Izolacja i hodowla komórek śródbłonka płuc noworodków myszy

Podsumowanie

W niniejszej pracy opisujemy protokół izolacji i hodowli mysich komórek śródbłonka płuc. Metoda ta obejmuje mechaniczną i enzymatyczną dysocjację tkanki płucnej oraz dwuetapowy proces oczyszczania z wykorzystaniem przeciwciał anty-PECAM-1 oraz anty-ICAM-2 sprzężonych z kuleczkami magnetycznymi, co pozwala na uzyskanie czystej populacji komórek śródbłonka pochodzenia głównie naczyniowego mikroskopowego.

Streszczenie

Komórki śródbłonka stanowią użyteczny model badawczy w wielu obszarach biologii naczyniowej. Od czasu ich pierwszej izolacji ¹, ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVECs) okazały się wygodne, łatwe do pozyskania i hodowli, przez co są najszerzej badanymi komórkami śródbłonka. Jednakże w badaniach koncentrujących się na procesach takich jak angiogeneza, przepuszczalność czy wielu innych, znacznie bardziej istotnym fizjologicznie modelem do badań są komórki śródbłonka (ECs) mikrokrążenia ². Co więcej, ECs izolowane z myszy z nokautem genowym stanowią przydatne narzędzie do analizy funkcji białek ex vivo. Do tej pory opisano kilka podejść do izolacji i hodowli mikrokrążeniowych ECs różnego pochodzenia ^3-7, ale spójna izolacja i hodowla czystych ECs wciąż stanowi główny problem techniczny w wielu laboratoriach. W niniejszym materiale przedstawiamy protokół krok po kroku opisujący niezawodną i stosunkowo prostą metodę izolacji i hodowli komórek śródbłonka płuc myszy (MLECs). W tym podejściu tkankę płucną pobraną od szczeniąt w wieku od 6 do 8 dni jest najpierw cięta na kawałki, trawiona roztworem kolagenazy/dispazy (C/D) i rozbijana mechanicznie do postaci zawiesiny pojedynczych komórek. MLECs są oczyszczane z zawiesiny komórkowej za pomocą selekcji pozytywnej z użyciem przeciwciała anty-PECAM-1 sprzężonego z Dynabeads przy wykorzystaniu koncentratora cząstek magnetycznych (MPC). Tak oczyszczone komórki hoduje się na szalkach hodowlanych (TC) powlekanych żelatyną do momentu osiągnięcia konfluencji. W tym punkcie komórki są dodatkowo oczyszczane przy użyciu Dynabeads sprzężonych z przeciwciałem anty-ICAM-2. MLECs uzyskane za pomocą tego protokołu wykazują fenotyp „brukowca” (cobblestone), co jest widoczne w mikroskopii świetlnej w kontraście fazowym, a ich fenotyp śródbłonkowy został potwierdzony za pomocą analizy FACS z przeciwciałami anty-VE-cadherin ⁸ i anty-VEGFR2 ⁹ oraz barwienia immunofluorescencyjnego VE-cadherin. W naszych badaniach ta dwuetapowa procedura izolacji w sposób spójny i niezawodny pozwala uzyskać czystą populację MLECs, które można następnie hodować. Metoda ta umożliwi badaczom wykorzystanie rosnącej liczby myszy z nokautem genowym i myszy transgenicznych do bezpośredniego korelowania badań in vivo z wynikami eksperymentów in vitro przeprowadzonych na izolowanych MLECs, co pomoże w odkryciu mechanizmów molekularnych fenotypów naczyniowych obserwowanych in vivo.

