W niniejszym artykule przedstawiono procedury przygotowywania skrawków hipokampa szczurów oraz myszy transgenicznych w celu badania zmian synaptycznych związanych ze starzeniem się mózgu i neurodegeneracyjnymi chorobami starczymi, takimi jak choroba Alzheimera.
Artykuł metodologiczny
Przygotowanie ostrych skrawków hipokampa szczurów i myszy transgenicznych do badania zmian synaptycznych podczas starzenia się i patologii amyloidowej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Przygotowanie preparatu skrawka hipokampa gryzoni jest prawdopodobnie najszerzej stosowanym narzędziem do badania funkcji i plastyczności synaptycznej ssaków. Hipokamp można szybko i łatwo wyizolować z organizmów szczurów i myszy, a skrawki pozostają żywotne przez wiele godzin w natlenionym sztucznym płynie mózgowo-rdzeniowym. Ponadto podstawowe techniki elektrofizjologiczne są łatwo stosowalne w badaniach funkcji synaptycznej w skrawkach hipokampa i dostarczyły jednych z najlepszych biomarkerów upośledzenia funkcji poznawczych. Skrawki hipokampa są szczególnie popularne w badaniu mechanizmów plastyczności synaptycznej zaangażowanych w uczenie się i pamięć. Zmiany w indukcji długotrwałego wzmocnienia i osłabienia (LTP i LTD) wydajności synaptycznej w skrawkach hipokampa (lub ich brak) są często wykorzystywane do opisu fenotypu neurologicznego zwierząt z upośledzeniem poznawczym i/lub do oceny mechanizmu działania związków nootropowych. Niniejszy artykuł opisuje procedury wykorzystywane przez nas do przygotowania skrawków hipokampa szczurów oraz myszy transgenicznych w celu badania zmian synaptycznych związanych ze starzeniem się mózgu i chorobą Alzheimera (AD)1-3. Stosowanie starych szczurów i myszy będących modelami AD może stawiać przed badaczami, przyzwyczajonymi do pracy z młodszymi szczurami i/lub myszami, zestaw specyficznych wyzwań. Starsze szczury mają grubsze czaszki i twardszą tkankę łączną niż młodsze szczury i myszy, co może opóźnić ekstrakcję i/lub sekcję mózgu, a w konsekwencji zniwelować lub wyolbrzymić rzeczywiste różnice wiekowe w funkcji i plastyczności synaptycznej. Starzenie się oraz patologia amyloidowa mogą również nasilać uszkodzenia hipokampa powstałe podczas procedury sekcji, co ponownie komplikuje wnioski wyciągane z oceny fizjologicznej. W niniejszej pracy omawiamy kroki podjęte podczas procedury sekcji w celu zminimalizowania tych problemów. Przedstawiono przykłady odpowiedzi synaptycznych uzyskanych w skrawkach „zdrowych” i „chorych” szczurów oraz myszy, a także reprezentatywne eksperymenty dotyczące plastyczności synaptycznej. Omówiono również możliwy wpływ innych czynników metodologicznych na funkcję synaptyczną w tych modelach zwierzęcych (np. skład roztworu rejestracyjnego, parametry stymulacji). Choć głównym tematem artykułu jest wykorzystanie starych szczurów i myszy transgenicznych, osoby początkujące w fizjologii skrawków powinny znaleźć tutaj wystarczająco dużo szczegółów, aby rozpocząć własne badania z wykorzystaniem różnych modeli gryzoni.
Protokół
1. Przygotowanie schłodzonego do temperatury lodowej, natlenionego sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (ACSF)
- Przygotować 2 L ACSF „wolnego od Ca2+”. Do kolby Erlenmeyera o pojemności 2 L wlać około 1,5 L sterylnej lub dwukrotnie destylowanej H2O i rozpocząć intensywne mieszanie na mieszadle magnetycznym. Dodać następujące składniki ACSF (w mM): 124 NaCl, 2 KCl, 1,25 KH2PO4, 2 MgSO4, 26 NaHCO3 oraz 10 dekstrozy (patrz Tabela 1). Uzupełnić objętość do 2 L destylowaną H2O.
- Używając napowietrzacza akwariowego i rurki podłączonej do butli z mieszanką 95% O2/5% CO2, intensywnie natlenić ACSF przez około 20-30 min. Sprawdzić pH i w razie potrzeby skorygować do 7,4 za pomocą NaOH lub HCl.
- Przełożyć 750 mL natlenionego ACSF wolnego od Ca2+ do oddzielnej kolby Erlenmeyera, zakryć otwór parafilmem i przenieść do zamrażarki ultraniskotemperaturowej (-80°C) na 20-30 min. Medium to będzie wykorzystywane do sekcji mózgu i przygotowania ostrych skrawków hipokampa*. Do pozostałej objętości 1,25 L ACSF# dodać 2 mM CaCl2, dokładnie wymieszać i wznowić natlenianie mieszanką 95% O2/5% CO2. Medium to będzie wykorzystywane do przechowywania skrawków mózgu po sekcji oraz do perfuzji skrawków podczas rejestracji elektrofizjologicznych.
*Lodowate medium wolne od Ca2+ jest stosowane w celu spowolnienia metabolizmu i zminimalizowania zależnej od Ca2+ ekscytotoksyczności podczas sekcji.
# Zmiany w rozregulowaniu poziomu Ca2+ podczas starzenia i w przebiegu AD mogą mieć istotny wpływ na indukcję zależnej od Ca2+ plastyczności synaptycznej 4-9. Sprzeczne doniesienia na temat różnic wiekowych w LTD mogą wynikać częściowo ze stosowania różnych stosunków Ca2+:Mg2+ w ACSF podczas rejestracji ze skrawków (patrz 2,4,10). Znaczenie regulacji Ca2+ i poziomu Ca2+ w ACSF w badaniach nad starzeniem zostało omówione szerzej w sekcji Dyskusja. - Podczas mrożenia ACSF wolnego od Ca2+, przygotować komorę przechowawczą do utrzymania skrawków mózgu przed i w trakcie rejestracji elektrofizjologicznych*. Stosujemy niestandardową makroskomorę przechowawczą, która zawiera cztery oddzielne mikroskomory (patrz Rysunek 2). Makroskomora jest wypełniona sterylną, natlenioną H2O, a mikroskomory stanowią w zasadzie wyspy wystające ponad powierzchnię wody. Wewnątrz każdej mikroskomory skrawki spoczywają na siatkowym wkładzie w płytkiej warstwie natlenionego ACSF. Skrawki nie są całkowicie zanurzone, lecz znajdują się na granicy z nawilżonym powietrzem. Izolowany element grzejny wewnątrz makroskomory umożliwia regulację temperatury.
*Dostępnych jest również komercyjnie kilka rodzajów komór przechowawczych (np. firma Warner Instruments produkuje komorę zanurzeniową „Pre Chamber #BSC-PC), które powinny być odpowiednie do badań nad skrawkami mózgu myszy starzejących się i transgenicznych. W sytuacjach awaryjnych skrawki można przechowywać przez kilka godzin w małej szalce Petriego wypełnionej ACSF. W pokrywie szalki należy wykonać mały otwór dla rurki doprowadzającej tlen. Należy uważać, aby pęcherzyki tlenu nie wywoływały mechanicznego poruszenia skrawków. Skrawki otrzymają wystarczającą ilość tlenu, jeśli rurka doprowadzająca zostanie uniesiona tuż nad powierzchnię ACSF (dyspersja gazu powinna spowodować wgłębienie w powierzchni cieczy).
