Mikroendoskopia światłowodowa o wysokiej rozdzielczości do obrazowania komórkowego in situ

Podsumowanie

W wielu sytuacjach biologicznych i klinicznych korzystne jest badanie procesów komórkowych w miarę ich ewolucji w ich naturalnym mikrośrodowisku. W tym miejscu opisujemy montaż i użytkowanie taniego mikroskopu światłowodowego, który może zapewnić obrazowanie w czasie rzeczywistym w hodowlach komórkowych, badaniach na zwierzętach i klinicznych badaniach pacjentów.

Streszczenie

Wiele badań biologicznych i klinicznych wymaga badania podłużnego i analizy morfologii i funkcji z rozdzielczością na poziomie komórkowym. Tradycyjnie, wiele eksperymentów jest przeprowadzanych równolegle, a poszczególne próbki są usuwane z badania w sekwencyjnych punktach czasowych w celu oceny za pomocą mikroskopii świetlnej. Opracowano kilka technik przyżyciowych, w tym mikroskopię konfokalną, wielofotonową i mikroskopię drugiej harmonicznej, które wykazały swoją zdolność do wykorzystania do obrazowania in situ ¹. Jednak w przypadku tych systemów wymagana infrastruktura jest złożona i kosztowna, obejmująca skanujące systemy laserowe i złożone źródła światła. Poniżej przedstawiamy protokół projektowania i montażu mikroendoskopu o wysokiej rozdzielczości, który można zbudować w ciągu jednego dnia przy użyciu gotowych komponentów za mniej niż 5 000 USD. Platforma oferuje elastyczność w zakresie rozdzielczości obrazu, pola widzenia i długości fali roboczej, a my opisujemy, w jaki sposób parametry te można łatwo modyfikować, aby spełnić specyficzne potrzeby użytkownika końcowego.

My i inni badaliśmy zastosowanie mikroendoskopu o wysokiej rozdzielczości (HRME) w hodowli in vitro ^2-5 komórek, w wyciętych ⁶ i żywych tkankach zwierzęcych ^2,5 oraz w tkankach ludzkich in vivo ^2,7. Użytkownicy zgłaszali stosowanie kilku różnych fluorescencyjnych środków kontrastowych, w tym proflawiny ^2-4, pochodnego benzoporfiryny pierścienia monokwasowego A (BPD-MA^{) 5} i fluorosceiny ^6,7, z których wszystkie otrzymały pełne lub eksperymentalne zatwierdzenie od FDA do stosowania u ludzi. Mikroendoskopia wysokorozdzielcza, w opisanej tu formie, może spodobać się szerokiemu gronu badaczy zajmujących się naukami podstawowymi i klinicznymi. Technika ta oferuje skuteczne i ekonomiczne podejście, które uzupełnia tradycyjną mikroskopię laboratoryjną, umożliwiając użytkownikowi wykonywanie obrazowania podłużnego in situ o wysokiej rozdzielczości.

Protokół

1. Zespół mikroendoskopu

Opisany tutaj mikroendoskop o wysokiej rozdzielczości (rysunek 1a) powinien być traktowany jako konfiguracja bazowa z kilkoma możliwymi wariantami montażu i zastosowania. Szczegółowo opisujemy tutaj przykład wykonania platformy, która jest przeznaczona do stosowania z proflawiną jako fluorescencyjnym środkiem kontrastowym. Proflawina jest jasnym barwnikiem jądrowym o szczytowych długościach fal absorpcji i emisji odpowiednio 445 nm i 515 nm. Stosowanie innych środków kontrastowych będzie wymagało od użytkownika odpowiedniego doboru filtrów wzbudzenia, emisji i dichroicznych. Kilka elementów mikroendoskopu o wysokiej rozdzielczości jest ogólnych i można je uzyskać od wielu dostawców. Na przykład optomechaniczne komponenty pozycjonujące są dostępne między innymi w Thorlabs, Newport, Linos. Kompaktowe kamery CCD są dostępne w takich firmach jak Point Grey Research, Prosilica i Retiga; Czułość kamery należy dobierać z uwzględnieniem jasności używanego fluoroforu, a także żądanej liczby klatek na sekundę. Diody elektroluminescencyjne (LED) dużej mocy można dostać m.in. od Luxeon, Cree i Nichia. Wiązki światłowodowe są dostępne w firmach Sumitomo, Fujikura i Schott. Wybierając komponenty do konkretnego zastosowania, użytkownik powinien wziąć pod uwagę nieodłączne zależności związane z mikroskopią fluorescencyjną między stężeniem fluoroforu, fotowybielaniem, intensywnością oświetlenia, czułością kamery, wzmocnieniem i czasem ekspozycji.

