Badania in vivo i in vitro nad oddziaływaniem adaptora z klatryną

Podsumowanie

Endocytoza zależna od klatryny opiera się na białkach adaptorowych, które koordynują selekcję ładunku i montaż otoczki klatrynowej. W niniejszym opracowaniu opisujemy procedury służące do badania fizycznych oddziaływań między białkami adaptorowymi a klatryną oraz metody obrazowania żywych komórek, wykorzystując jako model drożdżowe białko adaptorowe endocytozy Sla1p.

Streszczenie

Główna ścieżka endocytozy rozpoczyna się od tworzenia pęcherzyków powleczonych klatryną (CCVs), które transportują ładunek z powierzchni komórki do endosomów^1-6. Pęcherzyki CCVs charakteryzują się poliedryczną siecią klatryny, która otacza błonę pęcherzyka i służy jako rusztowanie mechaniczne. Powłoki klatryny są montowane podczas formowania pęcherzyka z pojedynczych triskelionów klatryny, czyli rozpuszczalnej formy klatryny składającej się z trzech podjednostek łańcucha ciężkiego i trzech podjednostek łańcucha lekkiego^7,8. Ponieważ triskelion nie posiada zdolności do bezpośredniego wiązania się z błoną, kluczowe znaczenie mają adaptory wiążące klatrynę, które łączą powstającą sieć klatryny z błoną poprzez asocjację z lipidami i/lub białkami błonowymi⁹. Adaptory odpowiadają również za pakowanie ładunku białek transbłonowych, takich jak receptory, oraz mogą oddziaływać ze sobą i z innymi komponentami mechanizmu formowania CCV⁹.

Opisano ponad dwadzieścia adaptorów klatryny; niektóre z nich biorą udział w endocytozie zależnej od klatryny, a inne lokalizują się w sieci trans-Golgi lub w endosomach⁹. Z wyjątkiem HIP1R (Sla2p u drożdży), wszystkie znane adaptory klatryny wiążą się z domeną N-końcową typu śmigła (propeller) ciężkiego łańcucha klatryny⁹. Adaptory klatryny są białkami modularnymi, składającymi się z pofałdowanych domen połączonych nieustrukturyzowanymi, elastycznymi łącznikami. W obrębie tych regionów łącznikowych krótkie motywy wiążące pośredniczą w oddziaływaniach z domeną N-końcową klatryny lub innymi komponentami aparatu tworzenia pęcherzyków⁹. Zdefiniowano dwa odrębne motywy wiążące klatrynę: clathrin-box oraz W-box⁹. Konsensusowa sekwencja clathrin-box została pierwotnie zdefiniowana jako L[L/I][D/E/N][L/F][D/E]¹⁰, lecz w późniejszym czasie odkryto jej warianty¹¹. W-box odpowiada sekwencji PWxxW (gdzie x oznacza dowolny aminokwas).

Sla1p (Synthetic Lethal with Actin binding protein-1) został pierwotnie zidentyfikowany jako białko związane z aktyną i jest niezbędny dla prawidłowej struktury i dynamiki cytoszkieletu aktynowego w miejscach endocytozy w komórkach drożdży¹². Sla1p wiąże również endocytyczny sygnał sortowania NPFxD i ma kluczowe znaczenie dla endocytozy ładunków posiadających sygnał NPFxD^13,14. Niedawno wykazano, że Sla1p wiąże klatrynę poprzez motyw podobny do skrzynki klatrynowej (clathrin box), LLDLQ, nazywany wariantową skrzynką klatrynową (vCB), i pełni funkcję endocytycznego adaptora klatryny¹⁵. Ponadto Sla1p stał się powszechnie stosowanym markerem otoczki endocytycznej w badaniach z wykorzystaniem fluorescencyjnej mikroskopii komórek żywych¹⁶. W niniejszej pracy wykorzystujemy Sla1p jako model do opisu podejść w badaniach nad oddziaływaniami między adapterem a klatryną. Skupiamy się na metodach fluorescencyjnej mikroskopii komórek żywych, GST-pull down oraz ko-immunoprecypitacji.