2. Usunięcie mózgu i wyizolowanie hipokampa u szczurów w starszym wieku (> 20. miesiąca życia)
- Przygotuj stanowisko do sekcji* obok dużego zlewozmywaka (patrz Rys. 1 i Tabela 2). W zlewozmywaku umieść gilotynę do małych zwierząt oraz rozłóż instrumenty chirurgiczne i materiały niezbędne do usunięcia mózgu i wypreparowania hipokampa, w tym: złożony ręcznik papierowy, ostrze skalpela nr 11, nożyczki typu beebee, kleszczyki kostne, „narzędzie do hipokampa” (specjalistyczną podwójną szpatułkę firmy Fine Surgical Tools), małe nożyczki chirurgiczne, cienką szpatułkę dwustronną, plastikową pipetę Pasteura, papier filtrujący Whatman o średnicy 110 mm, szklaną szalkę Petriego o średnicy 100 mm z pokrywką wypełnioną lodem oraz plastikową łyżeczkę. W pobliżu przygotuj również plastikowy worek do utylizacji resztek zwierzęcia.
Ekstrakcję mózgu należy przeprowadzić tak szybko, jak to możliwe, dlatego zaleca się uprzednie mentalne „przejście” przez całą procedurę oraz rozmieszczenie instrumentów w kolejności ich użycia. - Usuń Ca2+-wolny ACSF z zamrażarki. Pożywka powinna być częściowo, a nie całkowicie, zamrożona. Nalać około 50 ml ACSF do szklanego zlewki, przykryć Parafilmem i postawić obok miejsca sekcji. Pożywka ta będzie służyć do krótkotrwałego przechowywania mózgu po jego wyjęciu. Pozostały Ca2+do napełnienia zbiornika w wibratomie w celu przygotowania skrawków zostanie użyte medium wolne od białek. Medium to można ponownie natlenić lub po prostu przykryć folią Parafilm i umieścić w lodówce w temperaturze 4°C.
- Uśmierć szczura, stosując metody zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC). Zwierzęta umieszcza się w małej komorze z pleksiglasu, którą stopniowo wypełnia się 100% CO22Utrata przytomności następuje zazwyczaj w ciągu pięciu minut, co potwierdza się brakiem odruchów po uciśnięciu palca u nogi.
- Dokonaj dekapitacji szczura bezpośrednio rostralnie w stosunku do pierwszego kręgu szyjnego i umieść głowę na złożonym ręczniku papierowym. Za pomocą skalpela nr 11 wykonaj szybkie nacięcie w połowie skóry głowy, zaczynając w pobliżu kości nosowej i prowadząc je w kierunku kaudalnym aż do kości potylicznej. Należy upewnić się, że nacięcie przechodzi całkowicie przez mięśnie skórne, w pełni odsłaniając szwy na powierzchni grzbietowej czaszki.
- Przetnij płytki czaszki nożyczkami typu Beebee. U młodych szczurów i myszy czaszkę można szybko usunąć, korzystając wyłącznie z kleszczykostopów do kości. Jednakże starsze szczury mają grubszą czaszkę niż młode dorosłe szczury i myszy, co może utrudnić tę procedurę. Stwierdziliśmy, że przecięcie czaszki znacznie ułatwia usuwanie kości za pomocą kleszczykostopów, zmniejsza ryzyko uszkodzenia mózgu i oszczędza cenny czas. Przy głowie szczura mocno unieruchomionej na blacie, umieść krawędź tnącą dolnego ostrza nożyczek Beebee w górnym obszarze otworu wielkiego (foramen magnum) w tylnej części czaszki. Trzymając dolne ostrze ściśle przy wewnętrznej powierzchni czaszki (z dala od mózgu)*, przetnij płytkę potyliczną, a następnie wzdłuż szwu pośrodkowego płytek ciemieniowych. Przesuwaj się w kierunku rostralnym, aż przetniesz przednie płytki czaszki.
Kluczowe znaczenie ma skierowanie nacisku w kierunku przeciwnym do mózgu, aby zapobiec przypadkowemu uszkodzeniu tkanki. - Oddziel kości potyliczne, ciemieniowe i skroniowe od mózgu. Nadal mocno dociskaj głowę do blatu, aby zapewnić stabilność i odpowiednią dźwignię, a następnie wsuń dolną szczękę kleszczy kostnych pod lewą kość ciemieniową, utrzymując nacisk na wewnętrzną powierzchnię czaszki. Następnie zaciśnij szczęki kleszczy i wykonaj ruch nadgarstkiem do góry i w stronę siebie, aby oddzielić kości ciemieniową i potyliczną od mózgu. Powinno to odsłonić większość powierzchni grzbietowej lewej półkuli. W razie potrzeby użyj kleszczy kostnych, aby usunąć również lewą kość czołową. Powtórz ten proces dla drugiej półkuli. Po usunięciu kości szybko sprawdź, czy do kości skroniowych nie przylega opona twarda, która mogłaby być rozciągnięta na powierzchni mózgu. Ostrożnie odsuń ją kleszczami kostnymi lub odetnij nożyczkami*. Teraz wsuń górną szczękę kleszczy kostnych między mózg a prawą kość skroniową, ponownie kierując nacisk w stronę czaszki, a nie mózgu. Zaciśnij kleszcze i odkręć kość skroniową od mózgu. Podczas tej czynności powinieneś usłyszeć lub poczuć charakterystyczne chrupnięcie. Powtórz czynność po lewej stronie.
Oponę twardą może być trudno dostrzec, zwłaszcza jeśli zwierzę zostało poddane perfuzji transkardialnej za pomocą ACSF. Jeśli jednak opony twarde nie zostaną usunięte, podczas usuwania płytek skroniowych przetną one mózg (a najprawdopodobniej hipokamp) niczym brzytwa. Odcięcie opony twardej w pobliżu płytek skroniowych zminimalizuje ryzyko uszkodzenia mózgu. - Wyjąć mózg*. Szybko usunąć parafilm z Ca2+-free ACSF „papkę”. Następnie wsuń szeroką końcówkę szpatułki narzędzia do hipokampa między powierzchnię brzuszną mózgu a dolne płytki czaszki, aż znajdzie się ona całkowicie pod mózgiem. Poruszaj szpatułką bocznie z jednej strony na drugą, a następnie kilka razy do przodu i do tyłu, aby przeciąć nienaruszone nerwy czaszkowe. Teraz wyjmij mózg za pomocą narzędzia do hipokampa i zanurz w Ca2+-roztworze ACSF i przykryć parafilmem. Pozostawić mózg do schłodzenia przez około jedną minutę. Jest to odpowiedni moment na oczyszczenie gilotyny, usunięcie tułowia zwierzęcia i uporządkowanie miejsca sekcji.