Protokół

1. Przygotowanie magnetycznych kulek (Dynabeads) sprzężonych z przeciwciałem anty-PECAM-1

1. Przygotować 0,1% BSA w PBS, mieszając 50 mg BSA w 50 ml PBS za pomocą wortexa do całkowitego rozpuszczenia BSA. Sterylizować poprzez filtrowanie przez filtr strzykawkowy 0,22 μm. Przechowywać w temperaturze 4°C.
2. W komorze z laminarnym przepływem powietrza przenieść 200 μl dobrze resuspendowanych kulek Dynabeads z przeciwciałami owczymi anty-rat IgG do probówki Eppendorf o pojemności 1,5 ml i wyprać kulki: Umieścić probówkę na MPC i pozostawić na około 1 min, aby kulki mogły osadzić się na dnie. Odessać nadsącz, zdjąć probówkę z MPC i resuspender kulki w 1 ml sterylnego 0,1% BSA/PBS. Resuspender kulki, pipetując ciecz w górę i w dół.
3. Powtórzyć płukanie jeszcze trzy razy, tak aby łącznie wykonać cztery płukania.
4. Zdjąć probówkę z MPC i resuspender kulki w 500 μl 0,1% BSA/PBS.
5. Do probówki dodać 10 μl przeciwciał szczurzych anty-mysich PECAM-1 (CD-31).
6. Inkubować w rotatorze przez noc w temperaturze 4°C w chłodni lub przez 2 h w temperaturze pokojowej.
7. Wyprać kulki sterylnym 0,1% BSA/PBS cztery razy, zgodnie z opisem w punkcie 1.2.
8. Zdjąć probówkę z MPC i resuspender kulki w 200 μl 0,1% BSA/PBS. Przechowywać kulki Dynabeads sprzężone z przeciwciałami anty-PECAM-1 w temperaturze 4°C do 1 miesiąca.

2. Izolowanie komórek śródbłonka płuc myszy z myszy noworodkowych

Przed przystąpieniem do protokołu oczyszczania tkanek wymagana jest zgoda Komisji IACUC na przeprowadzenie procedury.