1. Połącz pręty klatkowe 6" z prętami klatkowymi 1.5", aby utworzyć parę prętów o długości 7.5". Przykręć te pręty do jednej powierzchni składanego lusterka. Wkręć pręty 0.5" w przeciwną powierzchnię. Wsuń kostkę klatki na pręty klatki przez dwa dolne otwory przelotowe. Wkręć pręty 2" w boczną powierzchnię kostki klatki (rysunek 1b).
2. Przymocuj kamerę do płyty klatki za pomocą adaptera C-mount do SM1. Przymocuj płytę klatki na prętach klatki 0.5", równo z powierzchnią czołową składanego zespołu lusterka.
3. Włóż soczewkę "tubusu" do tubusu obiektywu o długości 3 cali i zabezpiecz obiektyw pierścieniem mocującym. Ogniskowa obiektywu powinna być tak dobrana, aby rdzenie wiązki światłowodowej były próbkowane przez co najmniej dwa piksele podczas rzutowania na kamerę. Wrzuć filtr emisji do rurki na pierwszym pierścieniu ustalającym i dodaj kolejny pierścień, aby zabezpieczyć filtr na miejscu. Przestrzegać konwencji orientacji filtra wskazanej przez producenta filtra. Przykręć tubus obiektywu w bok kostki klatki znajdującej się najbliżej kamery CCD. Zwróć uwagę, że na rysunku 1c ten obiektyw i filtr są pokazane bez 3-calowego tubusu obiektywu, aby zapewnić przejrzystość.
4. Podłącz kamerę do komputera i wyświetl obraz na ekranie. Skieruj zespół klatki na odległy obiekt i przesuwaj sześcian klatki wzdłuż szyn, aż obraz będzie ostry. Zablokuj kostkę klatki w tym miejscu. (Jest to prosta metoda zapewniająca, że soczewka tubusu utworzy ostry obraz w połączeniu z soczewką obiektywową z korekcją do nieskończoności).
5. Włóż lusterko dichroiczne do uchwytu i umieść pod kątem 45° w kostce klatki.
6. Przykręć soczewkę obiektywu za pomocą adaptera z gwintem RMS do SM1 i regulowanego tubusu obiektywu w powierzchnię kostki klatki naprzeciwko uchwytu soczewki tubusu. Zamiast regulowanego tubusu obiektywu można użyć tłumacza Z, aby ułatwić ustawianie ostrości. Przykręć złącze SMA do płytki klatki i zamontuj je na prętach, w przybliżeniu w odległości roboczej soczewki obiektywu.
7. Zamontuj diodę LED na płycie klatkowej i wsuń na koniec prętów 2". Dodaj soczewkę do tubusu obiektywu 0,5 cala tak, aby po wkręceniu tej rurki w bok kostki klatkowej utworzył obraz diody LED, który wypełnia tylną aperturę soczewki obiektywu. Ta konfiguracja (oświetlenie Kohlera) zapewni, że bliższa powierzchnia wiązki światłowodowej jest równomiernie oświetlona. Dodaj filtr wzbudzenia do tubusu obiektywu 0,5" i zabezpiecz go pierścieniem ustalającym (rysunek 1c).
8. Podłącz złącze SMA do wiązki światłowodowej. Przykręć wiązkę złącza SMA do gniazda SMA zamontowanego na prętach klatki. Skieruj dystalny koniec wiązki w stronę szerokopasmowego źródła światła (wystarczy oświetlenie fluorescencyjne) i obserwuj obraz bliższej powierzchni wiązki na kamerze CCD. Dostosuj położenie soczewki obiektywu, wkręcając lub wykręcając kostkę klatkową, aż obraz wiązki włókien będzie ostry. Poszczególne rdzenie powinny być wyraźnie widoczne (rysunek 2).

2. Zespół soczewki GRIN

Rozdzielczość przestrzenną mikroendoskopu można zwiększyć poprzez przymocowanie mikrosoczewki lub zespołu soczewek do dystalnej końcówki wiązki włókien. Te układy optyczne są skonfigurowane w taki sposób, że zamiast umieszczać końcówkę pęczka bezpośrednio na tkance, końcówka jest obrazowana na powierzchni tkanki z demagnififikacją, zwiększając w ten sposób częstotliwość próbkowania przestrzennego narzuconą przez rdzenie prowadzące światło wiązki włókien. Stopień powiększenia odpowiada wzrostowi rozdzielczości przestrzennej, a jednocześnie proporcjonalnemu spadkowi pola widzenia. Komponenty soczewek o indeksie gradientu (GRIN) są kompatybilne ze światłowodami i są dostępne między innymi w firmach GrinTech, NSG, Schott i mogą być bezpośrednio połączone z dystalną końcówką wiązki światłowodów.