*W krokach 2.3–2.7 kluczowe jest tempo pracy. Staramy się przeprowadzić tę procedurę (od dekapitacji do zanurzenia mózgu w ACSF) w ciągu 30–35 s. Z naszego doświadczenia wynika, że ekstrakcje trwające powyżej minuty wydają się negatywnie wpływać na kondycję skrawków hipokampa, szczególnie w przypadku starszych szczurów. Stosując opisane procedury, nie zaobserwowaliśmy w naszych badaniach różnic w czasie ekstrakcji między szczurami starszymi a młodymi. - Wyizoluj hipokampy. Połóż papier filtracyjny Whatman na pokrywie schłodzonej do temperatury lodowej szalki Petriego i zwilż papier roztworem ACSF za pomocą plastikowej pipety transferowej. Wyjmij mózg z ACSF za pomocą łyżeczki i umieść go na zwilżonym papierze Whatman. Za pomocą ostrza skalpela usuń móżdżek oraz około jednej czwartej rostralnych części płatów czołowych. Przesuń ostrze skalpela wzdłuż szczeliny wewnątrzhemisferycznej, aby całkowicie oddzielić obie półkule. Jedną półkulę umieść z powrotem w mazi z ACSF, a drugą „postaw” na stole sekcyjnym tak, aby płaszczyzna wieńcowa płata czołowego była skierowana w dół. Powinieneś wyraźnie odróżnić pień mózgu i śródmózowie (które są białe) od leżącej nad nimi kory (która jest różowo-szara). Zlokalizuj wzgórka górny i dolny w śródmózgowiu; będą one wyglądać jak dwa białe „guzki” i w tej orientacji będą znajdować się na „górze” mózgu. Używając nożyczek chirurgicznych, delikatnie utrzymaj śródmózowie w miejscu i wsuń szpatułkę wagową w szczelinę między wzgórkami a neocortex. Bardzo ostrożnie przesuwaj szpatułkę w dół i odsuwaj pień mózgu/śródmózowie/wzgórze, odsłaniając wnętrze komory bocznej i powierzchnię przyśrodkową hipokampa. Za pomocą ostrej krawędzi szpatułki gładko przetnij forging (komisurę podwojową) – biały pęczek włókien znajdujący się w przednio-grzbietowej części hipokampa. Używając nożyczek, delikatnie kontynuuj odsuwanie pnia mózgu/śródmózowia/wzgórza, nie oddzielając go całkowicie od reszty mózgu. Kora wraz z hipokampem powinna teraz swobodnie odchylić się od pnia mózgu*. Następnie obróć stół sekcyjny tak, aby patrzeć na przyśrodkową część hipokampa i nadkładającą ją korę, jak w przekroju strzałkowym (bez wzgórza). Powinieneś teraz widzieć białe włókna prążka (fimbria), które w tej płaszczyźnie tworzą płytką hiperbolę u podstawy hipokampa. Za pomocą plastikowej pipety transferowej delikatnie wtryśnij nieco ACSF w szczelinę pod prążkiem, aby ułatwić oddzielenie hipokampa od kory. Delikatnie wsuń szpatułkę w tę szczelinę tak, aby długa strona szpatułki biegła równolegle do długiej osi hipokampa. Gdy szpatułka znajdzie się całkowicie pod hipokampem, mocno przytrzymaj pień mózgu/śródmózowie/wzgórze nożyczkami i przetocz szpatułkę od siebie, aby fizycznie oddzielić hipokamp od reszty mózgu. Po uwolnieniu hipokampa delikatnie odetnij pozostałości kory, naczyń krwionośnych i białej substancji. Na odległym końcu stołu sekcyjnego umieść niewielką ilość mazi z ACSF. Delikatnie ułóż hipokamp obok mazi i oblej go kilkoma mililitrami ACSF za pomocą plastikowej pipety transferowej. Następnie wyjmij drugą półkulę i powtórz procedurę sekcji.
Może być konieczne użycie nożyczek do odcięcia nadmiaru tkanki łącznej, istoty białej lub naczyń krwionośnych, które uniemożliwiają oddzielenie kory od pnia mózgu. Końcówki nożyczek będą znajdować się bardzo blisko hipokampa, dlatego należy wykonywać cięcia z dużą precyzją (użycie ostrych nożyczek jest niezbędne).
3. Usuwanie mózgu i wyizolowanie hipokampa u starszych myszy transgenicznych
- Uśmierć i zdekapituj mysz, a następnie wykonaj nacięcie wzdłuż linii środkowej skóry głowy, zgodnie z opisem w sekcji 2.3. Myszy mają znacznie cieńsze czaszki niż szczury, co znacznie ułatwia wyjęcie mózgu. Przecinanie czaszki nożyczkami jest zatem zbędne. Użyj kleszczy kostnych z mniejszymi szczękami (Tabela 2), aby usunąć kostne płytki potyliczne, ciemieniowe i skroniowe. Podobnie jak w przypadku szczura, pamiętaj o wykonywaniu kontrolowanych ruchów i mocnym dociskaniu dolnej szczęki kleszczy do wewnętrznej powierzchni czaszki, prowadząc je w kierunku oddalenia od mózgu podczas usuwania płytek. Po usunięciu płytek użyj wąskiego końca narzędzia do hipokampa, aby przeciąć pozostałe nerwy czaszkowe i przenieść mózg do lodowatego ACSF pozbawionego Ca2+.
- Przygotuj skrawki mózgu. Ze względu na mniejszy rozmiar mózgu myszy, wypreparowanie hipokampów może być nieco trudniejsze (choć oczywiście wykonalne) niż w przypadku szczurów. Aby zatem ułatwić proces, usuwamy móżdżek i przednie części płatów czołowych, ale nie wycinamy samych hipokampów. Zamiast tego półkule mózgu są fizycznie rozdzielane ostrzem skalpela i pozostawiane w całości do cięcia w wibrotomie (patrz sekcja 4 poniżej).
4. Krojenie tkanki mózgu na plastry za pomocą mikrotomu wibracyjnego (wibratomu) i przeniesienie ich do komory przechowawczej*
- Napełnić zbiornik mikrotomu wibracyjnego lodowatym roztworem Ca2+-wolnym ACSF, tak aby platforma tnąca i ostrze były całkowicie zanurzone. W przypadku przygotowywania skrawków szczurzych, odetnij skalpelem przeciwległe końce (rostralny i kaudalny) każdego hipokampa. Cięcia te pozwolą na pionowe ułożenie hipokampów blisko siebie, w formie dwóch kolumn. Najlepszy efekt uzyskuje się, gdy zakręty zębate obu hipokampów są skierowane ku sobie, a obszary CA3 są zorientowane w tym samym kierunku. W przypadku przygotowywania skrawków mysich, ułóż obie półkule pionowo i blisko siebie, z płatami czołowymi skierowanymi w dół. Przyklej tkankę mózgową do bloku montażowego i przenieś ją na platformę sekcyjną wibrotomu. Do eksperymentów z zakresu fizjologii synaptycznej zazwyczaj przygotowujemy skrawki o grubości ~400 µm. W przypadku planowania obrazowania fluorescencyjnego (np. badań nad Ca) należy przygotować cieńsze skrawki.2+ poziomy i stany przejściowe). Przenieść skrawki za pomocą pipety o szerokim wylocie lub pędzla do małej szalki Petriego zawierającej lodowaty roztwór Ca2+bezpłuczny ACSF.
