Zaprezentujemy konfigurację i analizę tablic 96-dołkowych pre-microRNA do QPCR, przeprowadzonych zarówno przy użyciu robota, jak i ręcznie za pomocą wielokanałowej pipety Thermo Scientific Matrix.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Profilowanie pre-microRNA i microRNA z wykorzystaniem matryc ilościowej PCR w czasie rzeczywistym (qPCR)
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym (qPCR) stała się dokładnym i wartościowym narzędziem w profilowaniu poziomów ekspresji genów. Jedną z jej wielu zalet jest niższa granica wykrywalności w porównaniu z innymi metodami profilowania ekspresji genów, przy jednoczesnym wykorzystaniu mniejszych ilości materiału wyjściowego dla każdego testu. Zautomatyzowane przygotowanie qPCR usprawniło tę dziedzinę, zapewniając większą powtarzalność. Jego wygodne i szybkie przygotowanie umożliwia przeprowadzanie eksperymentów wysokoprzepustowych, co pozwala na jednoczesne profilowanie wielu różnych genów w każdym badaniu. Metoda ta, wraz z wewnętrznymi kontrolami na płytce, redukuje również zmienne eksperymentalne typowe dla innych technik.
Opracowaliśmy ostatnio test qPCR do profilowania prekursorów mikroRNA (pre-miRNA) z wykorzystaniem zestawu 186 par starterów. MikroRNA wyłoniły się jako nowa klasa małych, niekodujących RNA o zdolności do regulacji wielu celów mRNA na poziomie potranskrypcyjnym. Te małe RNA są najpierw transkrybowane przez polimerazę RNA II jako pierwotny transkrypty miRNA (pri-miRNA), który następnie jest cięty do prekursora miRNA (pre-miRNA). Pre-miRNA są eksportowane do cytoplazmy, gdzie enzym Dicer odcina pętlę spinki do włosów, tworząc dojrzałe miRNA. Wzrosty poziomu miRNA można obserwować zarówno na poziomie prekursorów, jak i dojrzałych miRNA, a profilowanie obu tych form może być użyteczne. Dostępnych jest na rynku kilka komercyjnych testów dla dojrzałych miRNA, jednak ich wysoki koszt może zniechęcać badaczy do stosowania tej techniki profilowania. W niniejszej pracy omawiamy kosztową, niezawodną metodę qPCR opartą na SYBR do profilowania pre-miRNA. Zmiany w poziomach pre-miRNA często odzwierciedlają zmiany w dojrzałych miRNA i mogą być użytecznym wskaźnikiem ekspresji dojrzałych miRNA. Niemniej jednak jednoczesne profilowanie zarówno pre-miRNA, jak i dojrzałych miRNA może być optymalne, ponieważ mogą one dostarczać nieredundantnych informacji i pozwolić na wgląd w procesy przetwarzania mikroRNA. Co więcej, opisana tutaj technika może zostać rozszerzona o profilowanie innych zestawów bibliotek dla konkretnych szlaków sygnałowych lub patogenów.
Protokół
Tablice do profilowania pre-miRNA metodą qPCR mogą być przygotowywane w pełni automatycznie za pomocą robota Tecan Freedom Evo (A) lub ręcznie przy użyciu elektronicznej pipety wielokanałowej Matrix (B).
1) Przygotuj mieszaninę główną (master mix), płyty z primerami oraz próbki.
- Płytki z primerami zawierające 186 par starterów w formacie 96-dołkowym (łącznie 2 płytki) o stężeniu 0,5 pM należy przechowywać w temperaturze -80°C. Przed użyciem rozmrozić płytki w temperaturze pokojowej, wymieszać w wortexie i krótko odwirować.
- W celu przygotowania master mixu należy rozmrozić SYBR Green 2x PCR Mix w temperaturze pokojowej. Każda reakcja wymaga 8 µl master mixu oraz 2 µl primerów. Skład master mixu na jedną reakcję to: 4 µl mieszaniny SYBR, 3 µl wody klasy PCR oraz 10-20 ng DNA lub cDNA z próbki.
- Do konfiguracji każdej 96-dołkowej płytki z primerami potrzebne będą cztery probówki z master mixem. Próbki można analizować w układzie: 4 próbki na płytce (pojedynczo), 2 próbki na płytce (podwójnie) lub jedna próbka w czterech powtórzeniach.