1. Wybierz soczewkę GRIN o żądanym powiększeniu i odległości roboczej do swojego zastosowania. Upewnij się, że średnica soczewki przekracza średnicę wiązki włókien, z którą planujesz pracować. Zalecamy, aby wiązka światłowodu i soczewka GRIN były zamontowane na oddzielnych 3-osiowych stopniach ręcznego pozycjonowania pod mikroskopem małej mocy lub stereoskopem w celu dokładnego wyrównania przed klejeniem.
2. Umieść kroplę kleju optycznego (np. Klej utwardzany promieniami UV Norland) na soczewce lub powierzchni wiązki. Doprowadzić oba elementy do kontaktu za pomocą ręcznych pozycjonerów. Wystaw interfejs na działanie światła UV w dawce zalecanej przez producenta.
3. Aby chronić soczewkę GRIN i klejony interfejs, do zamknięcia złącza można użyć krótkiego odcinka aluminiowej rurki kapilarnej (Small Parts Inc.). Nasuń rurkę na złącze i zabezpiecz na miejscu żywicą epoksydową. Do wykończenia montażu można użyć rurki termokurczliwej.

3. Obrazowanie mikroendoskopowe

1. Nałóż środek kontrastowy na komórki lub tkankę, która ma być zobrazowana. W przypadku proflawiny (0,01% w/v w PBS) obrazowanie in vitro komórek w hodowli można przeprowadzić przez krótką inkubację (< 1 minutę) i dokładne płukanie. Obrazowanie próbek tkanek ex vivo lub tkanek in vivo jest możliwe po miejscowym zastosowaniu barwnika. Stwierdzono, że wychwyt proflawiny w tych warunkach jest niemal natychmiastowy, a obrazowanie jest możliwe w ciągu kilku sekund i trwa kilka minut.
2. Umieść wiązkę światłowodu w lekkim kontakcie z próbką, która ma być obrazowana. Podczas obrazowania komórek w hodowli lub próbkach tkanek ex vivo zalecamy zamontowanie dystalnego końca wiązki włókien w bezpiecznym uchwycie z ręcznymi stopniami pozycjonowania na osiach XYZ w celu zapewnienia stabilności podczas obrazowania.

4. Reprezentatywne wyniki:

Po prawidłowym zmontowaniu, mikroendoskop będzie działał jak mikroskop epi-fluorescencyjny, przekazywany przez spójny wiązkę światłowodów. W celu uzyskania optymalnych wyników obrazowania należy zwrócić uwagę na spełnienie trzech kluczowych warunków:

1. Proksymalna powierzchnia wiązki światłowodów powinna być zobrazowana na kamerze CCD bez rozmycia, aby osiągnąć pełną rozdzielczość systemu. Rysunek 2a,b,c przedstawia część wiązki włókien zobrazowaną odpowiednio ze słabą ostrością, lekkim rozmyciem i dobrą ostrością. Optymalna ostrość uzyskuje się poprzez regulację położenia osiowego soczewki obiektywu względem powierzchni wiązki.
2. Bliższa powierzchnia wiązki włókien powinna być równomiernie oświetlona na całej jej średnicy (pole widzenia). Jak opisano w tekście protokołu (1.7), osiąga się to poprzez konfigurację optyki oświetlenia dla oświetlenia Kohlera. Rysunek 2d przedstawia obraz uzyskany, gdy jednorodna próbka fluorescencyjna jest oświetlona w tej preferowanej konfiguracji, przy czym rysunek 2e pokazuje odpowiedni wynik w krytycznym oświetleniu. W tym drugim przypadku struktura diody LED jest obrazowana na powierzchni wiązki włókien, co powoduje pojawienie się tego niechcianego wzoru nałożonego na prawdziwą strukturę próbki.
3. Zarówno proksymalne, jak i dystalne powierzchnie wiązki włókien powinny być czyste i wolne od zadrapań i odprysków. Rysunek 2f pokazuje obecność zanieczyszczeń przyczepionych do czoła wiązki, z uszkodzeniami w postaci małego wióra na godzinie 5 na obwodzie światłowodu. Zanieczyszczenia można usunąć z powierzchni wiązki, czyszcząc je w taki sam sposób, jak w przypadku konwencjonalnych złączy światłowodowych, za pomocą papieru do soczewek i izopropanolu lub standardowych narzędzi do czyszczenia światłowodów. Jeśli którykolwiek koniec wiązki włókien jest porysowany lub wyszczerbiony, lub jeśli wiązka pęknie na całej swojej długości, powierzchnię czołową można wypolerować na płasko za pomocą standardowych technik polerowania ręcznego lub mechanicznego. Do wstępnego polerowania zgrubnego zalecamy papier do docierania o grubości 12-15 μm, a następnie na papierze o grubości 0,5-1,0 μm.