Użycie wibratomu minimalizuje uszkodzenia górnej i dolnej powierzchni skrawka i jest zdecydowanie zalecane w badaniach wymagających analizy komórek znajdujących się blisko powierzchni skrawka (np. metoda voltage clamp i Ca2+ badania obrazowe). Dostępne są jednak tańsze alternatywy, które nadają się do przygotowywania skrawków do eksperymentów z fizjologii zewnątrzkomórkowej. Wykorzystaliśmy niewielki grawitacyjny mikrotom (chopper)2,11 or siekacz do tkanek McIlwain12 z sukcesem. W tej procedurze hipokampy są umieszczane na platformie i sekcjonowane za pomocą pionowej siekarki (vertical chopper). Do przenoszenia skrawków (po jednym) do małego naczynia zbiorczego wypełnionego lodowatym roztworem Ca2+bezzmiennym ACSF. Jednym z problemów związanym z tym podejściem jest możliwość przesuwania się hipokampów pomiędzy cięciami, co prowadzi do powstania nierównych przekrojów. Należy również pamiętać o usunięciu jak największej ilości istoty białej, a w szczególności naczyń krwionośnych, przed przystąpieniem do cięcia. Materiał ten może przyklejać się do pędzelka, ostrza brzytwy lub obu tych elementów jednocześnie, co znacznie utrudnia przenoszenie plastrów i zwiększa prawdopodobieństwo rozciągnięcia lub uszkodzenia tkanki.
Podczas używania pędzla należy starać się układać skibę wzdłuż jego włosia. Owinięcie skiby wokół końcówki pędzla może spowodować niepotrzebne rozciągnięcie tkanki. - Przenieś skrawki mózgu do komory holdingowej, w której są one kąpane w natlenionym roztworze Ca2+zawierającego ACSF. Stopniowo zwiększaj temperaturę komory z 27° Proszę o przesłanie tekstu źródłowego do tłumaczenia. 32°C (+1° co pięć minut). Inkubować skrawki przez 1–1,5 h przed rozpoczęciem eksperymentów elektrofizjologicznych.
5. Wywoływanie i rejestrowanie odpowiedzi synaptycznych CA3-CA1
- Do podstawowych rejestracji zewnątrzkomórkowych w świeżych skrawkach, stanowisko elektrofizjologiczne powinno obejmować*: komorę rejestracyjną; system perfuzji; mikroskop z możliwością powiększenia > 4X; elektrody rejestrujące, stymulujące i uziemiające; makro- i mikromanipulatory; sztywny, odporny na wibracje blat stołu i klatkę Faradaya; stymulator; wzmacniacz oraz przetwornik analogowo-cyfrowy (A/D); oscyloskop (preferowany) oraz komputer PC z odpowiednim oprogramowaniem akwizycyjnym.
*Kerr Scientific Instruments oferuje znakomity i niedrogi system elektrofizjologiczny (tj. Kerr Tissue Recording System) do przeprowadzania różnych podstawowych eksperymentów elektrofizjologicznych na skrawkach. System ten zajmuje mało miejsca, posiada przenośne stymulatory i wzmacniacze oraz może być używany na standardowym stole laboratoryjnym bez konieczności stosowania masywnej klatki Faradaya.
Oczywiście skrawki mózgu mogą być również wykorzystywane do przeprowadzania licznych, złożonych technik elektrofizjologicznych i obrazowych, co wymaga dodatkowego sprzętu i materiałów. Na przykład nasze główne stanowisko elektrofizjologiczne zawiera wzmacniacz z funkcjami szybkiego clampowania napięcia i prądu, system oświetlenia fluorescencyjnego oraz kamerę cyfrową. Stanowisko to jest wykorzystywane do zewnątrzkomórkowych rejestracji potencjałów polowych w skrawkach mózgu, a także do rejestracji metodą patch-clamp oraz obrazowania fluorescencyjnego w skrawkach i kulturach komórkowych 3,12,13. Pełną listę sprzętu i komponentów przedstawiono w Tabeli 3. - Używając pipety o szerokim wylocie lub małego pędzla, przenieś jeden lub więcej skrawków do komory rejestracyjnej*, pozwalając im na aklimatyzację przez 10-15 min przed rozpoczęciem stymulacji/rejestracji. W naszych badaniach skrawki są zanurzone w ACSF i spoczywają na siatce umieszczonej w komorze RC-22 firmy Warner Instruments (patrz Rysunek 3). ACSF jest dostarczany grawitacyjnie przez regulator w celu dostosowania szybkości przepływu i jest wstępnie podgrzewany do 32°C za pomocą wbudowanego mikrogrzejnika przed dotarciem do komory rejestracyjnej. Do usuwania ACSF używana jest centralna linia próżniowa.
*W sprzedaży dostępnych jest wiele różnych rodzajów komór rejestracyjnych typu zanurzeniowego oraz interfejsowego. Zaobserwowaliśmy, że skrawki wykazują silniejsze odpowiedzi synaptyczne w komorze interfejsowej (tj. skrawka znajduje się na styku nawilżonego powietrza i ACSF)2,11. Jednak reaktywność jest zazwyczaj bardziej stabilna, gdy skrawki są zanurzone w ACSF. Perfuzja leków jest również bardziej wydajna w komorach zanurzeniowych. - Ustaw elektrody stymulujące i rejestrujące. Przy włączonym stymulatorze lub izolatorze bodźców, ale z wyjściem ustawionym na 0, umieść elektrodę stymulującą nad skrawkiem w obszarze stratum radiatum CA2 w pobliżu granicy z CA3 (patrz Rysunek 4). Używamy skręconego drutu platynowo-irydowego do podawania dwufazowych impulsów o szerokości 50-100 uS do włókien kolaterali Schaffera (SC) w CA3. Zastosowanie drutu platynowo-irydowego i impulsów dwufazowych może pomóc zminimalizować polaryzację elektrody. Opuść elektrodę rejestrującą do stratum radiatum CA1, tak aby ledwo przebiła powierzchnię skrawka. Nasza elektroda rejestrująca to drut Ag/AgCl w szklanej mikropipie wypełnionej ACSF (oporność końcówki ok. 7 MΩ). Zwiększ wyjście stymulatora do umiarkowanego poziomu (nasz izolator bodźców ustawiamy na ~150 μA) i zacznij podawać impulsy stymulujące oraz rejestrować aktywność za pomocą oprogramowania akwizycyjnego, takiego jak Clampex firmy Axon Instruments, Inc. Powoli opuszczaj elektrodę stymulującą w niewielkich odstępach, aż w CA1 zostanie zarejestrowany artefakt stymulacji. Następnie kontynuuj powolne opuszczanie obu elektrod (stymulującej i rejestrującej) w odstępach, rejestrując odpowiedzi CA1, aż amplitudy salwy włókien (FV) oraz potencjału postsynaptycznego pobudzającego (EPSP) osiągną poziomy maksymalne (patrz Rysunek 4B).
- Ustal krzywą siły synaptycznej i zbadaj plastyczność synaptyczną. Aby wygenerować krzywą siły synaptycznej, podawaj impulsy stymulujące do SC z coraz większą intensywnością i rejestruj odpowiadającą im aktywność w CA1. Zakres i liczba użytych poziomów intensywności bodźca mogą się różnić, ale powinny być wystarczające do uzyskania krzywej sigmoidalnej po naniesieniu na wykres wartości FV lub EPSP (Rysunek 5). Amplituda FV dostarcza wiarygodnej oceny proporcji aktywowanych włókien presynaptycznych, podczas gdy nachylenie EPSP stanowi niezakłóconą miarę prądów monosynaptycznych CA3-CA1. Zatem wykreślenie nachylenia EPSP w funkcji FV dla różnych poziomów intensywności bodźca odzwierciedla wielkość EPSP na liczbę aktywowanych aferentów i stanowi doskonałą ocenę siły synaptycznej CA3-CA1. Typowo poziomy siły synaptycznej są znacznie obniżone w obszarze CA1 u starych szczurów i myszy APP/PS1 w porównaniu do młodych szczurów i myszy typu dzikiego w tym samym wieku, np. patrz 4,14.