Protokół

1. Wprowadzenie znacznika GFP i markera selekcyjnego do genu SLA1

Zastosuj metodę Longtine¹⁷ w celu bezpośredniego połączenia znacznika GFP na końcu 3' otwartej ramki odczytu genu SLA1 (K-koniec Sla1p) i jednoczesnego oznakowania genu genem E. coli kan^r, który umożliwia selekcję za pomocą G418.

1. Wygenerować fragment DNA metodą PCR, wykorzystując jako matrycę plazmid pFA6a-GFP(S65T)-kanMX6¹⁸ oraz następujące primery: forward, 5'-CA AGG CAA GCC AAC ATA TTC AAT GCT ACT GCA TCA AAT CCG TTT GGA TTC CGG ATC CCC GGG TTA ATT AA-3' oraz reverse, 5'-CA TAT AGC TTG TTT TAG TTA TTA TCC TAT AAA ATC TTA AAA TAC ATT AAT GAA TTC GAG CTC GTT TAA AC-3'. Podkreślona sekwencja odpowiada specyficznemu segmentowi genu SLA1 bezpośrednio poprzedzającemu (primer forward) i następującemu po kodonie stop (primer reverse). Wyizolować produkt PCR za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym, a następnie przeprowadzić puryfikację DNA.
2. Przygotować 50 ml hodowli szczepu S. cerevisiae SEY6210 (MAΤα ura3-52, leu2-3,12 his3-Δ20, trp1-Δ901, lys2-801, suc2-Δ9 GAL-MEL) ¹⁹ w podłożu YPD, hodowanej we wczesnej fazie logarytmicznej (OD₆₀ =0.2-0.6). Wirować w temperaturze pokojowej przez 3 min przy 2,0 x g, a następnie dwukrotnie przemyć sterylną wodą.
3. Transformować komórki fragmentem PCR uzyskanym w kroku 1, stosując procedurę z octanem litu²⁰. Przemyć komórki 1 ml sterylnej wody, dodać 1 ml YPD i inkubować przez 4 h w 30 °C w inkubatorze z wytrząsaniem.
4. Wysiać komórki na płytki YPD-G418 w celu wyselekcjonowania transformantów opornych na G418, inkubować w 30 °C przez 2-3 dni. Wybrać kolonie i przełożyć je na płytki YPD-G418.
5. Za pomocą metody colony-PCR zidentyfikować transformanty, w których moduł GFP-kan został prawidłowo zintegrowany z sekwencjami genu SLA1 poprzez rekombinację homologiczną. Użyć primera forward, który przyłącza się w obrębie otwartej ramki odczytu SLA1, oraz primera reverse, który przyłącza się wewnątrz modułu GFP-kan. Wybrać kolonie, których produkty PCR mają oczekiwaną wielkość, i zweryfikować je poprzez sekwencjonowanie.
6. Przeprowadzić przesiew kolonii za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, aby potwierdzić obecność fluorescencji GFP.