Rysunek 3a przedstawia obrazowanie 1483 komórek in vitro, po znakowaniu proflawiną i lekkim umieszczeniu wiązki gołych włókien na próbce. Rysunek 3b przedstawia poprawę rozdzielczości przestrzennej i zmniejszenie pola widzenia zapewniane przez soczewkę GRIN o powiększeniu 2,5x przymocowaną do końcówki wiązki. Film 1 przedstawia obrazowanie in vivo poduszeczki tłuszczowej sutka w modelu mysim. W tym przypadku wiązka włókien o średnicy zewnętrznej 0,5 mm (pole widzenia 330 μm) została przepuszczona przez igłę o rozmiarze 21 i wsunięta w tkankę. Komórki tłuszczowe są wyraźnie widoczne, a ruch spowodowany cyklem serca jest widoczny w tej akwizycji przy 15 klatkach na sekundę. Rycina 3c przedstawia obrazowanie błony śluzowej jamy ustnej u zdrowego ochotnika, tym razem przy użyciu większego wiązki włókien o średnicy zewnętrznej 1,5 mm (pole widzenia 1,4 mm). We wszystkich pokazanych przykładach proflawina była stosowana jako fluorescencyjny środek kontrastowy znakujący jądra.

Rysunek 1. Montaż mikroendoskopu o wysokiej rozdzielczości (HRME). a) Schemat ideowy systemu HRME. b) Montaż głównej optomechanicznej konstrukcji wsporczej. (c) Dodanie elementów optycznych, diody LED oświetlenia i kamery CCD. (d) Zdjęcie systemu HRME, zapakowanego w obudowę o wymiarach 10" x 8" x 2,5".

Rysunek 2. Konfiguracja HRME. Przykłady obrazowania z wiązką światłowodową w (a) słabej ostrości, (b) bliskiej dobrej ostrości, (c) idealnej ostrości. W (d) jednolity cel fluorescencyjny na dystalnym końcu wiązki jest obrazowany w (jednolitym) oświetleniu Kohlera. (e) Jednolity cel fluorescencyjny zobrazowany w krytycznym oświetleniu, ze strukturą źródłową widoczną na obiekcie. (f) Luźna tkanka i komórki mogą przyklejać się do powierzchni wiązki włókien, która jest również podatna na drobne uszkodzenia na jej obrzeżach.

Rysunek 3. Obrazowanie za pomocą HRME. a) 1483 komórki in vitro, zobrazowane z pęczkiem gołych włókien (IGN-08/30) po znakowaniu proflawiną 0,01% (w/v). (b) Ta sama hodowla komórkowa 1483, jak pokazano w (a), zobrazowana z wiązką włókien z dołączoną soczewką GRIN 2,5x. c) Obraz prawidłowej błony śluzowej jamy ustnej człowieka in vivo, po miejscowym zastosowaniu proflawiny 0,01% (w/v).

Film 1. Obrazowanie poduszeczki tłuszczowej sutka myszy poprzez wprowadzenie wiązki włókien o średnicy zewnętrznej 450 μm w świetle igły o rozmiarze 21 wprowadzonej do tkanki. Proflawina 0,01% (w/v) była dostarczana do miejsca obrazowania przez tę samą igłę przed wprowadzeniem włókna obrazowania. Kliknij tutaj, aby obejrzeć film

Dyskusja

Opisana tutaj technika mikroendoskopii o wysokiej rozdzielczości zapewnia naukowcom zajmującym się podstawowymi obszarami badań biomedycznych i klinicznych elastyczną, solidną i opłacalną metodę wizualizacji szczegółów komórkowych in situ. Opisaliśmy protokół montażu systemu obrazowania i wykazaliśmy jego zastosowanie w hodowlach komórkowych in vitro oraz w tkankach zwierzęcych i ludzkich in vivo. Podczas gdy przedstawione tutaj wyniki obrazowania wykorzystywały proflawinę jako fluorescencyjny środek kontrastowy, inne grupy zademonstrowały wersje systemu z długościami fal oświetlenia LED i filtrami dobranymi tak, aby pasowały do widm wzbudzenia / emisji innych barwników ^5-7.