- Skrawki, które podczas wyznaczania krzywej siły synaptycznej wykazują oznaki złego stanu (tj. maksymalna amplituda EPSP < 1 mV) lub nadpobudliwości (tj. pojawienie się 2 lub więcej skoków populacyjnych), są wykluczane z analizy statystycznej (patrz Rysunek 4C). Stwierdziliśmy, że takie skrawki rzadko wykazują stabilne odpowiedzi w okresie 60 min i/lub wykazują bardzo zmienne odpowiedzi po indukcji plastyczności synaptycznej. Warto zauważyć, że „niezdrowe skrawki” stanowią jedynie około 10-20% wszystkich skrawków przeniesionych do komory rejestracyjnej. Co więcej, w naszym doświadczeniu częstotliwość identyfikacji niezdrowego skrawka jest bardzo podobna niezależnie od wieku, gatunku i genotypu.
- Indukuj długotrwałe wzmocnienie synaptyczne (LTP) lub długotrwałe osłabienie synaptyczne (LTD) w skrawkach. LTP i LTD to trwałe zwiększenia (LTP) i zmniejszenia (LTD) funkcji synaptycznej w odpowiedzi na różne wzorce aktywacji synaptycznej. Powszechnie uważa się, że oba procesy odzwierciedlają krytyczne mechanizmy uczenia się i pamięci15 oraz stanowią przydatne miary wynikowe do badania komórkowych mechanizmów dysfunkcji neuronów i/lub oceny strategii farmakologicznych mających na celu łagodzenie deficytów pamięci i neurodegeneracji16.
W eksperymentach nad plastycznością synaptyczną zresetuj intensywność bodźca dla wszystkich skrawków do 1 mV* i rozpocznij stymulację bazową z częstotliwością 0,033 Hz. Wartości nachylenia EPSP powinny być stabilne przez co najmniej 20 min przed indukcją LTP lub LTD. Przez ten czas uważnie monitoruj EPSP i zresetuj intensywność bodźca, jeśli nachylenie waha się o więcej niż 10%, a następnie rozpocznij nową linię bazową. Indukuj LTP, stosując jednosekundową serię stymulacji 100 Hz lub wiele krótkich serii (~10 impulsów) stymulacji 100 Hz podawanych co 200 ms. W celu indukcji LTD podaj 900 impulsów stymulujących z częstotliwością 1 Hz. Po indukcji LTP lub LTD zbieraj odpowiedzi synaptyczne przez kolejne 60 min lub dłużej. Wartości nachylenia EPSP uzyskane przed i 60 min po stymulacji wysoką/niską częstotliwością są porównywane w celu ustalenia obecności LTP lub LTD.
Stare szczury i myszy APP/PS1 mają tendencję do wykazania upośledzonego LTP i zwiększonego LTD (patrz Rysunek 5), a sugeruje się, że zmiany te przyczyniają się do upośledzenia poznawczego w tych modelach zwierzęcych6,16. Jednak w przeciwieństwie do myszy APP/PS1, zmiany LTP/LTD u starych szczurów są zmienne w zależności od laboratorium. Stare szczury zazwyczaj wykazują podobne poziomy LTP w porównaniu do osobników dorosłych w odpowiedzi na stymulację „intensywną” (tj. 100 Hz), ale wykazują deficyty przy zastosowaniu łagodniejszych parametrów stymulacji (tj. niższych częstotliwości bodźców lub mniejszej liczby impulsów) (przegląd w4,6,16). Ponadto niektóre laboratoria, w tym nasze, zaobserwowały zwiększoną podatność na indukcję LTD u starych szczurów2,17-19, podczas gdy inne grupy nie stwierdziły różnic lub odnotowały zmniejszoną podatność u swoich starych zwierząt. Jak omówiono krótko poniżej (patrz Dyskusja), subtelne, ale krytyczne różnice w protokole eksperymentalnym mogą wyjaśniać te rozbieżności.
*Intensywność stymulacji i amplituda EPSP mogą wpływać na indukcję LTP i mogą być istotną przyczyną rozbieżnych wyników w literaturze. Zostanie to omówione szerzej w sekcji Dyskusja.
6. Reprezentatywne wyniki
Nasze badania, a także prace innych grup, sugerują, że zmiany w astrocytarnym sygnalizowaniu zapalnym mogą wywoływać i/lub przyspieszać dysfunkcję neurologiczną podczas starzenia się oraz w przebiegu choroby Alzheimera (AD) 13,20,21. Niedawno wykorzystaliśmy siłę synaptyczną, LTP oraz LTD jako miary końcowe do zbadania skuteczności i mechanizmów działania kilku nowych odczynników przeciwzapalnych u myszy APP/PS1 w średnim wieku (opis tego modelu znajduje się w 22) oraz u starych szczurów linii Fischer 344. Poniższe wyniki uzyskano przy użyciu protokołów opisanych w niniejszym artykule.
W badaniach pilotażowych wykazano, że jeden z nowatorskich przeciwzapalnych odczynników opartych na wirusach towarzyszących adeno (AAV), opracowanych w naszym laboratorium, znacząco zwiększa siłę synaptyczną (p < 0.05) i zapobiega deficytom LTP (p < 0.05) u myszy APP/PS1 w średnim wieku (16 miesięcy) (n = 4-6 skrawków na warunek traktowania). Reprezentatywne krzywe siły synaptycznej oraz eksperymenty LTP z dwóch różnych skrawków, pobranych od tej samej 16-miesięcznej myszy APP/PS1, przedstawiono na rysunku 5A-C. Jeden skrawek pobrano z półkuli traktowanej naszym nowym AAV (Reagent A), natomiast drugi traktowano kontrolnym odczynnikiem AAV (Control). LTP indukowano w obu skrawkach za pomocą dwóch 1 s serii stymulacji o częstotliwości 100 Hz (10 s odstępu między seriami). Należy zauważyć, że krzywa siły synaptycznej dla skrawka traktowanego Reagent A jest przesunięta w lewo w stosunku do skrawka kontrolnego, co wskazuje na większą siłę synaptyczną. Zauważalny jest również fakt, że typowo dla myszy APP/PS1 w średnim wieku, LTP w skrawku kontrolnym szybko powrócił do poziomu bazowego (np.23). Przeciwnie, w skrawku traktowanym naszym nowym odczynnikiem zanik LTP był niewielki.
W drugim niedawnym badaniu zaobserwowaliśmy znaczną LTD u starych szczurów traktowanych nośnikiem (85 % linii bazowej przed LTD, p < 0.05). W przeciwieństwie do tego, nie zaobserwowano LTD u starych szczurów traktowanych nowym lekiem przeciwzapalnym „Drug A” (97 % linii bazowej przed LTD, brak istotności). Nie zaobserwowano wpływu leku na siłę synaptyczną. Reprezentatywne eksperymenty LTD z tego zestawu danych (n = 8-10 szczurów na grupę) przedstawiono na rysunku 5D-F.
