorescencji (np. anty-mysz Alexa 488 (zielona) i anty-królicza Alexa-546 (czerwona) w tym przykładzie).
- Inkubuj komórki przez 60 minut w temperaturze pokojowej na platformie kołyszącej z prędkością 250 obr./min.
Zaleca się inkubację komórek w ciemnej, wilgotnej komorze, aby uniknąć blaknięcia i wysuszenia przeciwciała wtórnego.
- Przemyj komórki trzykrotnie PBS przez 5 minut każda.
- Dodać 50 μl (1:500 rozcieńczonego w PBS) TOPRO-3 do każdego szkiełka.
- Myj szkiełka za pomocą PBS przez 3X 5 minut.
- Usuń nadmiar wilgoci ze szkiełek i dodaj roztwór zapobiegający blaknięciu.
Zaleca się, aby nie suszyć całkowicie komórek przed dodaniem roztworu zapobiegającego blaknięciu.
- Szkiełko nakrywkowe, uszczelnić lakierem do paznokci i pozostawić szkiełka na noc w ciemności w temperaturze pokojowej.
Zaleca się stosowanie konfokalnych szkiełek nakrywkowych #1.5 (0.16-19 mikronów grubości) i bezbarwnego lakieru do paznokci.
Podczas umieszczania szkiełka nakrywkowego na szkiełku, należy zachować ostrożność, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków powietrza.
Akwizycja obrazu
- Mikroskop konfokalny Zeiss LSM510 Meta służy do pozyskiwania obrazów za pomocą standardowych laserów GFP (zielony, 488 nm), PI (czerwony 543 nm) i dalekiej czerwonej (633 nm).
Obrazy uzyskane za pomocą mikroskopu konfokalnego ujawniają lepszą rozdzielczość przestrzenną.
Ponieważ rozmiar ognisk γH2AX może być mniejszy niż 0,5 μicron, zaleca się pozyskiwanie obrazów o kroku co najmniej 0,5 μicron wzdłuż osi Z.
Preferowana jest soczewka obiektywowa z 63-krotnym zanurzeniem w oleju w porównaniu do większego lub mniejszego powiększenia.
Do obrazowania wielu komórek w celu zliczania ognisk zaleca się użycie prędkości skanowania 8 i rozmiaru obrazu 1024 x 1024 pikseli. Aby zilustrować relacje przestrzenne między różnymi białkami jądrowymi, zaleca się użycie prędkości skanowania 6 przy rozmiarze obrazu 2048 x 2048 pikseli.
Podczas obrazowania z wielu kanałów, zalecana jest akwizycja skanowania liniowego w porównaniu do skanowania klatek. Pozwala to uniknąć wybielania i osiąga lepszą rozdzielczość. Skanowanie sekwencyjne służy do zapobiegania krwawieniu między kanałami.
Zliczanie ognisk
Analiza obrazu i zliczanie ognisk mogą być wykonywane za pomocą różnych pakietów oprogramowania (w tym Metamorph, Image-J i Imaris). Procedura zliczania ognisk za pomocą Metamorph jest opisana tutaj.
- Stosy obrazów γH2AX można otwierać bezpośrednio z menu plików lub za pomocą opcji stosów numerów kompilacji.
- Przejdź do menu Proces i wybierz arytmetykę stosu.
- Wybierz opcję Maksymalne rzutowanie, wybierz płaszczyzny, które mają zostać uwzględnione, a następnie kliknij przycisk OK.
- Zapisz wynikowy obraz jako plik tiff γH2AX i otwórz obraz TOPRO-3 (niebieski).
- Przejdź do regionów i wybierz narzędzie do rysowania regionów i narysuj regiony wokół jąder.
- Kliknij na obraz tiff γH2AX i przejdź do menu procesu i wybierz filtry morfologiczne.
- Wybierz opcję Top-Hat i wybierz obraz γH2AX jako obraz źródłowy.
- Zastosuj filtr Top-Hat, a wynikowy obraz będzie obrazem binarnym z mniejszą ilością szumów i zmniejszoną zmiennością intensywności ognisk.
Należy zachować ostrożność przy wyborze wartości Top-Hat. Optymalne wartości można uzyskać poprzez wizualne porównanie obrazów przed i po zastosowaniu filtrów.
- Przejdź do menu procesu i wybierz obraz progowy.
