Profilowanie pre-mikro RNA i mikroRNA przy użyciu ilościowych macierzy PCR w czasie rzeczywistym (qPCR)

Podsumowanie

Zademonstrujemy konfigurację i analizę 96-dołkowych matryc pre-microRNA do QPCR za pomocą robota, jak również ręcznie za pomocą wielokanałowej pipety Thermo Scientific Matrix.

Streszczenie

Ilościowy PCR w czasie rzeczywistym (QPCR) okazał się dokładnym i cennym narzędziem w profilowaniu poziomów ekspresji genów. Jedną z jego wielu zalet jest niższa granica wykrywalności w porównaniu z innymi metodami profilowania ekspresji genów przy jednoczesnym wykorzystaniu mniejszych ilości danych wejściowych dla każdego testu. Zautomatyzowana konfiguracja qPCR poprawiła tę dziedzinę, umożliwiając większą odtwarzalność. Jego wygodna i szybka konfiguracja pozwala na przeprowadzanie eksperymentów o wysokiej przepustowości, umożliwiając profilowanie wielu różnych genów jednocześnie w każdym eksperymencie. Ta metoda, wraz z wewnętrznymi kontrolami płytkowymi, zmniejsza również zmienne eksperymentalne wspólne dla innych technik. Niedawno opracowaliśmy test qPCR do profilowania pre-mikroRNA (pre-miRNA) przy użyciu zestawu 186 par starterów. MikroRNA pojawiły się jako nowa klasa małych, niekodujących RNA, które mają zdolność do regulowania wielu celów mRNA na poziomie potranskrypcyjnym. Te małe RNA są najpierw transkrybowane przez polimerazę RNA II jako pierwotny transkrypt miRNA (pri-miRNA), który jest następnie rozszczepiany na miRNA prekursorowe (pre-miRNA). Pre-miRNA są eksportowane do cytoplazmy, gdzie Dicer rozszczepia pętlę spinki do włosów, aby uzyskać dojrzałe miRNA. Wzrost poziomów miRNA można zaobserwować zarówno na poziomie prekursorowym, jak i dojrzałym miRNA, a profilowanie obu tych form może być przydatne. Istnieje kilka dostępnych na rynku testów dla dojrzałych miRNA; Jednak ich wysoki koszt może zniechęcić badaczy do tej techniki profilowania. W tym miejscu omawiamy opłacalną, niezawodną, opartą na SYBR metodę profilowania pre-miRNA qPCR. Zmiany poziomów pre-miRNA często odzwierciedlają zmiany dojrzałego miRNA i mogą być użytecznym wskaźnikiem ekspresji dojrzałego miRNA. Jednak jednoczesne profilowanie zarówno pre-miRNA, jak i dojrzałych miRNA może być optymalne, ponieważ mogą one dostarczyć nieredundantnych informacji i zapewnić wgląd w przetwarzanie mikroRNA. Co więcej, opisana tutaj technika może zostać rozszerzona o profilowanie innych zestawów bibliotecznych dla określonych szlaków lub patogenów.

Protokół

Matryce profilowania pre-miRNA qPCR mogą być skonfigurowane jako w pełni zautomatyzowane za pomocą robota Tecan Freedom Evo (A) lub ręcznie za pomocą elektronicznej pipety wielokanałowej Matrix (B).

1)Przygotować mieszankę wzorcową, płytki podkładowe i próbki.