Rycina 1. Narzędzia i materiały używane do sekcji mózgu. A, ręcznik papierowy. B, ostrze skalpela. C, nożyczki Beebee. D, kleszczyki kostne (do szczurów). E, kleszczyki kostne (do myszy/szczurów). F, plastikowa łyżeczka. G, plastikowa pipeta transferowa. H, narzędzie do izolacji hipokampa. I, szpatułka. J, nożyczki chirurgiczne. K, szklana szalka Petriego.
Rysunek 2. Dedykowana komora do utrzymywania skrawków mózgu. A, makrokomora. B, pokrywa. C, zbiornik H2O z perforowaną rurką silikonową. D, mikrokomora. E, rurka do podawania ACSF (polietylenowa). F, rurka do podawania O2. G, port do kontroli temperatury. H, siatkowy wkład mikrokomory.
Rysunek 3. Komora zanurzeniowa RC22. A, Komora rejestracyjna. B, Elektroda uziemiająca. C, Igła aspiracyjna.
Rysunek 4. Ilustracja skrawka hipokampa i przebiegi fal zewnątrzkomórkowych. A, Schemat poprzecznego przekroju hipokampa wykorzystywanego w eksperymentach elektrofizjologicznych. CA = cornu Ammonis. DG = zakręt zębaty. SC = kolaterale Schaffera. S radiatum = stratum radiatum. B, Stymulacja elektryczna SC (ciągu aksonów CA3) wywołuje artefakt stymulacji, po którym następuje niemal natychmiastowy presynaptyczny potencjał populacyjny, czyli wolta włókien (FV). Amplituda FV jest wprost proporcjonalna do liczby aktywowanych włókien SC. Nachylenie fazy ujemnej polowego pobudzającego potencjału postsynaptycznego (EPSP) odpowiada bezpośrednio aktywacji depolaryzujących prądów synaptycznych w neuronach piramidowych CA1 w odpowiedzi na uwalnianie glutaminianu z zakończeń SC. C, Nakładające się reprezentatywne przebiegi fal zewnątrzkomórkowych zarejestrowane w stratum radiatum CA1 w odpowiedzi na dziewięć różnych poziomów natężenia bodźca (30-500 μA) w skrawku „zdrowym” (lewy panel), „niezdrowym” oraz „nadpobudliwym”. Dla każdego poziomu uśredniono pięć przebiegów fal. Zdrowe skrawki reagują dynamicznie w tym zakresie stymulacji i wykazują pojedynczy dodatni potencjał populacyjny (odzwierciedlający wyładowanie neuronalne CA1) przy wyższych poziomach bodźca. W komorze zanurzeniowej RC22 maksymalne EPSP mają zazwyczaj amplitudę od 1,5 do 3 mV. Skrawki niezdrowe (środkowy panel) często wykazują duży FV, ale małe maksymalne EPSP (< 1 mV) i zazwyczaj charakteryzują się słabą plastycznością. Skrawki nadpobudliwe (prawy panel) wykazują dwa lub więcej regeneracyjnych potencjałów populacyjnych w ramieniu wznoszącym EPSP. Odpowiedzi w skrawkach nadpobudliwych są często labilne i w różnym stopniu ulegają wpływowi stymulacji LTD/LTP.
Rysunek 5. Reprezentatywne eksperymenty elektrofizjologiczne przeprowadzone na ostrych skrawkach tkanek od myszy APP/PS1 w średnim wieku (16 mies.) oraz szczurów Fisher 344 w wieku podeszłym (22 mies.). Panele A-B przedstawiają dane zebrane od myszy APP/PS1 traktowanych kontrolną konstrukcją wirusową adeno-zależną (AAV) (Control) lub nowym odczynnikiem AAV (Reagent A), opracowanym przez naszą grupę badawczą. W porównaniu ze skrawkiem kontrolnym, skrawkek traktowany Reagent A wykazuje wyraźne przesunięcie krzywej EPSP:FV w lewo (A), co wskazuje na większą siłę synaptyczną. Skrawkek traktowany Reagent A wykazuje również silne i stabilne LTP (B) po podaniu dwóch serii stymulacji o częstotliwości 100 Hz trwających 1 s, podczas gdy skrawkek kontrolny wykazuje upośledzone LTP, typowe dla tego modelu zwierzęcego. Panele D-F przedstawiają dane zebrane od dwóch poszczególnych szczurów w wieku podeszłym, które otrzymały przewlekłe (4-tygodniowe) perfuzje wewnątrzhipokampalne wehikułu lub nowego leku przeciwzapalnego (Drug A). Podstawowa siła synaptyczna była stosunkowo niewpływana przez leczenie lekiem (D). Jednakże Drug A był bardzo skuteczny w zapobieganiu indukcji LTD (E). Panele C i F pokazują reprezentatywne przebiegi falowe EPSP zarejestrowane z poszczególnych skrawków przed (pre) i 60 min po (post) podaniu stymulacji LTP/LTD. Należy zauważyć, że artefakty stymulacji nie zostały pokazane.
Dyskusja
Kroki opisane w niniejszym protokole pomogą zapewnić, że sekcje mózgu będą przeprowadzane co najmniej tak szybko i efektywnie u szczurów starych, jak i u młodych osobników dorosłych. Przedstawiamy również wystarczającą liczbę szczegółów, aby początkujący badacz mógł samodzielnie przygotować badania skrawków w zakresie LTP i LTD. Jeśli jednym z Państwa celów jest dalsze badanie procesów starzenia oraz zmian w chorobie Alzheimera (AD) w zakresie funkcji i plastyczności synaptycznej, istnieją co najmniej dwa inne problemy metodologiczne, wspomniane powyżej, które zasługują na dalsze rozważenie. Po pierwsze, kilka laboratoriów wykazało, że stosunek Ca2+:Mg2+ w stosowanym podczas rejestracji ACSF może mieć wyraźny wpływ na indukcję plastyczności synaptycznej w skrawkach hipokampa2,10,24,25. W płynie mózgowo-rdzeniowym ssaków stosunek Ca2+:Mg2+ wynosi w przybliżeniu jeden (np. patrz 26). Jednak w badaniach funkcji i plastyczności synaptycznej na skrawkach powszechnie stosuje się stosunki Ca2+:Mg2+ w ACSF bliższe wartości 2. W wczesnych badaniach praktyka ta została prawdopodobnie wprowadzona w celu optymalizacji indukcji LTP, a następnie stała się rutynowa dla wszystkich badań plastyczności. Może to być jednak problematyczne w badaniach nad starzeniem i AD ze względu na dobrze opisane różnice w neuronalnej regulacji Ca2+. W szczególności, napływ Ca2+ i/lub indukowane przez Ca2+ uwalnianie Ca2+ jest zwiększone u starych szczurów i/lub myszy w modelach AD podczas aktywacji neuronalnej3,27-31. Indukcja LTD jest szczególnie wrażliwa na subtelne zmiany poziomu Ca2+ w ACSF. Nasz protokół, w którym zastosowano 2mM Ca2+ i 2mM Mg2+, zazwyczaj prowadzi do wystąpienia LTD u zwierząt starych, ale nie u młodych osobników dorosłych2, podczas gdy w badaniach przy stosunku Ca2+:Mg2+ bliższym dwóm obserwowano silne LTD u osobników dorosłych bez różnic związanych z wiekiem2,10 lub przy jednoczesnym zmniejszeniu LTD u starych szczurów32. Obserwacje te podkreślają konieczność uważnego rozważenia poziomów Ca2+ i Mg2+ w ACSF podczas porównywania plastyczności zależnej od Ca2+ u zwierząt starych i młodych osobników dorosłych.
