Wysokorozdzielcza mikroendoskopia światłowodowa do obrazowania komórkowego in situ

Podsumowanie

W wielu sytuacjach biologicznych i klinicznych korzystne jest badanie procesów komórkowych w ich naturalnym mikrośrodowisku. W niniejszym materiale opisujemy montaż i zastosowanie niedrogiego mikroskopu światłowodowego, który umożliwia obrazowanie w czasie rzeczywistym w hodowlach komórkowych, badaniach na zwierzętach oraz w badaniach klinicznych z udziałem pacjentów.

Streszczenie

Wiele badań biologicznych i klinicznych wymaga podłużnego badania i analizy morfologii oraz funkcji z rozdzielczością na poziomie komórkowym. Tradycyjnie wiele eksperymentów prowadzi się równolegle, usuwając poszczególne próbki z badania w sekwencyjnych punktach czasowych w celu oceny za pomocą mikroskopii świetlnej. Opracowano kilka technik intravitalnych, a mikroskopia konfokalna, wielofotonowa i generacji drugiej harmonicznej wykazały możliwość zastosowania w obrazowaniu in situ ¹. Jednak w przypadku tych systemów wymagana infrastruktura jest złożona i kosztowna, obejmując skanujące systemy laserowe i skomplikowane źródła światła. Przedstawiamy tutaj protokół projektowania i montażu wysokorozdzielczego mikroendoskopu, który można zbudować w jeden dzień, korzystając z gotowych komponentów za kwotę poniżej 5 000 USD. Platforma ta oferuje elastyczność w zakresie rozdzielczości obrazu, pola widzenia i długości fali roboczej; opisujemy, w jaki sposób parametry te można łatwo zmodyfikować, aby sprostać konkretnym potrzebom użytkownika końcowego.

My zespół oraz inni badacze analizowali zastosowanie mikroendoskopu o wysokiej rozdzielczości (HRME) w hodowlach komórkowych in vitro ^2-5, w wyciętych ⁶ i żywych tkankach zwierzęcych ^2,5 oraz w ludzkich tkankach in vivo ^2,7. Użytkownicy zgłaszali stosowanie kilku różnych fluorescencyjnych środków kontrastowych, w tym proflawiny ^2-4, pochodnej benzoporfiryny monoacid ring A (BPD-MA) ⁵ oraz fluoresceiny ^6,7, z których wszystkie otrzymały pełną lub badawczą zgodę FDA na stosowanie u ludzi. Mikroendoskopia o wysokiej rozdzielczości w formie opisanej w niniejszym opracowaniu może być atrakcyjna dla szerokiego grona badaczy pracujących w naukach podstawowych i klinicznych. Technika ta oferuje skuteczne i ekonomiczne podejście, które uzupełnia tradycyjną mikroskopię laboratoryjną, umożliwiając użytkownikowi wykonywanie wysokorozdzielczego obrazowania podłużnego in situ.

Protokół

1. Montaż mikroendoskopu

Opisany tutaj mikroendoskop o wysokiej rozdzielczości (rycina 1a) należy traktować jako konfigurację bazową, z wieloma możliwymi wariantami montażu i zastosowania. W niniejszym opracowaniu szczegółowo opisujemy wersję platformy zaprojektowaną do pracy z proflawiną jako fluorescencyjnym środkiem kontrastowym. Proflawina jest jasnym barwnikiem jądrowym o maksimach długości fali absorpcji i emisji wynoszących odpowiednio 445 nm i 515 nm. Zastosowanie innych środków kontrastowych będzie wymagało od użytkownika odpowiedniego doboru filtrów wzbudzenia, emisji oraz filtrów dichroicznych. Wiele elementów mikroendoskopu o wysokiej rozdzielczości jest generycznych i może być pozyskanych od wielu dostawców. Przykładowo, optomechaniczne komponenty pozycjonujące są dostępne u producentów takich jak Thorlabs, Newport czy Linos. Kompaktowe kamery CCD są oferowane przez firmy m.in. Point Grey Research, Prosilica i Retiga; czułość kamery należy dobrać, biorąc pod uwagę jasność stosowanego fluoroforu oraz pożądaną liczbę klatek na sekundę. Diody emitujące światło (LED) o wysokiej mocy można nabyć u producentów takich jak Luxeon, Cree czy Nichia. Wiązki światłowodowe są dostępne u dostawców Sumitomo, Fujikura i Schott. Dobierając komponenty do konkretnej aplikacji, użytkownik powinien uwzględnić zależności występujące w mikroskopii fluorescencyjnej pomiędzy stężeniem fluoroforu, fotoblaknięciem, natężeniem oświetlenia, czułością kamery, wzmocnieniem a czasem ekspozycji.