1. Płytki starterowe zawierające 186 par starterów w formacie 96-dołkowym (łącznie 2 płytki) w temperaturze 0,5 pM należy przechowywać w temperaturze -80°C. Rozmrozić płytki w temperaturze pokojowej, odwirować i krótko odwirować przed użyciem.
2. Aby przygotować mieszankę główną, rozmrozić SYBR Green 2x PCR Mix w temperaturze pokojowej. Każda reakcja wykorzystuje mieszankę główną 8ul ze starterem 2ul. Skład mieszanki głównej na reakcję to mieszanina 4ul SYBR, woda klasy 3ul PCR i 10-20 ng próbki DNA lub cDNA.
3. Do ustawienia każdej 96-dołkowej płytki startera potrzebne będą cztery główne probówki do mieszania. Próbki mogą być prowadzone po 4 próbki na płytkę (pojedynczo), 2 próbki na płytkę (duplikat) lub pojedyncza próbka w poczwórnym uwikłaniu.
4. Przygotuj mieszankę wzorcową, łącząc SYBR, wodę i próbkę w każdej z 4-2 ml probówek Eppendorfa. Każda probówka powinna zawierać wystarczającą ilość mieszanki wzorcowej na około 100 reakcji, pozwalając na nadmiar odpadów do pipetowania. Wirować do mieszania.

A. Konfiguracja testu pre-miRNA przy użyciu robota Freedom Tecan Evo.

1. Po zainicjowaniu robota i załadowaniu programu Evoware należy trzykrotnie przepłukać po 30 ml każdy, aby usunąć z systemu pęcherzyki powietrza, które będą zakłócać dokładność pipetowania.
2. Skonfiguruj platformę robota tak, aby zawierała następujące elementy:
   • Oznakowana płytka 384-dołkowa
   • 96-dołkowa płytka startera (1)
   • Miksy mistrzowskie
   • Koryto zawierające 2% wybielacza
   • Napełniony pojemnik na płyn systemowy
   • Pusty pojemnik na odpady
3. Rozpocznij automatyczne uruchamianie robota, wybierając dwukrotnie "Uruchom".
4. Pod koniec programu wyjąć płytkę 384-dołkową i uszczelnić folią uszczelniającą LightCycler 480 i krótko odwirować. Umieść zapieczętowaną płytkę 384-dołkową w pozycji 1 hotelu.
5. Przejdź do kroku 2.2 i powtórz te czynności dla płytki startera 2 z nowymi mieszankami wzorcowymi i nową płytką 384-dołkową.
   1. Umieść zapieczętowaną tabliczkę w pozycji 2 hotelu.
6. Otwórz nowy program Evoware do ładowania Lightcyclera z hotelu i wybierz dwukrotnie "Uruchom".
   1. Freedom Evo automatycznie załaduje każdą płytkę do LightCyclera i uruchomi następujący program rowerowy SYBR-green I/HRM:
      Przed (1 cykl):
      50° przez 5 minut z szybkością narastania 4,8°/s
      95° przez 5 minut z prędkością narastania 4,8°/s
      Wzmacniacz (45 cykli):
      95° przez 15 sekund z szybkością narastania 4,8°/s
      62° przez 30 sekund z szybkością narastania 2,5°/s
      (Pojedynczy przyrost danych w tym kroku)
      Krzywa topnienia:
      95° przez 5 sekund z szybkością narastania 4,8°/s
      60° przez 1 minutę z prędkością rampy 2,5°/s
      95° ciągły z szybkością narastania 0,11°/s
      z 5 akwizycjami na °C
      Chłodny:
      50° przez 30 sekund z szybkością narastania 25°/s

B.Konfiguracja testu pre-miRNA przy użyciu elektronicznej pipety wielokanałowej Matrix:

1. Umieścić zawartość głównej probówki mieszającej 1 w zbiorniku.
2. Ustaw pipetę elektroniczną tak, aby zasysała 16ul mieszanki głównej z etapami dozowania 2-8ul, po których następuje etap przedmuchiwania.
3. W przypadku mieszanki wzorcowej 1 dozuj 8ul do każdego innego dołka płytki 384-dołkowej (ustawionej w odstępach między końcówkami 384-dołkowymi), zaczynając od dołka A1. (tj. studnie A1, C1, E1, itp.) W przypadku drugiego dozowania 8ul przejdź do kolumny 3 (tj. studzienek A3, C3, E3 itp.), a następnie przepłucz pojemnik na odpady i wyrzuć dysze.
4. Postępuj zgodnie z tym wzorem przez pozostałe 5 cykli, aż osiągniesz poziom A23.
5. Powtórzyć dla mieszanki głównej 2 (zaczynając od dołka A2, C2, E2 itd.); mieszanki głównej 3 (zaczynając od dołka B1, D1, F1 itd.); mieszanki głównej 4 (zaczynając od B2, D2, F2 itd.).
6. W celu porcjowania płytki startera ustaw pipetę elektroniczną na zasysanie 2ul i dozowanie 2ul z następującym krokiem przedmuchiwania. Dozować 2ul starterów z kolumny 1 96-dołkowej płytki starterowej (AH) do płytki 384-dołkowej, studzienek A1, C1, E1 itd. Wyczyść pojemnik na odpady i wyrzuć wskazówki. Powtórz dla dołków A2, C2, E2; B1, D1, F1; oraz B2, D2, F2 itd.
7. Powtórz dla rzędów 2-12 starterów 96-dołkowych, przesuwając się co 2 kolumny dla każdej kolumny startera, aż do podporcjowania pełnej płytki 384-dołkowej.
8. Uszczelnij płytki folią uszczelniającą LightCycler i krótko odwiruj.
9. Umieść płytki w urządzeniu LightCycler 480 i przełącz je zgodnie z następującymi ustawieniami, korzystając z formatu wykrywania SYBR Green I/HRM:
   Przed (1 cykl):
   50° przez 5 minut z szybkością narastania 4,8°/s
   95° przez 5 minut z prędkością narastania 4,8°/s
   Amp (45 cykli):
   95° przez 15 sekund z szybkością narastania 4,8°/s
   62° przez 30 sekund z szybkością narastania 2,5°/s
   (Pojedyncze pobieranie danych w tym kroku)
   Krzywa topnienia:
   95° przez 5 sekund z szybkością narastania 4,8°/s
   60° przez 1 minutę z prędkością rampy 2,5°/s
   95° ciągły z szybkością narastania 0,11°/s
   z 5 akwizycjami na °C
   Fajny :
   50° przez 30 sekund z szybkością narastania 25°/s
10. Powtórzyć czynności na płytce startera 2, rozdzielając na świeżą płytkę 384-dołkową, używając świeżo przygotowanych mieszanek wzorcowych.

Sekrety sukcesu:

Ważną cechą podczas projektowania tablic PCR jest to, że wszystkie 186 par starterów ma tę samą temperaturę wyżarzania, więc płytka może być uruchamiana z tymi samymi optymalnymi ustawieniami programu uruchamiania PCR.

Każda nowa tablica powinna być sprawdzana za pomocą trzech kontrolek przed uruchomieniem próbek. Te elementy sterujące to:
1 seria wszystkich podkładów przeprowadzona z wodą lub .1x TE, aby wykluczyć zanieczyszczenie podkładu.
1 przebieg naprzemiennego podlewania wodą/TE i kontrolą pozytywną, aby zapewnić brak przeniesienia.
3 serie z zastosowaniem tej samej kontroli dodatniej, aby zapewnić odtwarzalność między seriami.
Mieszanki główne powinny być świeżo przygotowane, a płytki powinny być uruchamiane w ciągu 24 godzin, aby uzyskać optymalne wyniki
Folię płyty podkładowej należy usuwać powoli, aby zmniejszyć ryzyko zanieczyszczenia między studzienkami.
W przypadku korzystania z robota ze stałymi końcówkami, konieczne jest 2% mycie wybielaczem, aby umyć końcówki między każdym etapem pipetowania, a następnie spłukać wodą. Zapobiega to przenoszeniu danych, które w przeciwnym razie mogłoby zanieczyścić dane i prowadzić do niejednoznacznych wyników.
Po przepuszczeniu płytki przez Lightcycler, nie należy jej ponownie otwierać w pomieszczeniu do ustawiania PCR. Pomaga to zapobiegać zanieczyszczeniu PCR.