Drugi problem metodologiczny dotyczy silnej zależności LTP od depolaryzacji postsynaptycznej33 oraz możliwych różnic w sile synaptycznej wynikających z wieku lub genotypu. W typowym eksperymencie LTP intensywność stymulacji bazowej oraz stymulacji LTP jest zazwyczaj dostosowywana tak, aby uzyskać połowiczną (lub trzyczwartową) maksymalną amplitudę EPSP. Potencjalnym problemem jest to, że stare szczury oraz myszy APP/PS1 zazwyczaj wykazują zmniejszoną siłę synaptyczną w porównaniu z młodszymi i/lub dzikimi odpowiednikami, co oznacza, że wartości bazowe EPSP będą również niższe u starych szczurów i myszy APP/PS1. Mniejsze EPSP mogą przekładać się na słabszą depolaryzację podczas stymulacji LTP, co skutkuje zmniejszoną prawdopodobieństwem wywołania LTP33. Ze względu na ten potencjalny czynnik zakłócający trudno jest ustalić, czy zwierzęta te wykazują deficyt przepustowości, deficyt plastyczności, czy obie te cechy. Oznacza to, że mechanizmy indukcji LTP u starych i/lub myszy APP/PS1 mogą być funkcjonalnie sprawne (brak deficytu plastyczności), ale niewystarczająco stymulowane (deficyt przepustowości) w tych warunkach. Rozróżnienie to jest krytyczne, ponieważ mechanizmy przepustowości i mechanizmy plastyczności mogą reagować w bardzo różny sposób na konkretne leczenie farmakologiczne. Staramy się zminimalizować wpływ zmniejszonej przepustowości na indukcję LTP poprzez normalizację amplitudy EPSP do tego samego poziomu (np. 1 mV) we wszystkich skrawkach przed stymulacją LTP. Skuteczne mogą być również inne strategie (np. zastosowanie zacisku napięcia lub prądu w celu wyrównania potencjału błonowego między grupami podczas stymulacji LTP), które należy rozważyć podczas badania LTP w tych modelach zwierzęcych.
Oświadczenia
Produkcja tego artykułu wideo została sponsorowana przez Leica Microsystems.
Podziękowania
Prace wspierane przez grant NIH AG027297, nagrodę z Kentucky Spinal Cord and Head Injury Research Trust oraz darowiznę z Kleberg Foundation.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| KH2PO4 (jednodstawkowy) | Sigma-Aldrich | P5379-100G | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M2643-500G | |
| CaCl2 (dwuwodzian) | Sigma-Aldrich | C3306-250G | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | S233-500 | |
| C6H12O6 (dekstroza) | Fisher Scientific | BP350-1 | |
| Tabela 1. Wymagane odczynniki | |||
| Kolby Erlenmeyera | Fisher Scientific | FB-500-2000 FB-500-1000 | |
| Napowietrzacz akwariowy | Służy do napowietrzania pożywek. Dostępny w większości sklepów zoologicznych | ||
| Szklany zlewka 50 mL | Fisher Scientific | 02-540G | Do przechowywania mózgu w ACSF |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-10 | |
| Gilotyna do małych zwierząt | World Precision Instruments, Inc. | DCAP-M | |
| Ręcznik papierowy | |||
| Skalpel chirurgiczny Feather #11 | Fisher Scientific | 08-916-5B | |
| Nożyce kostne Beebee | Fine Science Tools | 16044-10 | |
| Kleszczyki Lempert Rongeurs | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-8321 | Stosować dla szczurów |
| Kleszczyki Friedman-Pearson Rongeurs | Fine Science Tools | 16020-14 | Stosować dla myszy lub szczurów |
| Narzędzie do hipokampa | Fine Science Tools | 10099-15 | |
| Łyżka | Wystarczy plastikowa łyżeczka | ||
| Szpatułka | Fisher Scientific | 21-401-25A | Szpatułka |
| Chirurgiczne nożyczki irydowe | Fine Science Tools | 14058-09 | |
| plastikowe pipety transferowe | Fisher Scientific | 13-711-43 | |
| papier filtracyjny Whatman 110 mm | Fisher Scientific | 09-805E | Whatman kat. 1001-110 |
| Szklana szalka Petriego | Fisher Scientific | ||
| Manualny mikrotom wibrotom Leica VT1000P | Wibrotom | VT1000P | |
| Ostrze Feather S FA-10 0,1 mm | Ted Pella, Inc. | 121-9 | Ostrze Feather S FA-10 0,1 mm |
| Szklana pipeta Pasteura z borokrzemianu (z gumową gruszką) | Fisher Scientific | 13-678-20A | Do przenoszenia skrawków: końcówka jest odłamywana i wypalana w celu powiększenia otworu |
| Polistyrenowa szalka hodowlana 35 mm | Corning | 430588 | Używana do zbierania skrawków po sekcji |
| Tabela 2. Narzędzia i materiały do sekcji | |||
| Komora utrzymująca | Wykonana na zamówienie | ||
| Horyzontalny wyciągacz pipet P-97 | Sutter Instrument Co. | ||
| Stół wibroizolacyjny | Technical Manufacturing Corp. | ||
| Klatka Faradaya | Wykonana na zamówienie | ||
| Butelka aspiracyjna Pyrex z bocznym wylotem na dole | Corning | 1220-1L | |
| Grawitacyjny zestaw do infuzji IV z regulatorem | Baxter Internationl Inc. | 2C8891 | |
| Centralna linia próżniowa | Dostępna w większości nowoczesnych laboratoriów | ||
| Mieszanina gazowa 95% O2 / 5% CO2 | Scott-Gross Co. | ||
| Przewody laboratoryjne TygonTM do podawania O2/CO2 | Fisher Scientific | Nietoksyczne, nieutleniające, dostępne w różnych rozmiarach. | |
| Mikroskop Eclipse E600FN | Nikon Instruments | z obiektywami 10x i 40x, filtrem bliskiej podczerwieni oraz filtrami GFP i DS-Red2 | |
| Cyfrowa kamera Cool Snap ES | Photometrics | Cyfrowa kamera Cool Snap ES | |
| Fluorescencyjny iluminator X-Cite | EXFO | Fluorescencyjny iluminator X-Cite | |
| Platforma mikroskopowa | Siskiyou, Inc. | Złożona na zamówienie | |
| Zanurzalna komora rejestracyjna RC-22 | Warner Instruments | 64-0228 | Wymaga platformy P-1 i adaptera stolika (Produkt nr 64-0277 firmy Warner) |
| Kontroler temperatury TC2BIP 2/3Ch | Cell Microcontrols | ||
| 4-osiowy manualny manipulator miniaturowy | Siskiyou, Inc. | ||
| Drut platynowo-irydowy (0,002 in) | World Precision Instruments, Inc. | PTT0203 | |
| Izolator bodźców A365 | World Precision Instruments, Inc. | A365 Stimulus Isolator | |
| Wzmacniacz Multiclamp 700b | Axon Instruments | ||
| Przetwornik A/C Digidata 1322A | Axon Instruments | ||
| Oprogramowanie PClamp | Axon Instruments | ||
| Komputer osobisty (Pentium 4) | Dell | ||
| Tabela 3. Sprzęt i materiały do elektrofizjologii |
Bibliografia
- Norris, C. M., Halpain, S., Foster, T. C. Alterations in the balance of protein kinase/phosphatase activities parallel reduced synaptic strength during aging. J Neurophysiol. 80, 1567-1570 (1998).