1. Połącz pręty klatki 6" z prętami klatki 1,5", aby utworzyć parę prętów o długości 7,5". Wkręć te pręty w jedną ściankę modułu lustra składanego. Wkręć pręty 0,5" w przeciwległą ściankę. Nasuń kostkę klatki na pręty klatki przez dwa dolne otwory przelotowe. Wkręć pręty 2" w boczną ściankę kostki klatki (rycina 1b).
2. Zamocuj kamerę do płyty klatki za pomocą adaptera z mocowaniem C na SM1. Przymocuj płytę klatki na prętach klatki 0,5", tak aby była zlicowana z powierzchnią modułu lustra składanego.
3. Włóż soczewkę tubusową do tubusu soczewkowego o długości 3" i zabezpiecz soczewkę pierścieniem zatrzymującym. Ogniskową soczewki należy dobrać tak, aby rdzenie wiązki światłowodowej były próbkowane przez co najmniej dwa piksele po rzutowaniu na kamerę. Wsuń filtr emisyjny do tubusu na pierwszy pierścień zatrzymujący i dodaj kolejny pierścień, aby unieruchomić filtr. Przestrzegaj konwencji orientacji filtra wskazanej przez producenta. Wkręć tubus soczewkowy w bok kostki klatki najbliżej kamery CCD. Należy zauważyć, że na rycinie 1c ta soczewka i filtr są pokazane bez tubusu soczewkowego 3" dla przejrzystości.
4. Podłącz kamerę do komputera i wyświetl obraz na ekranie. Skieruj zespół klatki na odległy obiekt i przesuwaj kostkę klatki wzdłuż szyn, aż obraz stanie się ostry. Zablokuj kostkę klatki w tej pozycji. (Jest to prosta metoda zapewniająca, że soczewka tubusowa utworzy ostry obraz w połączeniu z obiektywem korygowanym do nieskończoności).
5. Włóż lustro dichroiczne do uchwytu i umieść je pod kątem 45° w kostce klatki.
6. Wkręć obiektyw, za pomocą adaptera gwintowanego z RMS na SM1 oraz regulowanego tubusu soczewkowego, w ściankę kostki klatki przeciwległą do uchwytu soczewki tubusowej. Zamiast regulowanego tubusu soczewkowego można użyć translatora w osi z w celu łatwiejszego ustawienia ostrości. Wkręć złącze SMA w płytę klatki i zamontuj ją na prętach, mniej więcej w odległości roboczej obiektywu.
7. Zamontuj diodę LED na płycie klatki i nasuń ją na koniec prętów 2". Dodaj soczewkę do tubusu soczewkowego 0,5" w taki sposób, aby po wkręceniu tego tubusu w bok kostki klatki utworzył on obraz diody LED wypełniający tylną aperturę obiektywu. Ta konfiguracja (oświetlenie Köhlera) zapewni równomierne oświetlenie proksymalnej powierzchni wiązki światłowodowej. Dodaj filtr wzbudzenia do tubusu soczewkowego 0,5" i zabezpiecz go pierścieniem zatrzymującym (rycina 1c).
8. Przyłącz złącze SMA do wiązki światłowodowej. Wkręć wiązkę ze złączem SMA do gniazda SMA zamontowanego na prętach klatki. Skieruj dystalny koniec wiązki w stronę szerokopasmowego źródła światła (wystarczy oświetlenie fluorescencyjne) i obserwuj obraz proksymalnej powierzchni wiązki na kamerze CCD. Dostosuj pozycję obiektywu, wkręcając go lub wykręcając z kostki klatki, aż obraz wiązki światłowodowej stanie się ostry. Poszczególne rdzenie powinny być wyraźnie widoczne (rycina 2).