Reprezentatywne wyniki:

qPCR wyniki są zazwyczaj reprezentowane przez wartości CT określone przez oprogramowanie analityczne Lightcycler. Udany przebieg zwykle składa się z szeregu CT dla próbek, zwykle od 20 do 35 dla próbek, które są dodatnie. Próbki wody w dobrym przebiegu mają zawsze CT >40, a wszelkie próbki lub określone studnie z CT powyżej 37 są uważane za ujemne lub niewykryte. Z reguły próbki, w których uzyskano CT na poziomie <10, są również niewiarygodne i są wyłączone z dalszej analizy. Istnieje kilka sposobów analizy danych qPCR, a włączenie kontroli wewnętrznej do naszego testu pomaga kontrolować zmienność danych wejściowych próbki. Matryca pre-miR zawiera starter kontrolny U6, który jest często używany jako gen referencyjny do normalizacji wartości CT z różnych próbek. Ta znormalizowana wartość jest określana jako wartość delta CT (dCT). Wyniki są często przedstawiane na wykresie jako surowa CT, wartość dCT lub mogą być dalej analizowane do wartości znormalizowanych.

Na rysunku 1 analiza pełnej matrycy pre-microRNA czterech różnych próbek z eksperymentu w czasie jest przedstawiona w formacie mapy cieplnej. Pokazano względną ekspresję każdego pre-mikroRNA i wyłoniły się trzy główne, odrębne klastry. Większość analizowanych pre-miR uległa niewielkim, nieistotnym zmianom zgodnie z oczekiwaniami (Rysunek 1A). Jednak niewielka część pre-mikroRNA została znacznie zmniejszona (Figura 1B) lub dramatycznie zwiększona (Figura 1C) w trakcie trwania eksperymentu. Poziomy ekspresji każdego pre-mikroRNA zostały znormalizowane do punktu czasowego 0h (próbka 1) jako poziom wyjściowy. W niektórych przypadkach można zauważyć, że niektóre z grupowanych pre-mikroRNA również grupują się razem w analizie mapy cieplnej (np. let-7a, rysunek 1B). W zależności od eksperymentu mogą pojawić się klastry, które są zależne od infekcji wirusowej, specyficznej dla typu komórki ekspresji pre-mikroRNA lub pre-miR, które są regulowane przez wspólną cząsteczkę lub szlak sygnałowy.

Test pre-mikroRNA, który opracowaliśmy, zawiera również szereg znanych wirusowych pre-mikroRNA i genów kodowanych przez wirusa opryszczki związanego z mięsakiem Kaposiego (KSHV) i wirusa Epsteina-Barr (EBV) oprócz ludzkich pre-miR. Mogą one być stosowane jako kontrole dodatnie lub ujemne, w zależności od linii komórkowej i statusu wirusa użytych próbek. Na rysunku 2 przedstawiono średnie CT z próbki z ujemnym wynikiem KSHV w czterokrotnym podwojeniu. Co ważne, KSHV LANA nie została wykryta w tej próbce przez bardzo czułą matrycę qPCR. Jednak U6 - nasza wewnętrzna kontrola i let-7a - wysoce eksprymowany ludzki pre-mikroRNA, uległy ekspresji na wykrywalnych poziomach. Wreszcie, zgodnie z oczekiwaniami, negatywna kontrola wody klasy PCR nie dała produktu qPCR.

Innym wskaźnikiem udanego przebiegu qPCR jest dobra analiza krzywej topnienia, która może dać wgląd w potencjalne zanieczyszczenie próbek. Aby ustalić temperaturę topnienia, płytka jest powoli podgrzewana po zakończeniu PCR. Gdy nici DNA oddzielają się, uwalniana jest zieleń SYBR, a sygnał fluorescencji zmniejsza się. Temperatura, w której następuje ten spadek, jest przedstawiona na wykresie i jest znana jako temperatura topnienia próbki. W zależności od sekwencji DNA, próbki topią się w różnych temperaturach od siebie i od kontroli ujemnej wody, która nie powinna mieć temperatury topnienia, ponieważ nie ma DNA. Produkty PCR z każdej pary starterów powinny stopić się w podobnych temperaturach. Na przykład rysunek 3 przedstawia analizę krzywej topnienia dla dwóch różnych starterów przy użyciu tej samej próbki w dwóch egzemplarzach. Oczywiste jest, że temperatura topnienia jest różna dla dwóch par starterów, ale próbka topi się dokładnie w tej samej temperaturze dla każdej kontrpróby. Oznaki złej lub potencjalnie zanieczyszczonej próbki mogą obejmować kilka szczytów topnienia, co sugeruje obecność dwóch różnych źródeł danych wejściowych.