2. Mutacja wariantowego obszaru klatrynowego (vCB) w genie SLA1

1. Wprowadź mutację LLDLQ na AAALQ w genie SLA1 (nukleotydy 2407-2415) stosując podejście dwuetapowe¹⁵.
2. W pierwszym kroku namnóż nukleotydy 1207-1410 oraz 2427-2589 genu SLA1 metodą PCR i sklonuj fragmenty odpowiednio do miejsc NotI/BamHI oraz EcoRI/SalI wektora pBluescriptKS.
3. Subklonuj do miejsc BamHI/EcoRI fragment PCR zawierający URA3.
4. Przetnij otrzymany plazmid enzymami NotI/SalI, wyizoluj fragment URA3 poprzez oczyszczanie w żelu i wprowadź go metodą transformacji octanem litu do szczepu Sla1-GFP wytworzonego w części 1 lub do szczepu TVY614 (MATa ura3-52 leu2-312 his3-Δ20 trp1-Δ901 lys2-801 suc2-Δ9 pep4::LEU2 prb1::HISG prc1::HIS3)²¹.
5. Wysiej komórki na uzupełnione pożywki SD pozbawione uracylu. Potwierdź za pomocą colony-PCR i sekwencjonowania, że kolonie Ura+ zawierają prawidłowo zintegrowany URA3 zastępujący fragment vCB.
6. W drugim kroku subklonuj nukleotydy 1207-2589 genu SLA1 do miejsc NotI/SalI wektora pBluescriptKS. Używając zestawu do mutagenezy ukierunkowanej QuickChange-XL (Stratagene), zmutuj reszty LLDLQ w vCB na AAALQ. Zweryfikuj wynik poprzez sekwencjonowanie.
7. Przetnij otrzymowany konstrukt enzymami BsgI/AgeI i wyizoluj fragment zawierający zmutowany vCB poprzez oczyszczanie w żelu. Wykonaj kotransformację fragmentu BsgI/AgeI wraz z pRS313 (HIS3)² do szczepu otrzymanego w punkcie 2.3.
8. Wysiej komórki na uzupełnione pożywki SD pozbawione histydyny. Przeniesienie kolonii His+ na podłoże agarowe zawierające kwas 5-fluorotykotowy w celu zidentyfikowania komórek, w których sekwencje zmutowane zastąpiły URA3, regenerując tym samym gen sla1 zawierający mutację LLDLQ na AAALQ (sla1^AAA). Potwierdź za pomocą colony-PCR i sekwencjonowania.

3. Mikroskopia fluorescencyjna

1. Hodować szczepy drożdży Sla1-GFP oraz sla1^AAA-GFP otrzymane w częściach 1 i 2 w 4 ml uzupełnionej pożywki SD w temperaturze 30°C na rotatorze w ciemności, aż do osiągnięcia OD₆₀ = 0,1-0,4. Wirować 1 ml kultury w mikrowirówce przy 4,00 x g przez 1 min w temperaturze pokojowej. Odrzucić ok. 950 μl supernatantu. Resuspender komórki w pozostałej cieczy (~50 μl).
2. Nanieść 3 μl zawiesiny komórkowej na szkiełko mikroskopowe i przykryć szkiełkiem nakrywką. Chronić próbkę przed światłem.
3. Zamocować szkiełko na obiektywie imersyjnym 10x mikroskopu konfokalnego z dyskiem obrotowym.
4. Zlokalizować odpowiednią płaszczyznę ogniskowania komórek, używając oświetlenia w polu jasnym lub lasera 48 nm z odpowiednimi filtrami w celu wzbudzenia i detekcji fluorescencji GFP.
5. Przechwycić obrazy time-lapse Sla1-GFP oraz sla1^AAA-GFP w komórkach z czasem ekspozycji 50 ms (lub inną odpowiednią wartością) w odstępach jednego obrazu na sekundę przez 150 sekund. Oczekiwany wynik: oznakowane GFP punkty pojawią się na wewnętrznej powierzchni błony ograniczającej komórkę, utrzymają się przez kilka sekund i będą przemieszczać się w stronę centrum komórki, podczas gdy sygnał szybko zanika (co wskazuje na rozkład otoczki).
6. Wybrać fragment obrazu, w którym widać pojawianie się, utrzymywanie przez kilka sekund i znikanie punktów. Wyciąć tę sekcję obrazu dla każdej klatki serii time-lapse.
7. Wygenerować kymograf reprezentujący tę sekcję obrazu w każdej klatce 150-sekundowego obrazowania time-lapse, wyrównując klatki wzdłuż osi odpowiadającej upływowi czasu.
8. Obliczyć czas trwania każdego punktu na podstawie tego, przez ile sekund (klatek time-lapse) punkt jest obecny na kymografie. Należy zauważyć, że każdy punkt powinien „wyginać się” w stronę wnętrza komórki podczas znikania, co odzwierciedla endocytozę i rozkład otoczki.
9. Porównać typ dziki Sla1-GFP z sla1^AAA-GFP. Powtórzyć pomiary, aby ustalić, czy wyniki są istotne statystycznie. Oczekiwany wynik: punkty sla1^AAA-GFP utrzymują się znacznie dłużej (~80 sec) niż typ dziki (~30 sec), co wskazuje na defekt w tworzeniu otoczki¹⁵.