2. Montaż soczewki GRIN

Rozdzielczość przestrzenną mikroendoskopu można zwiększyć poprzez przymocowanie mikrosoczewki lub układu soczewek do dystalnego końca wiązki światłowodowej. Układy optyczne te są skonfigurowane w taki sposób, aby zamiast bezpośredniego przykładania końca wiązki do tkanki, obraz końca był rzutowany na powierzchnię tkanki z pomniejszeniem, co zwiększa częstotliwość próbkowania przestrzennego wymuszoną przez rdzenie światłowodowe wiązki. Stopień pomniejszenia odpowiada zwiększeniu rozdzielczości przestrzennej, a jednocześnie proporcjonalnemu zmniejszeniu pola widzenia. Komponenty soczewek z gradientowym indeksem załamania (GRIN) są kompatybilne z optyką światłowodową, dostępne m.in. w ofertach firm GrinTech, NSG i Schott, i mogą być bezpośrednio łączone z dystalnym końcem wiązki światłowodowej.

1. Wybierz soczewkę GRIN o powiększeniu i odległości roboczej odpowiednich do planowanego zastosowania. Upewnij się, że średnica soczewki jest większa niż średnica wiązki światłowodowej, z którą będziesz pracować. Zaleca się, aby wiązkę światłowodową i soczewkę GRIN zamontować na oddzielnych 3-osiowych manualnych pozycjonerach pod mikroskopem o małym powiększeniu lub stereoskopem, aby zapewnić dokładne wyrównanie przed połączeniem.
2. Nałóż kroplę kleju optycznego (np. kleju utwardzanego promieniami UV marki Norland) na powierzchnię soczewki lub wiązki. Doprowadź oba elementy do kontaktu, korzystając z manualnych pozycjonerów. Naświetl miejsce styku światłem UV zgodnie z dawką zalecaną przez producenta.
3. Aby chronić soczewkę GRIN i miejsce połączenia, można zastosować krótki odcinek aluminiowej kapilary (Small Parts Inc.), aby osłonić złącze. Nasuń kapilarę na złącze i zabezpiecz ją za pomocą epoksydu. Do wykończenia zespołu można użyć rurki termokurczliwej.

3. Obrazowanie mikroendoskopowe

1. Nanieść środek kontrastowy na komórki lub tkankę przeznaczoną do obrazowania. W przypadku proflawiny (0,01% w/v w PBS), obrazowanie in vitro komórek w hodowli można przeprowadzić poprzez krótką inkubację (< 1 minuty) i dokładne przemycie. Obrazowanie preparatów tkankowych ex vivo lub tkanek in vivo jest możliwe po miejscowym zastosowaniu barwnika. Wykazano, że pobieranie proflawiny w tych warunkach jest niemal natychmiastowe, a obrazowanie można rozpocząć w ciągu kilku sekund i prowadzić przez kilka minut.
2. Umieścić wiązkę światłowodową w lekkim kontakcie z obrazowanym obiektem. Podczas obrazowania komórek w hodowli lub preparatów tkankowych ex vivo, zaleca się zamocowanie dystalnego końca wiązki światłowodowej w stabilnym uchwycie z manualnymi stopniami pozycjonującymi w osiach XYZ, aby zapewnić stabilność podczas obrazowania.