Rozdzielczość i pole widzenia są początkowo określane na podstawie odstępów między rdzeniami i średnicy obrazowania wiązki światłowodowej. Użyliśmy wiązek o rozstawie rdzeń-rdzeń wynoszący około 4 μm i średnicach obrazowania 330 μm (film 1), 720 μm (rysunek 2, rysunek 3a,b) i 1400 μm (rysunek 3c). Mniejsze wiązki mogą być przepuszczane przez węższe igły i są znacznie bardziej elastyczne niż większe włókna. My i inni ⁸ zauważyliśmy, w niektórych przypadkach, pojawienie się emisji autofluorescencji z samej wiązki światłowodów. Próbując wzbudzić fluorofory na długościach fal UV lub zebrać emisję w czerwonym zakresie widmowym, należy zwrócić uwagę na poziom autofluorescencji wiązki włókien przyczyniającej się do ogólnego mierzonego sygnału.

Podczas gdy większość zgłoszonych do tej pory prac mikroendoskopowych o wysokiej rozdzielczości wykorzystywała goły wiązkę włókien, dodatkowe powiększenie można zapewnić za pomocą soczewek GRIN połączonych z dystalną końcówką. Soczewki GRIN oferują prosty i ekonomiczny sposób na zwiększenie rozdzielczości przestrzennej, chociaż ich podatność na aberracje optyczne i ograniczoną NA jest dobrze znana. Jeśli wydajność soczewki GRIN jest niewystarczająca do konkretnego zastosowania, można zastosować hybrydowe soczewki GRIN / soczewki sferyczne ⁹ lub miniaturowe zespoły soczewek obiektywowych ^10-11 .

Opisany tutaj mikroendoskop o wysokiej rozdzielczości działa zasadniczo jako mikroskop epifluorescencyjny o szerokim polu; W związku z tym nie należy spodziewać się przekrojów optycznych (jak w mikroskopii konfokalnej lub nieliniowej). Z naszego doświadczenia wynika, że przy użyciu światła wzbudzającego 455 nm i miejscowej proflawiny jako środka kontrastowego, światło jest przede wszystkim zbierane z głębokości odpowiadającej kilku warstwom komórek.

Protokół ten powinien umożliwić czytnikowi montaż mikroendoskopu o wysokiej rozdzielczości na stole o kompaktowych wymiarach 10 "x 8". W razie potrzeby system może być zamknięty w pudełku, a elementy elektryczne (dioda LED i kamera) zasilane przez akumulator (Rysunek 1d). Wiele aparatów kompaktowych może być zasilanych przez porty IEEE-1394 (Firewire) i USB komputera hosta.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Kamera CCD	Point Grey Research	GRAS-14S5M
LED	Thorlabs Inc.	M455L2	Wybrany do użytku z proflawiną – inne fluorofory mogą wymagać różnych części
Filtr wzbudzenia	Semrock	452/45	Wybrany do użytku z proflawiną – inne fluorofory mogą wymagać różnych części
Filtr emisyjny	Semrock	550/88	Wybrany do użytku z proflawiną – inne fluorofory mogą wymagać różnych części
Lustro	dichroiczneChroma Technology Corp.	485 DCLP	Wybrany do użytku z proflawiną – inne fluorofory mogą wymagać różnych części
Soczewka	obiektywowa Thorlabs Inc.	Obiektyw tubusu RMS 10X
	Thorlabs Inc.	AC-254-150-A1	Wybierz ogniskową, aby uzyskać wymagane powiększenie do
soczewki kondensacyjnej	Thorlabs Inc.
Jednostka kostka klatkowa	Thorlabs Inc.	C6W, B1C, B3C, B5C, SM1CP2
Pręty i płyty klatkowe	Thorlabs Inc.	ER05 (x4), ER1.5 (x2), ER2 (x2), ER6 (x2), CP02 (x3)
Składana jednostka lustrzana	Thorlabs Inc.	KCB1, PF10-03-G01
Tubusy obiektywu	Thorlabs Inc.	SM1L05, SM1L30, SM1V05 (lub SM1Z)
Adaptery / łączniki	Thorlabs Inc.	Złącza SM1A3, SM1A9, SM1T2 (x2)
SMA	Thorlabs Inc.	SM1SMA, 11040A
Sterownik LED	Thorlabs Inc.	LEDD1B TPS001
Wiązka światłowodowa	Sumitomo Bakelite Co., Ltd.	IGN-08/30	Dostępne są większe lub mniejsze pakiety (Sumitomo / Fujikura)