4. Przygotowanie ekstraktu cytozolowego i całkowitego ekstraktu komórkowego drożdży

1. Zaszczep 3 litry pożywki YPD odpowiednim szczepem drożdży, np. TVY614 ²¹, i hoduj w 30 °C w inkubatorze z wytrząsarką do osiągnięcia wartości OD₆₀ = 1-2.
2. Odwiruj kulturę drożdży w temperaturze pokojowej przez 20 min przy 3 70 x g. Odlej nadsącz, dodaj 3-5 ml sterylnej wody i pipetuj w górę i w dół, aż osad zostanie całkowicie resuspendowany.
3. Wlej ~150 ml ciekłego azotu do plastikowego zlewka o pojemności 250 ml. Zamroź drożdże gwałtownie, dodając je kroplami do ciekłego azotu kolistym ruchem, aby uniknąć zlepiania się zamrożonych granulek. Nie dopuść do rozmrożenia granulek; w razie potrzeby dodaj więcej ciekłego azotu.
4. Schłodź stalowy pojemnik blendera, wlewając do niego ciekły azot. Pozostaw ciekły azot do prawie całkowitego odparowania. Przenieś zamrożone granulki drożdży do zimnego pojemnika blendera. Zamknij pojemnik zimnym gumowym korkiem i miel granulki drożdży przez 10 sekund. Odwróć pojemnik 3-4 razy, aby wymieszać zawartość, i powtórz etap mielenia dwukrotnie. Zmielone zamrożone drożdże będą miały postać proszku.
5. Schłodź lejek i probówkę stożkową o pojemności 50 ml ciekłym azotem. Używając zimnego lejka, przenieś zmielone drożdże do probówki. Zamrożone zmielone drożdże można przechowywać w -80 °C lub użyć natychmiast.
6. Aby uzyskać ekstrakt cytozolowy do testu powinowactwa białka fuzyjnego GST (Część 5), odważ 3 g zamrożonych zmielonych drożdży TVY614 do probówki stożkowej o pojemności 15 ml i resuspenduj w 3 ml buforu A w temperaturze pokojowej (10 mM HEPES, pH 7.0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT) zawierającego koktajl inhibitorów proteaz (Sigma).
7. Zakręć probówkę i odwróć ją kilkakrotnie, aż zawartość całkowicie się rozmroży, a następnie umieść na lodzie.
8. Ultracentryfuguj ekstrakt w 4 °C przez 20 min przy 30 00 x g. Ostrożnie przenieś nadsącz (ekstrakt cytozolowy) do probówki stożkowej za pomocą pipety, nie naruszając osadu. Przechowuj ekstrakt cytozolowy na lodzie.
9. Dodaj 10 μl zawiesiny (50% v/v) glutathione-Sepharose w buforze A. W celu ułatwienia pipetowania kulek wygodnie jest odciąć koniec końcówki. Rotuj w 4 °C przez 15 min, odwiruj kuleczki w 4 °C przez 2 min przy 1 0 x g i przenieś nadsącz (ekstrakt cytozolowy) do nowej probówki. Odstaw 50 μl ekstraktu jako kontrolę wejściową (input).
10. Aby uzyskać całkowite ekstrakty komórkowe do eksperymentów ko-immunoprecypitacji (Część 6), użyj szczepu TVY614 (WT SLA1), szczepu sla1^AAA z mutacją LLDLQ na AAALQ wygenerowaną w Części 2 w tle TVY614 oraz szczepu sla1 z delecją genu SLA1, np. GPY3130 ²³. Odważ 2 g odpowiednich zamrożonych zmielonych drożdży do probówek stożkowych i resuspenduj je w 2 ml buforu A w temperaturze pokojowej, zawierającego koktajl inhibitorów proteaz (Sigma) i 2% Triton X-10.
11. Zakręć probówkę i odwróć ją kilkakrotnie, aż zawartość całkowicie się rozmroży, a następnie inkubuj na lodzie przez 10 min, okresowo mieszając przez odwracanie.
12. Przenieś materiał do probówek do mikrocentryfugi i wiruj w 4 °C przez 15 min przy 16 0 x g (maksymalna prędkość mikrocentryfugi). Ostrożnie przenieś nadsącz (całkowity ekstrakt komórkowy) do probówki stożkowej na lodzie za pomocą pipety, nie naruszając osadu.
13. Dodaj 10 μl zawiesiny (50% v/v) protein A-Sepharose w buforze A. Rotuj w 4 °C przez 15 min, odwiruj kuleczki w 4 °C przez 2 min przy 1 0 x g i przenieś nadsącz (całkowity ekstrakt) do nowej probówki. Odstaw 50 μl ekstraktu jako kontrolę wejściową (input).