4. Reprezentatywne wyniki:

Po prawidłowym złożeniu mikroendoskop będzie działał jako mikroskop epifluorescencyjny, z obrazem przesyłanym za pomocą koherentnego wiązki światłowodowej. Aby uzyskać optymalne wyniki obrazowania, należy zadbać o spełnienie trzech kluczowych warunków:

1. Przybliżona powierzchnia wiązki światłowodowej powinna zostać odwzorowana na kamerze CCD bez rozmycia (defocus), aby uzyskać pełną rozdzielczość systemu. Rysunki 2a,b,c przedstawiają fragment wiązki światłowodowej odwzorowany odpowiednio przy słabym ustawieniu ostrości, lekkim rozmyciu oraz dobrej ostrości. Optymalne ustawienie ostrości uzyskuje się poprzez regulację pozycji osiowej obiektywu względem powierzchni wiązki.
2. Przybliżona powierzchnia wiązki światłowodowej powinna być równomiernie oświetlona w całym jej przekroju (pole widzenia). Jak opisano w tekście protokołu (1.7), osiąga się to poprzez skonfigurowanie optyki oświetlenia zgodnie z zasadą oświetlenia Köhlera. Rysunek 2d przedstawia obraz uzyskany podczas oświetlania jednolitej próbki fluorescencyjnej w tej preferowanej konfiguracji, natomiast rysunek 2e demonstruje odpowiadający mu wynik przy oświetleniu krytycznym. W tym drugim przypadku struktura diody LED zostaje odwzorowana na powierzchni wiązki światłowodowej, co skutkuje pojawieniem się niepożądanego wzoru nałożonego na rzeczywistą strukturę próbki.
3. Zarówno przybliżona, jak i oddalona powierzchnia wiązki światłowodowej powinny być czyste i wolne od zarysowań oraz odprysków. Rysunek 2f pokazuje obecność zanieczyszczeń przytwierdzonych do powierzchni wiązki oraz uszkodzenie w postaci małego odprysku na godzinie 5 na obwodzie światłowodu. Zanieczyszczenia z powierzchni wiązki można usunąć, czyszcząc je w ten sam sposób, co konwencjonalne złącza światłowodowe, używając papieru do soczewek i izopropanolu lub standardowych narzędzi do czyszczenia światłowodów. Jeśli którykolwiek koniec wiązki światłowodowej jest zarysowany lub wyszczerbiony, lub jeśli wiązka pęknie wzdłuż swojej długości, powierzchnię można wyrównać poprzez polerowanie standardowymi technikami ręcznymi lub mechanicznymi. Do wstępnego polerowania zgrubnego zaleca się papier ścierny o ziarnistości 12-15 μm, a do polerowania końcowego papier o ziarnistości 0.5-1.0 μm.

Rysunek 3a przedstawia obrazowanie 1483 komórek in vitro po znakowaniu proflawiną i lekkim przyłożeniu gołego wiązki światłowodów do próbki. Rysunek 3b obrazuje poprawę rozdzielczości przestrzennej i zmniejszenie pola widzenia dzięki zastosowaniu soczewki GRIN o powiększeniu 2,5x przytwierdzonej do końcówki wiązki. Film 1 przedstawia obrazowanie in vivo tkanki tłuszczowej gruczołu mlekowego w modelu mysim. W tym przypadku wiązka światłowodów o średnicy zewnętrznej 0,5 mm (pole widzenia 330 μm) została wprowadzona przez igłę o rozmiarze 21G do tkanki. Komórki tłuszczowe są wyraźnie widoczne, a w tej akwizycji przy 15 klatkach na sekundę dostrzegalny jest ruch wynikający z cyklu pracy serca. Rysunek 3c przedstawia obrazowanie błony śluzowej jamy ustnej u zdrowego ochotnika, tym razem z użyciem większej wiązki światłowodów o średnicy zewnętrznej 1,5 mm (pole widzenia 1,4 mm). We wszystkich przedstawionych przykładach proflawina została użyta jako fluorescencyjny kontrast do znakowania jąder komórkowych.

