Badania in vivo i in vitro nad oddziaływaniem adaptora z klatryną

Podsumowanie

Endocytoza zależna od klatryny opiera się na białkach adaptorowych, które koordynują selekcję ładunku i montaż otoczki klatrynowej. W niniejszym opracowaniu opisujemy procedury służące do badania fizycznych oddziaływań między białkami adaptorowymi a klatryną oraz metody obrazowania żywych komórek, wykorzystując jako model drożdżowe białko adaptorowe endocytozy Sla1p.

Streszczenie

Główna ścieżka endocytozy rozpoczyna się od tworzenia pęcherzyków powleczonych klatryną (CCVs), które transportują ładunek z powierzchni komórki do endosomów^1-6. Pęcherzyki CCVs charakteryzują się poliedryczną siecią klatryny, która otacza błonę pęcherzyka i służy jako rusztowanie mechaniczne. Powłoki klatryny są montowane podczas formowania pęcherzyka z pojedynczych triskelionów klatryny, czyli rozpuszczalnej formy klatryny składającej się z trzech podjednostek łańcucha ciężkiego i trzech podjednostek łańcucha lekkiego^7,8. Ponieważ triskelion nie posiada zdolności do bezpośredniego wiązania się z błoną, kluczowe znaczenie mają adaptory wiążące klatrynę, które łączą powstającą sieć klatryny z błoną poprzez asocjację z lipidami i/lub białkami błonowymi⁹. Adaptory odpowiadają również za pakowanie ładunku białek transbłonowych, takich jak receptory, oraz mogą oddziaływać ze sobą i z innymi komponentami mechanizmu formowania CCV⁹.

Opisano ponad dwadzieścia adaptorów klatryny; niektóre z nich biorą udział w endocytozie zależnej od klatryny, a inne lokalizują się w sieci trans-Golgi lub w endosomach⁹. Z wyjątkiem HIP1R (Sla2p u drożdży), wszystkie znane adaptory klatryny wiążą się z domeną N-końcową typu śmigła (propeller) ciężkiego łańcucha klatryny⁹. Adaptory klatryny są białkami modularnymi, składającymi się z pofałdowanych domen połączonych nieustrukturyzowanymi, elastycznymi łącznikami. W obrębie tych regionów łącznikowych krótkie motywy wiążące pośredniczą w oddziaływaniach z domeną N-końcową klatryny lub innymi komponentami aparatu tworzenia pęcherzyków⁹. Zdefiniowano dwa odrębne motywy wiążące klatrynę: clathrin-box oraz W-box⁹. Konsensusowa sekwencja clathrin-box została pierwotnie zdefiniowana jako L[L/I][D/E/N][L/F][D/E]¹⁰, lecz w późniejszym czasie odkryto jej warianty¹¹. W-box odpowiada sekwencji PWxxW (gdzie x oznacza dowolny aminokwas).

Sla1p (Synthetic Lethal with Actin binding protein-1) został pierwotnie zidentyfikowany jako białko związane z aktyną i jest niezbędny dla prawidłowej struktury i dynamiki cytoszkieletu aktynowego w miejscach endocytozy w komórkach drożdży¹². Sla1p wiąże również endocytyczny sygnał sortowania NPFxD i ma kluczowe znaczenie dla endocytozy ładunków posiadających sygnał NPFxD^13,14. Niedawno wykazano, że Sla1p wiąże klatrynę poprzez motyw podobny do skrzynki klatrynowej (clathrin box), LLDLQ, nazywany wariantową skrzynką klatrynową (vCB), i pełni funkcję endocytycznego adaptora klatryny¹⁵. Ponadto Sla1p stał się powszechnie stosowanym markerem otoczki endocytycznej w badaniach z wykorzystaniem fluorescencyjnej mikroskopii komórek żywych¹⁶. W niniejszej pracy wykorzystujemy Sla1p jako model do opisu podejść w badaniach nad oddziaływaniami między adapterem a klatryną. Skupiamy się na metodach fluorescencyjnej mikroskopii komórek żywych, GST-pull down oraz ko-immunoprecypitacji.

Protokół

1. Wprowadzenie znacznika GFP i markera selekcyjnego do genu SLA1

Zastosuj metodę Longtine¹⁷ w celu bezpośredniego połączenia znacznika GFP na końcu 3' otwartej ramki odczytu genu SLA1 (K-koniec Sla1p) i jednoczesnego oznakowania genu genem E. coli kan^r, który umożliwia selekcję za pomocą G418.

1. Wygenerować fragment DNA metodą PCR, wykorzystując jako matrycę plazmid pFA6a-GFP(S65T)-kanMX6¹⁸ oraz następujące primery: forward, 5'-CA AGG CAA GCC AAC ATA TTC AAT GCT ACT GCA TCA AAT CCG TTT GGA TTC CGG ATC CCC GGG TTA ATT AA-3' oraz reverse, 5'-CA TAT AGC TTG TTT TAG TTA TTA TCC TAT ....

Dyskusja

Pęcherzyki powlekane klatryną (CCV) uczestniczą w endocytozie oraz transporcie z sieci trans-Golgi i endosomów, które są konserwatywnymi szlakami o fundamentalnym znaczeniu dla biologii komórki eukariotycznej. Metody opisane w niniejszej pracy są przydatne do badania mechanizmów molekularnych odpowiedzialnych za formowanie się CCV, w szczególności oddziaływań między białkami adaptorowymi a klatryną. Testy powinowactwa białek fuzyjnych GST oraz analizy koimmunoprecypitacji umożliwiają sprawdzenie fizycznego powią.......

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
zestaw do mutagezy celowanej QuickChange-XL	Stratagene
koktajl inhibitorów proteaz	Sigma