1. Przygotuj następujące elementy:
   • 15 ml roztworu C/D o stężeniu 1 mg/ml w DMEM. Przefiltrować za pomocą 0.22 μm przefiltrować za pomocą filtra strzykawkowego i ogrzać do 37°C.
   • probówka stożkowa 50 ml z 15 ml DMEM, przechowywać w lodzie
   • Pożywka do izolacji (IM) zawierająca 20% FBS i 1x penicylinę/streptomycynę w DMEM
   • 2% żelatyna. Wymieszać 2 g żelatyny z skóry bydlęcej ze 100 ml wody dd, autoklawować przez 15 minut i przechowywać w 4°CPodgrzać do 37°C do upłynnienia przed powlekaniem kolb TC.
2. Zanurzyć trzy szczenięta w wieku 6–8 dni w znieczuleniu, podając dożylnie (IP) ketaminę (100 mg/kg) i ksylazynę (10 mg/kg). Sprawdzić skuteczność znieczulenia, a następnie przeprowadzić sekcję zwierząt pojedynczo w następujący sposób: przytwierdzić szczenięta do podkładki, nasączyć skórę 70% etanolem i usunąć skórę z okolic klatki piersiowej za pomocą sterylnych nożyczek do sekcji. Wyciąć klatkę piersiową, aby odsłonić płuca.
3. Aseptycznie wycinamy poszczególne płaty płuc, uważając, aby nie przeciąć oskrzeli ani widocznej tkanki łącznej wokół płuc. Wszystkie płuca umieszczamy w schłodzonym w lodzie medium DMEM. Uśmiercamy szczenięta.
4. Pracując w dygestorium do hodowli tkankowych, wyjąć płaty płuc z medium DMEM, umieścić je w 100 mm szalce hodowlanej i odessać nadmiar medium DMEM.
5. Za pomocą sterylnych nożyczek drobno posiekaj tkankę, wykonując około 100 cięć. Przenieś ją do 15 ml podgrzanego roztworu C/D w celu trawienia enzymatycznego. Inkubuj przez 45 minut w temperaturze 37°C na rotatorze.
6. W komorze z laminarnym przepływem powietrza odessać zawiesinę trawionej tkanki do strzykawki 20 ml z założoną kaniulą 14 G i poprzez co najmniej 12-krotne przeciskanie rozbić skupki komórek do postaci zawiesiny pojedynczych komórek.
7. Przepuść zawiesinę tkankową przez 70 μm sitko do komórek, a następnie wypłukać sitko 15 ml IM w celu zatrzymania trawienia.
8. Zwiruj zawiesinę komórek z prędkością 400x g przez 5 minut w celu uzyskania osadu.
9. Odssać nadosad i zawiesić osad w 3 ml 0,1% BSA/PBS.
10. Przenieść zawiesinę komórkową do polistyrenowej probówki o okrągłym dnie o pojemności 5 ml i dodać 22.5 μl kuleczki Dynabeads sprzężone z przeciwciałem anty-PECAM-1. Inkubować w rotatorze w temperaturze pokojowej przez 12 minut.
11. Powlec kolbę T75 2 ml 2% żelatyny, a następnie odessać nadmiar żelatyny. Pozostawić żelatynę do wyschnięcia w komorze z laminarnym przepływem powietrza przez około 30 minut przed wysianiem komórek.
12. Po zakończeniu inkubacji z kuleczkami (krok 2.10), podziel zawiesinę komórkową w równych częściach do trzech probówek Eppendorf i zamontuj na MPC.
13. Po osadzeniu kulek za pomocą MPC (ok. 1 min), należy zebrać nadsącz, wyjąć probówkę z MPC, przemyć kulki ok. 1 ml 0,1% BSA/PBS, a następnie ponownie umieścić ją w MPC.
14. Powtórzyć płukanie cztery razy (łącznie 5 płukań)
15. Resuspender kuleczki w 1 ml medium VascuLife z zestawem EnGS-Mv Life Factors Kit oraz 1x penicyliną/streptomycyną (VL) na probówkę, dokładnie mieszając.
16. Wysiać komórki na uprzednio powleczoną kolbę T75 i uzupełnić całkowitą objętość w każdej kolbie do 10 ml za pomocą VL.
17. Następnego dnia należy wymienić medium, pozostawić komórki do wzrostu na jedną pełną dobę, a następnie wymieniać połowę medium co drugi dzień. Gdy komórki są >Gdy osiągną konfluencję na poziomie 70–80% lub więcej (zazwyczaj po 3–4 dniach hodowli), można je wyselekcjonować za pomocą kulek Dynabeads z przeciwciałem anty-ICAM-2.

3. Przygotowanie kulek Dynabeads sprzężonych z przeciwciałem anty-ICAM-2

1. Kule Dynabeads sprzężone z przeciwciałem anty-ICAM-2 są wykorzystywane do dalszej puryfikacji komórek, które zostały wyselekcjonowane za pomocą kulek Dynabeads sprzężonych z przeciwciałem anty-PECAM-1 i hodowane do momentu osiągnięcia konfluencji. Procedurę tę przeprowadza się zgodnie z opisem dla kulek Dynabeads sprzężonych z przeciwciałem anty-PECAM-1 (punkt 1 powyżej), z zastąpieniem przeciwciała anty-PECAM-1 przeciwciałem anty-mysim ICAM-2 (CD-102).
2. Kule Dynabeads sprzężone z przeciwciałem anty-ICAM-2 mogą być przechowywane w temperaturze 4°C przez maksymalnie 1 miesiąc.