- Norris, C. M., Korol, D. L., Foster, T. C. Increased susceptibility to induction of long-term depression and long-term potentiation reversal during aging. J Neurosci. 16, 5382-5392 (1996).
- Norris, C. M. Hippocampal 'zipper' slice studies reveal a necessary role for calcineurin in the increased activity of L-type Ca(2+) channels with aging. Neurobiol Aging. 31, 328-338 (2010).
- Burke, S. N., Barnes, C. A. Senescent synapses and hippocampal circuit dynamics. Trends Neurosci. 33, 153-161 (2010).
- Foster, T. C. Calcium homeostasis and modulation of synaptic plasticity in the aged brain. Aging Cell. 6, 319-325 (2007).
- Foster, T. C., Norris, C. M. Age-associated changes in Ca(2+)-dependent processes: relation to hippocampal synaptic plasticity. Hippocampus. 7, 602-612 (1997).
- Thibault, O., Gant, J. C., Landfield, P. W. Expansion of the calcium hypothesis of brain aging and Alzheimer's disease: minding the store. Aging Cell. 6, 307-317 (2007).
- Demuro, A., Parker, I., Stutzmann, G. E. Calcium signaling and amyloid toxicity in Alzheimer disease. J Biol Chem. 285, 12463-12468 (2010).
- Green, K. N., LaFerla, F. M. Linking calcium to Abeta and Alzheimer's disease. Neuron. 59, 190-194 (2008).
- Kumar, A., Thinschmidt, J. S., Foster, T. C., King, M. A. Aging effects on the limits and stability of long-term synaptic potentiation and depression in rat hippocampal area CA1. J Neurophysiol. 98, 594-601 (2007).
- Norris, C. M., Halpain, S., Foster, T. C. Reversal of age-related alterations in synaptic plasticity by blockade of L-type Ca2+ channels. J Neurosci. 18, 3171-3179 (1998).
- Norris, C. M., Scheff, S. W. Recovery of afferent function and synaptic strength in hippocampal CA1 following traumatic brain injury. J Neurotrauma. 26, 2269-2278 (2009).
- Sama, M. A. Interleukin-1beta-dependent signaling between astrocytes and neurons depends critically on astrocytic calcineurin/NFAT activity. J Biol Chem. 283, 21953-21964 (2008).
- Ye, H., Jalini, S., Mylvaganam, S., Carlen, P. Activation of large-conductance Ca(2+)-activated K(+) channels depresses basal synaptic transmission in the hippocampal CA1 area in APP (swe/ind) TgCRND8 mice. Neurobiol Aging. 31, 591-604 (2010).
- Bear, M. F., Malenka, R. C. Synaptic plasticity: LTP and LTD. Curr Opin Neurobiol. 4, 389-399 (1994).
- Foster, T. C. Involvement of hippocampal synaptic plasticity in age-related memory decline. Brain Res Brain Res Rev. 30, 236-249 (1999).
- Foster, T. C., Kumar, A. Susceptibility to induction of long-term depression is associated with impaired memory in aged Fischer 344 rats. Neurobiol Learn Mem. 87, 522-535 (2007).
- Hsu, K. S. Alterations in the balance of protein kinase and phosphatase activities and age-related impairments of synaptic transmission and long-term potentiation. Hippocampus. 12, 787-802 (2002).
- Vouimba, R. M., Foy, M. R., Foy, J. G., Thompson, R. F. 17beta-estradiol suppresses expression of long-term depression in aged rats. Brain Res Bull. 53, 783-787 (2000).
- Abdul, H. M., Furman, J. L., Sama, M. A., Mathis, D. M., Norris, C. M. NFATs and Alzheimer's Disease. Mol Cell Pharmacol. 2, 7-14 (2010).
- Abdul, H. M. Cognitive decline in Alzheimer's disease is associated with selective changes in calcineurin/NFAT signaling. J Neurosci. 29, 12957-12969 (2009).
- Anantharaman, M. Beta-amyloid mediated nitration of manganese superoxide dismutase: implication for oxidative stress in a APPNLH/NLH X PS-1P264L/P264L double knock-in mouse model of Alzheimer's disease. Am J Pathol. 168, 1608-1618 (2006).
- Gengler, S., Hamilton, A., Holscher, C. Synaptic plasticity in the hippocampus of a APP/PS1 mouse model of Alzheimer's disease is impaired in old but not young mice. PLoS One. 5, e9764-e9764 (2010).
- Stringer, J. L., Lothman, E. W. In vitro effects of extracellular calcium concentrations on hippocampal pyramidal cell responses. Exp Neurol. 101, 132-146 (1988).
- Landfield, P. W., Pitler, T. A., Applegate, M. D. The effects of high Mg2+-to-Ca2+ ratios on frequency potentiation in hippocampal slices of young and aged rats. J Neurophysiol. 56, 797-811 (1986).
- Ames, A. 3rd, Sakanoue, M., Endo, S. NA, K, CA, MG, AND C1 CONCENTRATIONS IN CHOROID PLEXUS FLUID AND CISTERNAL FLUID COMPARED WITH PLASMA ULTRAFILTRATE. J Neurophysiol. 27, 672-681 (1964).
- Gant, J. C., Sama, M. M., Landfield, P. W., Thibault, O. Early and simultaneous emergence of multiple hippocampal biomarkers of aging is mediated by Ca2+-induced Ca2+ release. J Neurosci. 26, 3482-3490 (2006).
- Thibault, O., Hadley, R., Landfield, P. W. Elevated postsynaptic [Ca2+]i and L-type calcium channel activity in aged hippocampal neurons: relationship to impaired synaptic plasticity. J Neurosci. 21, 9744-9756 (2001).
- Thibault, O., Landfield, P. W. Increase in single L-type calcium channels in hippocampal neurons during aging. Science. 272, 1017-1020 (1996).
- Stutzmann, G. E., Caccamo, A., LaFerla, F. M., Parker, I. Dysregulated IP3 signaling in cortical neurons of knock-in mice expressing an Alzheimer's-linked mutation in presenilin1 results in exaggerated Ca2+ signals and altered membrane excitability. J Neurosci. 24, 508-513 (2004).
- Stutzmann, G. E. Enhanced ryanodine receptor recruitment contributes to Ca2+ disruptions in young, adult, and aged Alzheimer's disease mice. J Neurosci. 26, 5180-5189 (2006).
- Lee, H. K., Min, S. S., Gallagher, M., Kirkwood, A. NMDA receptor-independent long-term depression correlates with successful aging in rats. Nat Neurosci. 8, 1657-1659 (2005).
- McNaughton, B. L., Douglas, R. M., Goddard, G. V. Synaptic enhancement in fascia dentata: cooperativity among coactive afferents. Brain Res. 157, 277-293 (1978).
Przedruki i uprawnienia