5. Analiza powinowactwa białka fuzyjnego GST

1. Wzmocnić metodą PCR fragment zawierający wariant klatrynowego motywu clathrin-box (vCB) białka Sla1p (reszty 803-807), sklonować go do wektora pGEX-5X w celu otrzymania pGEX-5X-vCB. Zweryfikować wynik poprzez sekwencjonowanie.
2. Wykorzystując pGEX-5X-vCB jako matrycę oraz zestaw do ukierunkowanej mutogenezy QuickChange-XL (Stratagene), zmutować reszty vCB LLDLQ na AAALQ w celu otrzymania pGEX-5X-vCBmut. Zweryfikować wynik poprzez sekwencjonowanie.
3. Wyeksponować GST oraz białka fuzyjne GST-vCB i GST-vCBmut w E. coli (BL21 DE3), oczyścić za pomocą glutationowej Sepharose, eluować z kulek zredukowanym glutationem, dializować przeciwko PBS i oznaczyć stężenie białka.
4. Oznakować 3 probówki do mikrocentryfugi: GST, GST-vCB oraz GST-vCBmut, a następnie dodać 1 ml PBS, 30 μl 50% (v/v) zawiesiny glutationowej Sepharose w buforze A oraz 50 μg dializowanych białek fuzyjnych GST, GST-vCB lub GST-vCBmut.
5. Inkubować w rotatorze w temperaturze pokojowej przez 30 min, aby umożliwić wiązanie.
6. Przepłukać kuleczki 2 razy PBS i 1 raz buforem A. Do każdej probówki dodać 1 ml ekstraktu cytozolowego z drożdży – przygotowanego zgodnie z opisem w Części 4.
7. Rotować probówki przez 1 h w 4 °C, wirować przez 10 sec przy 5,0 x g w celu osadzenia kuleczek, odrzucić supernatant i szybko przepłukać kuleczki 3 razy buforem A zawierającym 0,1% Triton X-10 oraz 1 raz samym buforem A.
8. Zwiryzować kuleczki jeszcze raz i za pomocą końcówki do nakładania próbek na żel usunąć jak najwięcej cieczy. Na tym etapie próbki można przechowywać w -20 °C i kontynuować procedurę w późniejszym terminie.
9. Do każdej probówki dodać 15 μl 2x buforu do próbek Laemmli, inkubować w 96 °C przez 5 min i wirować przez 10 sec przy 5,0 x g.
10. Przeanalizować próbki za pomocą immunoblottingu, używając przeciwciała przeciwko ciężkiemu łańcuchowi klatryny. Oczekiwane wyniki: klatryna wiąże się z GST-vCB, ale nie z GST ani GST-vCBmut. Przeanalizować również próbki metodą SDS-PAGE, aby potwierdzić podobną ilość naniesionych białek fuzyjnych GST.