4. Sortowanie komórek śródbłonka płuc myszy za pomocą kulek Dynabeads z przeciwciałem anty-ICAM-2

1. Pokryć kolbę do hodowli tkankowej T75 2% żelatyną.
2. Odssać medium z konfluentnej kolby T75 z komórkami i przemyć 8 ml PBS.
3. Odssać PBS, dodać 2 ml 0,05% Trypsyny/EDTA i pozostawić do odklejenia się komórek (około 5 minut). Delikatnie opukać kolby, aby ułatwić odklejanie.
4. Po odklejeniu się komórek dodać 2 ml IM, aby zahamować działanie trypsyny, i zeskrobać pozostałe przylegające komórki. Przenieść zawiesinę komórkową do probówki 15 ml i wirować przez 5 min przy 400x g.
5. Odssać medium i resuspendować osad komórkowy w 2 ml 0,1% BSA/PBS.
6. Przenieść do 5 ml polistyrenowej probówki o okrągłym dnie i dodać 10 μl kulek Dynabeads anti-ICAM-2. Mieszać w rotatorze przez 12 minut w RT.
7. Rozdzielić zawiesinę komórkową do dwóch probówek Eppendorf 1,5 ml i zamocować w MPC.
8. Odssać nadsącz po jednej minucie od przywierania kulek. Zdjąć probówki z MPC i resuspendować zawartość każdej probówki w 1 ml 0,1% BSA/PBS. Ponownie zamocować w MPC.
9. Powtórzyć płukanie czterokrotnie (łącznie 5 płukań).
10. Resuspendować zawartość każdej probówki w 1 ml VL i przeprowadzić zliczenie komórek.
11. Wysiać komórki w zagęszczeniu 250-350K komórek na kolbę T25 i/lub 750K-1 milion komórek na kolbę T75.
12. Uzupełnić objętość do 5 ml VL w kolbach T25 oraz do 10 ml w kolbach T75.
13. Wymieniać medium co drugi dzień. Komórki można wykorzystać do eksperymentów, gdy hodowla osiągnie około 80% konfluencji, zazwyczaj w ciągu 2-3 dni.

5. Reprezentatywne wyniki

Zazwyczaj po 6-7 dniach od wstępnego przygotowania komórek jesteśmy w stanie uzyskać około 1,2 - 1,5 x 10⁶ komórek śródbłonka płuc z trzech 6-8 dniowych szczeniąt. W badaniu pod mikroskopem świetlnym komórki wykazują typową morfologię „brukową” oraz barwienie VE-cadherin (CD144) w połączeniach międzykomórkowych, co jest charakterystyczne dla komórek śródbłonka (Rysunek 1). Większość MLEC wykazuje ekspresję VE-cadherin i VEGFR2, co zostało wykazane w analizie FACS (Rysunek 2). Zazwyczaj wykorzystujemy je do eksperymentów w ciągu dwóch tygodni od wstępnej izolacji MLEC.

Rysunek 1. Analiza mikroskopowa konfluentnej warstwy MLEC. (A) Obraz z mikroskopii świetlnej pokazuje morfologię brukową hodowanych komórek, typową dla komórek śródbłonka. Jednorodne, okrągłe struktury zlokalizowane w obszarze okojądrowym wielu komórek to kulki magnetyczne użyte do izolacji MLEC. (B) Specyficzna dla śródbłonka VE-cadherin jest zlokalizowana w połączeniach międzykomórkowych, co pokazano za pomocą mikroskopii konfokalnej. Pasek skali odpowiada 20μm.

Rycina 2. Analiza FACS hodowanych MLEC znakowanych przeciwciałami specyficznymi dla markerów śródbłonkowych: VE-kadheryny (CD144) lub VEGFR2, zgodnie z oznaczeniem, a następnie przeciwciałem wtórnym sprzężonym z fykoerytryną, potwierdza tożsamość śródbłonkową wyizolowanych MLEC. Linia czerwona oznacza kontrolę specyficzną dla izotypu, linia zielona oznacza IgG specyficzne dla anty-VE-kadheryny lub anty-VEGFR2.