Rysunek 1. Sygnatury pre-mikroRNA powstają w wyniku profilowania przy użyciu nowatorskiej macierzy opartej na qPCR. Obliczono średnią wartość deltaCTU6, a znormalizowane wartości załadowano do oprogramowania ArrayMinerTM, uzyskując 3 odrębne klastry wyświetlane jako mapy cieplne. (A) Pokazano pre-mikroRNA z niewielkimi zmianami w ekspresji. Pokazano również pre-mikroRNA, których poziomy były znacznie obniżone (B) lub zwiększone (C). Niebieski odpowiada niższym poziomom ekspresji, podczas gdy czerwony reprezentuje zwiększony poziom ekspresji.

Rysunek 2. Włączenie kontroli wewnętrznych do macierzy pre-mikroRNA opartej na qPCR. Pokazane są surowe wartości CT dla 3 różnych genów i kontroli bez matrycy. U6 jest używany jako wewnętrzna kontrola pozytywna, podczas gdy PCR H2O służy jako nasza kontrola ujemna. Let-7a-1-1 jest mikroRNA normalnie ulegającym ekspresji w wielu różnych typach komórek, podczas gdy KSHV LANA może być stosowany jako kontrola pozytywna lub negatywna, w zależności od statusu wirusa użytej linii komórkowej lub tkanki.

Rysunek 3. Analiza pików topnienia starterów pre-mikroRNA i brak zanieczyszczenia próbki. Krzywe topnienia uzyskano za pomocą analizy wywołania Tm w oprogramowaniu LightCycler. Pokazano dwa różne startery (Primer A i B) dla tej samej próbki w dwóch powtórzeniach. Temperatura topnienia dla każdego podkładu jest inna. Jednak próbka ma tylko jeden pik, co świadczy o braku zanieczyszczenia próbki.

Dyskusja

QPCR jest bardzo czułym testem, który można wykorzystać do porównania poziomów ekspresji genów między próbkami w badaniu, a także do określenia dodatniego wyniku w przypadku wirusów. Zaletą stosowania macierzy qPCR jest możliwość uruchomienia wielu starterów (w naszym przypadku 186 par starterów) dla każdej próbki w krótkim czasie. Korzystając z robota pipetującego, takiego jak Tecan Freedom Evo, można jeszcze bardziej skrócić czas potrzebny na przygotowanie eksperymentu, a dokładność i spójność robota może zmniejszyć ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Wolność Evo 150	Tecan Group Sp. z o.o.
30017587 Matrix Elektroniczna pipeta wielokanałowa	Thermo Fisher Scientific, Inc.	2001-MTX	(lub dowolny porównywalny wielokanałowy Thermo Scientific, który może pipetować objętości opisane powyżej)
Końcówki filtra integralności matrycy, sterylne	Thermo Fisher Scientific, Inc.	7435	(lub porównywalna końcówka do użytku wielokanałowego)
Lightcycler 480 SYBR Green 1 Master	Roche Group	04 707 516 001
Lightcycler 480 Instrument II	Roche Group	05015243001	wersja 384-well
Lightcycler 480 Multiwell Plate 384, biała	Grupa Roche	04729749001
LightCycler 480 Folia uszczelniająca	Roche Group	04729757001
LightCycler 480 Oprogramowanie do analizy wielu płytek	Roche Group	05075122001
Eliminase Deminatorium	Decon Laboratories	04-355-31