Rycina 1. Montaż mikroendoskopu o wysokiej rozdzielczości (HRME). (a) Schemat systemu HRME. (b) Montaż głównej optomechanicznej struktury wsporczej. (c) Dodanie elementów optycznych, diody LED do oświetlenia oraz kamery CCD. (d) Fotografia systemu HRME umieszczonego w obudowie o wymiarach 10" x 8" x 2,5".

Rysunek 2. Konfiguracja HRME. Przykłady obrazowania za pomocą wiązki światłowodowej przy (a) słabym ostrzeniu, (b) ostrzeniu bliskim optymalnemu, (c) ostrzeniu idealnym. Na (d) przedstawiono obrazowanie jednolitego celu fluorescencyjnego na dystalnym końcu wiązki przy oświetleniu Köhlera (jednolitym). (e) Jednolity cel fluorescencyjny obrazowany przy oświetleniu krytycznym, z widoczną strukturą źródła na obiekcie. (f) Luźna tkanka i komórki mogą przyklejać się do czoła wiązki światłowodowej, która jest również podatna na niewielkie uszkodzenia na obrzeżach.

Rycina 3. Obrazowanie za pomocą HRME. (a) 1483 komórki in vitro, obrazowane za pomocą gołego wiązka włókien (IGN-08/30) po znakowaniu proflawiną 0,01% (w/v). (b) Ta sama hodowla 1483 komórek co na (a), obrazowana za pomocą wiązka włókien z przymocowaną soczewką GRIN 2,5x. (c) Obraz prawidłowej błony śluzowej jamy ustnej człowieka in vivo, po miejscowym zastosowaniu proflawiny 0,01% (w/v).

Film 1. Obrazowanie podskórnej tkanki tłuszczowej gruczołu mlekowego myszy poprzez wprowadzenie wiązki światłowodów o średnicy zewnętrznej 450 μm do światła igły 21G wprowadzonej do tkanki. Przed wprowadzeniem światłowodu obrazującego, do miejsca obrazowania podano proflawinę 0,01% (w/v) za pomocą tej samej igły. Kliknij tutaj, aby obejrzeć wideo

Dyskusja

Opisana tutaj technika mikroendoskopii o wysokiej rozdzielczości zapewnia badaczom w obszarze podstawowych badań biomedycznych i klinicznych elastyczną, niezawodną i kosztowo efektywną metodę wizualizacji szczegółów komórkowych in situ. Przedstawiliśmy protokół montażu systemu obrazowania oraz zademonstrowaliśmy jego zastosowanie w hodowlach komórkowych in vitro oraz w tkankach zwierzęcych i ludzkich in vivo. Chociaż w zaprezentowanych tutaj wynikach obrazowania jako fluorescencyjny środek kontrastowy zastosowano proflawinę, inne grupy zademonstrowały wersje systemu z długościami fal oświetlenia LED i filtrami dobranymi do widm pobudzenia / emisji innych barwników ^5-7.

Rozdzielczość i pole widzenia są początkowo określone przez odstęp między rdzeniami oraz średnicę obrazowania wiązki światłowodowej. Użyliśmy wiązek o odstępie między rdzeniami wynoszącym około 4 μm oraz średnicach obrazowania 330 μm (film 1), 720 μm (rycina 2, rycina 3a,b) i 1400 μm (rycina 3c). Mniejsze wiązki mogą być wprowadzane przez igły o mniejszym rozmiarze i są znacznie bardziej elastyczne niż większe włókna. My oraz inni autorzy ⁸ odnotowaliśmy w niektórych przypadkach występowanie emisji autofluorescencji z samej wiązki światłowodowej. Podczas prób wzbudzania fluoroforów w zakresie fal UV lub zbierania emisji w czerwonym zakresie widma należy zwrócić uwagę na poziom autofluorescencji wiązki światłowodowej, który wpływa na całkowity zmierzony sygnał.