- Przygotować master mix, łącząc SYBR, wodę i próbkę w każdej z czterech probówek Eppendorf o pojemności 2 ml. Każda probówka powinna zawierać ilość master mixu wystarczającą na około 100 reakcji, z uwzględnieniem nadmiaru na straty podczas pipetowania. Wymieszać wortexie.
A. Konfiguracja analizy pre-miRNA przy użyciu robota Freedom Tecan Evo.
- Po zainicjowaniu robota i załadowaniu programu Evoware, przeprowadź trzykrotne płukanie po 30 mls, aby usunąć z systemu pęcherzyki powietrza, które mogłyby zakłócić dokładność pipetowania.
- Przygotuj platformę robota, uwzględniając następujące elementy:
- Opisaną płytkę 384-dołkową
- Płytkę z primerami 96-dołkową (1)
- Mieszaniny Master mix
- Korytko zawierające 2% roztwór wybielacza
- Pełny pojemnik z płynem systemowym
- Pusty pojemnik na odpady
- Rozpocznij zautomatyzowany cykl pracy robota, wybierając dwukrotnie opcję „Run”.
- Po zakończeniu programu wyjmij płytkę 384-dołkową, zapieczętuj ją folią uszczelniającą LightCycler 480 i krótko odwiruj. Umieść zapieczętowaną płytkę 384-dołkową w pozycji 1 magazynu (hotel).
- Przejdź do kroku 2.2 i powtórz procedurę dla płytki z primerami 2, używając nowych mieszanin master mix oraz nowej płytki 384-dołkowej.
- Umieść zapieczętowaną płytkę w pozycji 2 magazynu.
- Otwórz nowy program Evoware do ładowania LightCyclera z magazynu i wybierz dwukrotnie „Run”.
- Freedom Evo automatycznie załaduje każdą płytkę do urządzenia LightCycler i uruchomi następujący program cykli SYBR-green I/HRM:
Pre (1 cykl):
50° przez 5 minut przy szybkości narastania 4.8°/sec
95° przez 5 minut przy szybkości narastania 4.8°/sec
Amp (45 cykli):
95° przez 15 sec przy szybkości narastania 4.8°/sec
62° przez 30 sec przy szybkości narastania 2.5°/sec
(Pojedynczy odczyt danych podczas tego kroku)
Krzywa topnienia:
95° przez 5 sec przy szybkości narastania 4.8°/sec
60° przez 1 minutę przy szybkości narastania 2.5°/sec
95° ciągły wzrost przy szybkości narastania .1°/sec
z 5 odczytami na °C
Chłodzenie:
50° przez 30 sec przy szybkości narastania 25°/sec
- Freedom Evo automatycznie załaduje każdą płytkę do urządzenia LightCycler i uruchomi następujący program cykli SYBR-green I/HRM:
B. Przygotowanie testu pre-miRNA z użyciem elektronicznej pipety wielokanałowej Matrix:
- Przenieś zawartość probówki z master mixem 1 do zbiornika.
- Ustaw pipetę elektroniczną na pobranie 16ul master mixu z krokami dozowania po 2-8ul, a następnie krokiem płukania (purge).
- W przypadku master mixu 1 dozuj 8ul do co drugiej studzienki płytki 384-dołkowej (ustaw odstępy końcówek dla płytki 384-dołkowej), zaczynając od studzienki A1 (np. studzienki A1, C1, E1 itd.). Przy drugim dozowaniu 8ul przejdź do kolumny 3 (np. studzienki A3, C3, E3 itd.), następnie wykonaj płukanie nad pojemnikiem na odpady i wyrzuć końcówki.
- Powtarzaj ten schemat przez pozostałe 5 cykli, aż dojdziesz do studzienki A23.
- Powtórz procedurę dla master mixu 2 (zaczynając od studzienek A2, C2, E2 itd.), master mixu 3 (zaczynając od studzienek B1, D1, F1 itd.) oraz master mixu 4 (zaczynając od studzienek B2, D2, F2 itd.).