6. Analiza koimmunoprecypitacji

1. Oznaczyć 3 probówki do mikrowirówki: WT (typ dziki SLA1), sla1^AAA oraz sla1Δ, a następnie dodać 1 ml PBS, 30 μl zawiesiny 50% (v/v) proteiny A-Sepharose w buforze A oraz 2 μg przeciwciała królika anty-Sla1p.
2. Inkubować w rotatorze w temperaturze pokojowej przez 30 min.
3. Przemyć kuleczki dwukrotnie PBS oraz jednokrotnie buforem A zawierającym 1% Triton X-10.
4. Dodać 1 ml odpowiednich całkowitych ekstraktów drożdżowych przygotowanych w Części 4: SLA1, sla1^AAA oraz sla1Δ. Inkubować w rotatorze przez 1 h w temperaturze 4 °C.
5. Wirować przez 10 sec przy 5,0 x g w celu osadzenia kuleczek, odlać nadosad, a następnie szybko przemyć kuleczki 3 razy buforem A zawierającym 0,1% Triton X-10 oraz raz samym buforem A.
6. ponownie odwirować kuleczki i za pomocą końcówki do nakładania próbek na żel usunąć jak najwięcej cieczy. Na tym etapie próbki można przechowywać w temperaturze -20 °C i kontynuować procedurę w późniejszym terminie.
7. Dodać 15 μl 2x buforu do próbek Laemmli do każdej probówki, inkubować w temperaturze 96 °C przez 5 min i wirować przez 10 sec przy 5,0 x g.
8. Próbki poddać analizie metodą immunoblottingu z użyciem przeciwciała przeciwko ciężkiemu łańcuchowi klatryny. Oczekiwane wyniki: klatryna współimmunoprecypituje z Sla1p typu dzikiego, ale nie z sla1^AAA ani w próbce sla1Δ.

7. Reprezentatywne wyniki

Rycina 1. Analiza adaptora klatrynowego Sla1p w miejscach endocytozy za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii żywych komórek. Pojedyncza klatka (po lewej) z filmu oraz odpowiadające jej kymografy (po prawej) komórek drożdży wykazujących ekspresję Sla1-GFP lub sla1^AAA-GFP z mutacją LLDLQ na AAALQ. Zarówno Sla1-GFP typu dzikiego, jak i mutant był wyrażany z endogennego locus SLA1. Miejsca endocytozy widoczne są jako jasne punkty rozmieszczone na obwodzie komórki (obrazy po lewej). Obszar między białymi liniami odpowiada regionowi, z którego wygenerowano kymografy. Filmy nagrywano z prędkością 1 klatka/sek. Zwróć uwagę na dłuższy czas życia Sla1-GFP u mutanta LLDLQ na AAALQ (sla1^AAA) w porównaniu z typem dzikim (SLA1).

Rysunek 2. Fizyczna interakcja między klatryną a wariantem sekwencji clathrin box białka Sla1p. Białko GST połączone z fragmentem Sla1p aa798-813 zawierającym sekwencję LLDLQ (GST-vCB), odpowiadający mutant AAALQ (GST-vCBmut) lub samo białko GST (GST) zostały związane z ziarnami sepharozy z glutationem i inkubowane z ekstraktem cytozolowym z komórek drożdży typu dzikiego. Powiązane białka wyeluowano i przeanalizowano za pomocą immunoblottingu (IB) w kierunku ciężkiego łańcucha klatryny.

Dyskusja

Pęcherzyki powlekane klatryną (CCV) uczestniczą w endocytozie oraz transporcie z sieci trans-Golgi i endosomów, które są konserwatywnymi szlakami o fundamentalnym znaczeniu dla biologii komórki eukariotycznej. Metody opisane w niniejszej pracy są przydatne do badania mechanizmów molekularnych odpowiedzialnych za formowanie się CCV, w szczególności oddziaływań między białkami adaptorowymi a klatryną. Testy powinowactwa białek fuzyjnych GST oraz analizy koimmunoprecypitacji umożliwiają sprawdzenie fizycznego powią...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
zestaw do mutagezy celowanej QuickChange-XL	Stratagene
koktajl inhibitorów proteaz	Sigma