Choć w większości raportowanych do tej pory prac nad mikroendoskopią o wysokiej rozdzielczości wykorzystywano gołe wiązki światłowodowe, dodatkowe powiększenie można uzyskać dzięki zastosowaniu soczewek GRIN przytwierdzonych do dystalnego końca. Soczewki GRIN stanowią prosty i ekonomiczny sposób na zwiększenie rozdzielczości przestrzennej, choć ich podatność na aberracje optyczne oraz ograniczona NA są dobrze znane. Jeśli wydajność soczewki GRIN jest niewystarczająca dla konkretnego zastosowania, można zastosować hybrydowe obiektywy GRIN / sferyczne ⁹ lub miniaturowe zestawy soczewek obiektywowych ^10-11.

Opisany tutaj mikroendoskop o wysokiej rozdzielczości działa zasadniczo jak szerokopolowy mikroskop epi-fluorescencyjny; w związku z tym nie należy spodziewać się sekcjonowania optycznego (takiego jak w mikroskopii konfokalnej lub nieliniowej). Z naszego doświadczenia wynika, że przy zastosowaniu światła wzbudzenia o długości fali 455 nm oraz miejscowo podanej proflawiny jako środka kontrastowego, światło jest zbierane głównie z głębokości odpowiadającej kilku warstwom komórek.

Niniejszy protokół ma na celu umożliwienie czytelnikowi montażu mikroendoskopu o wysokiej rozdzielczości na blacie laboratoryjnym, przy zajmowanej powierzchni zaledwie 10" x 8". W razie potrzeby system można zamknąć w obudowie, a komponenty elektryczne (LED i kamerę) zasilić za pomocą pakietu baterii (Rysunek 1d). Wiele kompaktowych kamer może być zasilanych przez porty IEEE-1394 (Firewire) i USB komputera gospodarza.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Kamera CCD	Point Grey Research	GRAS-14S5M
LED	Thorlabs Inc.	M455L2	Wybrany do zastosowania z proflawiną – inne fluorofory mogą wymagać innych komponentów
Filtr wzbudzenia	Semrock	452/45	Wybrany do zastosowania z proflawiną – inne fluorofory mogą wymagać innych komponentów
Filtr emisji	Semrock	550/88	Wybrany do zastosowania z proflawiną – inne fluorofory mogą wymagać innych komponentów
Lustro dichroiczne	Chroma Technology Corp.	485 DCLP	Wybrany do zastosowania z proflawiną – inne fluorofory mogą wymagać innych komponentów
Obiektyw	Thorlabs Inc.	RMS 10X
Soczewka tubusowa	Thorlabs Inc.	AC-254-150-A1	Należy dobrać ogniskową, aby uzyskać wymagane powiększenie w kamerze CCD
Soczewka kondensora	Thorlabs Inc.	ACL2520
Kostka systemu Cage	Thorlabs Inc.	C6W, B1C, B3C, B5C, SM1CP2
Pręty i płytki systemu Cage	Thorlabs Inc.	ER05 (x4), ER1.5 (x2), ER2 (x2), ER6 (x2), CP02 (x3)
Jednostka lustra zwrotnego	Thorlabs Inc.	KCB1, PF10-03-G01
Tubusy soczewkowe	Thorlabs Inc.	SM1L05, SM1L30, SM1V05 (lub SM1Z)
Adaptery / sprzęgła	Thorlabs Inc.	SM1A3, SM1A9, SM1T2 (x2)
Złącza SMA	Thorlabs Inc.	SM1SMA, 11040A
Sterownik LED	Thorlabs Inc.	LEDD1B TPS001
Wiązka światłowodowa	Sumitomo Bakelite Co., Ltd.	IGN-08/30	Dostępne są wiązki o większej lub mniejszej średnicy (Sumitomo / Fujikura)