- Aby podzielić próbki z płytki z primerami, ustaw pipetę elektroniczną na pobranie 2ul i dozowanie 2ul, po którym następuje krok płukania. Dozuj 2ul primerów z kolumny 1 płytki 96-dołkowej z primerami (A-H) do płytki 384-dołkowej, do studzienek A1, C1, E1 itd. Wykonaj płukanie nad pojemnikiem na odpady i wyrzuć końcówki. Powtórz dla studzienek A2, C2, E2; B1, D1, F1; oraz B2, D2, F2 itd.
- Powtarzaj dla rzędów 2-12 primerów z płytki 96-dołkowej, przesuwając się o co drugą kolumnę dla każdej kolumny primerów, aż cała płytka 384-dołkowa zostanie wypełniona aliquotami.
- Uszczelnij płytki folią uszczelniającą LightCycler i krótko odwiruj w wirówce.
- Umieść płytki w urządzeniu LightCycler 480 i przeprowadź cykle zgodnie z poniższymi ustawieniami, korzystając z formatu detekcji SYBR Green I/HRM:
Pre (1 cykl):
50° przez 5 minut przy szybkości narastania 4.8°/sec
95° przez 5 minut przy szybkości narastania 4.8°/sec
Amp (45 cykli):
95° przez 15 sec przy szybkości narastania 4.8°/sec
62° przez 30 sec przy szybkości narastania 2.5°/sec
(Pojedyncza akwizycja danych podczas tego kroku)
Krzywa topnienia (Melting curve):
95° przez 5 sec przy szybkości narastania 4.8°/sec
60° przez 1 minutę przy szybkości narastania 2.5°/sec
95° w trybie ciągłym przy szybkości narastania .1°/sec
z 5 akwizycjami na °C
Chłodzenie (Cool):
50° przez 30 sec przy szybkości narastania 25°/sec - Powtórz procedurę, używając płytki z primerami 2, rozdzielając próbki do nowej płytki 384-dołkowej z wykorzystaniem świeżo przygotowanych master mixów.
Klucze do sukcesu:
Ważną cechą podczas projektowania macierzy PCR jest to, że wszystkie 186 par starterów ma taką samą temperaturę przyłączania, dzięki czemu płytkę można inkubować przy tych samych optymalnych ustawieniach programu PCR.
Każdy nowy zestaw powinien zostać sprawdzony za pomocą trzech kontroli przed analizą próbek. Kontrole te obejmują:
1 przebieg wszystkich starterów z wodą lub 0,1x TE w celu wykluczenia kontaminacji starterami.
1 przebieg naprzemiennej wody/TE i kontroli pozytywnej, aby upewnić się, że nie dochodzi do przenoszenia materiału (carryover).
3 przebiegi z użyciem tej samej kontroli pozytywnej, aby zapewnić powtarzalność między poszczególnymi analizami.
Mieszaniny master-mix powinny być świeżo przygotowane, a płytki analizowane w ciągu 24 h dla uzyskania optymalnych wyników.
Folię z płytki ze starterami należy usuwać powoli, aby zmniejszyć ryzyko kontaminacji między studzienkami.
W przypadku korzystania z robota z końcówkami stałymi konieczne jest przemycie końcówek 2% roztworem wybielacza po każdym etapie pipetowania, a następnie przepłukanie wodą. Zapobiega to i eliminuje przenoszenie materiału, co w przeciwnym razie mogłoby zanieczyścić dane i doprowadzić do nierozstrzygających wyników.
Po analizie płytki w urządzeniu Lightcycler nie powinna być ona ponownie otwierana w pomieszczeniu do przygotowania PCR. Pomaga to zapobiegać kontaminacji PCR.
Reprezentatywne wyniki:
Wyniki qPCR są zazwyczaj przedstawiane za pomocą wartości CT wyznaczonych przez oprogramowanie analityczne Lightcycler. Pomyślny przebieg analizy zazwyczaj obejmuje zakres wartości CT dla próbek, typowo między 20-35 dla próbek pozytywnych. Próbki wody w poprawnym przebiegu analizy zawsze wykazują CT >40, a wszelkie próbki lub konkretne dołki z CT powyżej 37 są uznawane za negatywne lub niewykryte. Co do zasady, próbki dające CT <10 są również niewiarygodne i zostają wykluczone z dalszej analizy. Istnieje kilka sposobów analizy danych qPCR, a włączenie kontroli wewnętrznych do naszego testu pomaga kontrolować zmienność ilości materiału wejściowego w próbkach. Tablica pre-miR zawiera starter kontrolny U6, który jest często stosowany jako gen referencyjny do normalizacji wartości CT z różnych próbek. Ta znormalizowana wartość jest określana jako wartość delta CT (dCT). Wyniki są często przedstawiane na wykresach jako surowe CT, wartość dCT lub mogą być dalej analizowane w celu uzyskania wartości zestandaryzowanych.