- Wybierz próg włącznie, a następnie wybierz dolną i górną wartość progową.
Zazwyczaj to wartości progowe wpływają na liczbę ognisk. Dlatego należy zwrócić dużą uwagę przy wyborze wartości progowych. Najlepiej można to osiągnąć, zliczając liczbę ognisk przy użyciu różnych wartości progowych w komórkach wystawionych na promieniowanie γ o wartości niższej niż 2 Gy, a następnie porównując liczby ognisk z ręcznym liczeniem (na oko). Optymalna wartość progowa to taka, która minimalizuje włączenie tła i maksymalizuje włączenie ognisk.
- Wybierz obraz TOPRO-3 i przejdź do menu regionów i wybierz opcję transferu regionów. Wybierz obraz źródłowy jako TOPRPO-3, a miejsce docelowe jako Top-Hat i kliknij przycisk OK.
- Po przeniesieniu obszarów jądrowych do obrazu Top-Hat przejdź do menu pomiaru i wybierz Zintegrowana analiza morfometryczna.
- W wyskakującym oknie wybierz obraz źródłowy - Top-Hat i zmierz według obszaru.
- Wybierz zmierz wszystkie obszary i kliknij zmierz, aby uzyskać liczbę ognisk we wszystkich odpowiadających im jądrach na obrazie Top-Hat.
- Numery ognisk z każdego regionu można wyeksportować do pliku MS-Excel za pomocą opcji log-data.
3D rekonstrukcja obrazów
Aby utworzyć obraz 3D ze stosu za pomocą Metamorph:
- Przejdź do menu stosu i wybierz Rekonstrukcja 3D.
- Wybierz kąt obrotu (np. 160°, 320°).
- Wybierz typ rekonstrukcji 3D - maksymalny.
- Wybierz płaszczyznę obrotu (poziomą lub pionową).
- Wybierz odległość kalibracji Z.
Preferowane jest użycie określonej przez użytkownika odległości Z (optymalna to 0,5 μicrons).
- Wybierz przycisk OK, aby utworzyć rekonstrukcję 3D.
Analiza skanowania linii
Do analizy skanowania linii za pomocą Metamorph:
- Otwórz obraz z pojedynczą płaszczyzną lub plik stosowy.
- Przejdź do polecenia pasków narzędzi pomiaru i wybierz analizę skanowania linii.
- Narysuj linię w poprzek komórki, a to automatycznie ujawni intensywność fluorescencji i odległość każdego znacznika wzdłuż ścieżki linii.
Aby wyjaśnić przestrzenne relacje różnych markerów chromatyny, na przykład ognisk γH2AX i metylacji histonów, lepiej jest narysować linie, które obejmują obszary, które są zarówno gęste, jak i ubogie w te markery.
Dane reprezentatywne
Na potrzeby tej demonstracji użyliśmy przeciwciał przeciwko ogniskom γH2AX i H3K4me, aby ocenić rozkład przestrzenny DSB do epigenetycznego determinantu aktywnej transkrypcji euchromatyny. Jak pokazano na rycinie 1, po napromieniowaniu 2Gy, ogniska γH2AX utworzyły się głównie w regionach, które były matowe zarówno dla barwienia H3K4me, jak i dla barwienia DNA TOPRO-3 (jaskrawo zabarwione regiony DNA wskazują na heterochromatynę).
Rysunek 1. Ogniska γH2AX powstają głównie w euchromatynie w odpowiedzi na promieniowanie jonizujące. (A) Immunofluorescencyjna wizualizacja ognisk γH2AX (zielonych) w ludzkich erytrolokemicznych komórkach K562, 1 godzinę po napromieniowaniu γ (2 Gy). Ogniska γH2AX są pokazane w odniesieniu do H3K4me, reprezentując aktywnie transkrybującą euchromatynę (czerwony). DNA jest znakowane TOPRO-3 (kolor niebieski). Scalony obraz (niebieski, czerwony i zielony) pokazuje wykluczenie ognisk γH2AX z regionów heterochromatycznych. Analiza skanowania liniowego (intensywność fluorescencji w funkcji odległości) wskazuje względny rozkład znaczników w jednej płaszczyźnie. (B) Przekroje na różnych płaszczyznach z rekonstrukcji 3D scalonego obrazu opisanej powyżej.