Dyskusja

Komórki śródbłonka (EC) mikronaczyniowe okazały się użytecznym modelem w wielu obszarach biologii naczyniowej i uważa się, że są bardziej istotne fizjologicznie do badań (np. angiogenezy) niż szeroko badane HUVEC ³. Wcześniej zgłaszano, że EC mikronaczyniowe można uzyskać z nerek, serca, skóry, siatkówki, mózgu, glejaków, tkanki tłuszczowej, a także z płuc ^{2, 4-7, 10, 11}. Niemniej jednak wciąż istnieje potrzeba opracowania spójnej i niezawodnej metody izolacji EC mikronaczyniowych. Procedura przedstawiona w niniejszym materiale jest modyfikacją wcześniej opublikowanego protokołu ²; różni się ona od większości publikowanych procedur tym, że wykorzystuje szczenięta/myszy nowonarodzone zamiast zwierząt dorosłych. Jest to kluczowe dla sukcesu izolacji, ponieważ komórki od młodych zwierząt mają wyższy potencjał proliferacyjny, a kultury pochodzące z ich tkanek mają tendencję do uzyskiwania większej liczby komórek. Zwierzęta w wieku jednego tygodnia wydają się być optymalne, ale można również użyć młodszych myszy (4-dniowych). W razie potrzeby można również użyć większej lub mniejszej liczby młodych zwierząt, ponieważ z sukcesem izolowaliśmy MLEC z jednego osobnika. Jednak podczas skalowania procesu izolacji w górę lub w dół, gęstość wysiewu komórek musi pozostać niezmieniona, ponieważ jest to również krytyczne dla proliferacji komórek. Dwustopniowy proces oczyszczania MLEC przy użyciu kulek magnetycznych koniugowanych najpierw z przeciwciałami anty-PECAM-1, a następnie anty-ICAM-2, jest znacznie bardziej wydajny w uzyskiwaniu czystych kultur EC niż wcześniej opisane jednostopniowe procedury oczyszczania. Protokół ten eliminuje potrzebę stosowania bardzo żmudnych technik manualnych, wirowania gradientowego i mniej wydajnego sortowania FACS w celu usunięcia komórek zanieczyszczających, takich jak fibroblasty, komórki krwi i komórki mięśni gładkich. Uzyskana populacja MLEC może być wykorzystana do analiz in vitro odpowiedzi angiogennych, przepuszczalności naczyniowej i transmigracji leukocytów, gojenia ran, a także do analizy biochemicznej szlaków sygnalizacyjnych. W razie potrzeby MLEC można wysiać na różnych powierzchniach, takich jak szkiełka nakrywkowe powlekane fibronektyną lub żelatyną do immunofluorescencji, lub na macierzach elektrod do pomiarów oporu transendotelialnego (TER). Uzyskane wyniki można bezpośrednio porównać z fenotypami obserwowanymi in vivo, co jest szczególnie istotne w kontekście rosnącej liczby linii myszy z knockoutem i myszy transgenicznych. Pomyślne wdrożenie tej metody do analiz in vitro mechanizmów komórkowych leżących u podstaw defektów obserwowanych in vivo zostało już zaprezentowane ¹².

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Nożyczki chirurgiczne typu Spring	Fine Science Tools	15032-13
pinceta	Fine Science Tools	11223-20
kaniula 14G	Fisher Scientific	1482516N
strzykawka 20 ml	BD Biosciences	309661
BSA	Sigma-Aldrich	A7030-100G
anty-szczurze IgG Dynabeads	Invitrogen	110.35
Magnetyczny koncentrator cząsteczek (MPC)	Invitrogen	123-21D
przeciwciało anty-mysie PECAM-1 (CD-31)	BD Biosciences	553369
przeciwciało anty-mysie ICAM-2 (CD-102)	BD Biosciences	553326
Kollagenaza/Dyspaza (C/D)	Roche Group	11097113001	roztwór stokowy 100mg/ml można przygotować i przechowywać w temperaturze -20°C
DMEM	Cellgro	10-013-CV
Żelatyna ze skóry bydlęcej	Sigma-Aldrich	#G9391-100G
kompletny zestaw Vasculife EnGS-Mv (VL)	Lifeline Cell Technology	LL0004
0,05% Trypsyna/EDTA	Mediatech, Inc.	25-052-CI
Sito do komórek 70 μm nylon	Falcon BD	352350
flaska do hodowli tkankowej 75 cm2	Techno Plastic Products	90076