Na Rysunku 1 przedstawiono analizę pełnego zestawu pre-microRNA z czterech różnych próbek z eksperymentu czasowego w formie mapy ciepła. Przedstawiono względną ekspresję każdego pre-microRNA, w wyniku czego wyłoniły się trzy główne, odrębne klastry. Większość analizowanych pre-miR uległa niewielkim, nieistotnym zmianom, zgodnie z oczekiwaniami (Rysunek 1A). Jednak niewielka część pre-microRNA uległa znacznemu zmniejszeniu (Rysunek 1B) lub gwałtownemu wzrostowi (Rysunek 1C) w trakcie eksperymentu czasowego. Poziomy ekspresji każdego pre-microRNA zostały znormalizowane względem punktu czasowego 0h (próbka 1) jako poziomu bazowego. W niektórych przypadkach można zauważyć, że niektóre z pogrupowanych pre-microRNA tworzą również wspólne grupy w analizie mapy ciepła (np. let-7a, Rysunek 1B). W zależności od eksperymentu mogą pojawić się klastry zależne od infekcji wirusowej, specyficznej dla typu komórek ekspresji pre-microRNA lub pre-miR regulowanych przez wspólną cząsteczkę lub szlak sygnalizacyjny.
Opracowany przez nas test pre-microRNA obejmuje również szereg znanych wirusowych pre-microRNA oraz geny kodowane przez wirusa herpes Kaposiskiego (KSHV) i wirusa Epsteina-Barr (EBV), poza ludzkimi pre-miR. Mogą one służyć jako kontrole pozytywne lub negatywne, w zależności od linii komórkowej i statusu wirusowego użytych próbek. Na Rysunku 2 przedstawiono średnie wartości CT z próbki negatywnej pod kątem KSHV, analizowanej w czterech powtórzeniach. Co ważne, LANA KSHV nie została wykryta w tej próbce za pomocą wysokoczułej macierzy qPCR. Jednakże U6 — nasza kontrola wewnętrzna oraz let-7a — silnie wyrażany ludzki pre-microRNA — były wyrażone na poziomach wykrywalnych. Wreszcie, zgodnie z oczekiwaniami, kontrola negatywna w postaci wody klasy PCR nie dała produktu qPCR.
Kolejnym wskaźnikiem poprawnego przebiegu qPCR jest prawidłowa analiza krzywej topnienia, która może dostarczyć informacji o potencjalnym zanieczyszczeniu próbek. Aby wyznaczyć temperaturę topnienia, płytkę powoli podgrzewa się po zakończeniu reakcji PCR. W miarę rozdzielania się nici DNA barwnik SYBR green jest uwalniany, a sygnał fluorescencji spada. Temperatura, przy której następuje ten spadek, jest nanoszona na wykres i nazywana temperaturą topnienia próbki. W zależności od sekwencji DNA próbki topią się w różnych temperaturach względem siebie oraz względem negatywnej kontroli z wodą, która nie powinna wykazywać temperatury topnienia ze względu na brak DNA. Produkty PCR z każdej pary starterów powinny topić się w zbliżonych temperaturach. Na przykład Rycina 3 przedstawia analizę krzywej topnienia dla dwóch różnych starterów przy użyciu tej samej próbki w duplikacie. Wyraźnie widać, że temperatura topnienia różni się dla obu par starterów, ale próbka topi się w dokładnie tej samej temperaturze dla każdego powtórzenia. Sygnałami świadczącymi o wadliwej lub potencjalnie zanieczyszczonej próbce mogą być liczne piki topnienia, co sugeruje obecność dwóch różnych źródeł materiału wejściowego.
Rysunek 1. Sygnatury pre-mikroRNA wyłoniono w drodze profilowania z wykorzystaniem nowej matrycy opartej na metodzie qPCR. Obliczono średnią wartość deltaCTU6, a następnie wprowadzono wartości znormalizowane do oprogramowania ArrayMinerTM, co pozwoliło na uzyskanie 3 wyraźnych klastrów przedstawionych w formie map ciepła. (A) Przedstawiono pre-mikroRNA o niewielkich zmianach ekspresji. Przedstawiono również pre-mikroRNA, których poziomy uległy znacznemu obniżeniu (B) lub wzrostowi (C). Kolor niebieski odpowiada niższym poziomom ekspresji, natomiast kolor czerwony reprezentuje zwiększone poziomy ekspresji.
Rysunek 2. Włączenie kontroli wewnętrznych do tablicy pre-microRNA opartej na qPCR. Przedstawiono surowe wartości CT dla 3 różnych genów oraz kontrolę bez matrycy. U6 jest wykorzystywany jako wewnętrzna kontrola pozytywna, natomiast PCR H2O służy jako nasza kontrola negatywna. Let-7a-1-1 to microRNA zazwyczaj ekspresowane w wielu różnych typach komórek, podczas gdy KSHV LANA może być stosowany jako kontrola pozytywna lub negatywna, w zależności od statusu wirusowego użytej linii komórkowej lub tkanki.
Rysunek 3. Analiza piku topnienia starterów do pre-microRNA i brak kontaminacji próbki. Krzywe topnienia uzyskano za pomocą analizy wyznaczania Tm w oprogramowaniu LightCycler. Przedstawiono dwa różne startery (starter A i B) dla tej samej próbki, przeprowadzone w dubletach. Temperatura topnienia dla każdego startera jest odmienna. Próbka wykazuje jednak tylko jeden pik, co świadczy o braku kontaminacji próbki.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
qPCR to wysoce czuły test, który może być wykorzystany do porównania poziomów ekspresji genów między próbkami w badaniu, a także do określenia obecności wirusów. Korzyścią z zastosowania macierzy qPCR jest możliwość jednoczesnego wykorzystania wielu starterów (w naszym przypadku 186 par starterów) dla każdej próbki w krótkim czasie. Dzięki zastosowaniu robota pipetującego, takiego jak Tecan Freedom Evo, czas potrzebny na przygotowanie eksperymentu może zostać dodatkowo skrócony, a precyzja i powtarzalność robota pozwalaj...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Praca ta była wspierana przez granty NIH DE018304, R01DE018281. K.T. otrzymuje wsparcie z T32 GM07092-34 oraz z grantu przyznanego University of North Carolina at Chapel Hill przez Howard Hughes Medical Institute (HHMI) w ramach inicjatywy Med into Grad. PC otrzymuje wsparcie z T32 CA009156.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Freedom Evo 150 | Tecan Group Ltd. | 30017587 | |
| Elektroniczna pipeta wielokanałowa Matrix | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 2001-MTX | (lub dowolna porównywalna pipeta wielokanałowa Thermo Scientific, która może pipetować opisane powyżej objętości) |
| Sterylne końcówki z filtrem Matrix Integrity | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 7435 | (lub porównywalne końcówki do użytej pipety wielokanałowej) |
| Lightcycler 480 SYBR Green 1 Master | Roche Group | 04 707 516 001 | |
| Lightcycler 480 Instrument II | Roche Group | 05015243001 | wersja 384-dołkowa |
| Płyta wielodołkowa Lightcycler 480 384, biała | Roche Group | 04729749001 | |
| Folia uszczelniająca LightCycler 480 | Roche Group | 04729757001 | |
| Oprogramowanie LightCycler 480 Multiple Plate Analysis | Roche Group | 05075122001 | |
| Dekontaminant Eliminase | Decon Laboratories | 04-355-31 |
Bibliografia
- Bustin, A. A. The MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments. Clinical Chem. 55 (4), 611-622 (2009).
- Frégeau, C. J. Automated Processing of Forensic Casework Samples using Robotic Workstations Equipped with Nondisposable Tips - Contamination Prevention. J. Forensic Sci. 53 (3), 53-533 (2008).
- O'hara, A. J. Pre-micro RNA Signatures Delineate Stages of Endothelial Cell Transformation in Kaposi Sarcoma. PLoS Pathog. 5 (4), e1000389-e1000389 (2009).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
