Decelularyzacja i recelularyzacja całych wątrób

Podsumowanie

Decelularyzacja perfuzyjna jest nowoczesną techniką wytwarzania rusztowań całej wątroby, która zachowuje skład macierzy zewnątrzkomórkowej oraz mikroarchitekturę narządu. W niniejszym opracowaniu opisano metodę przygotowania rusztowań całego narządu z wykorzystaniem decelularyzacji perfuzyjnej i późniejszej repopulacji hepatocytami. Dzięki tej technice możliwe jest wytworzenie funkcjonalnych i możliwych do przeszczepienia graftów wątroby.

Streszczenie

Wątroba jest złożonym organem, który do przetrwania wymaga stałej perfuzji w celu dostarczania składników odżywczych i tlenu oraz usuwania produktów przemiany materii¹. Próby odtworzenia lub naśladowania mikrostruktury wątroby metodami od podstaw, z wykorzystaniem inżynierii tkankowej i technik mikrofabrykacji, nie odniosły dotąd sukcesu ze względu na to wyzwanie konstrukcyjne. Ponadto syntetyczne biomateriały stosowane do tworzenia rusztowań w zastosowaniach inżynierii tkankowej wątroby wykazywały ograniczoną zdolność do indukowania regeneracji i naprawy tkanek, w dużej mierze z powodu braku specyficznych motywów wiążących komórki, które indukowałyby odpowiednie funkcje komórkowe². Z drugiej strony, decelularyzowane tkanki natywne, takie jak naczynia krwionośne³ i skóra⁴, znalazły wiele zastosowań w inżynierii tkankowej i dostarczyły praktycznego rozwiązania niektórych z tych problemów. Przewagą decelularyzowanej macierzy natywnej jest to, że w pewnym stopniu zachowuje ona oryginalny skład oraz mikrostrukturę, co zwiększa adhezję i reorganizację komórek⁵.

W niniejszej pracy opisujemy metody perfuzyjnej decelularyzacji wątroby, pozwalające na uzyskanie nienaruszonego bio-rusztowania wątroby, które zachowuje strukturę głównych naczyń krwionośnych. Ponadto opisujemy metody recelularyzacji tych bio-rusztowań przy użyciu dorosłych pierwotnych hepatocytów, co pozwala na stworzenie przeszczepu wątroby funkcjonalnego in vitro, posiadającego dostęp naczyniowy niezbędny do transplantacji in vivo.

Protokół

1. Dekompozycja macierzy pozakomórkowej wątroby

1. Pobrać wątrobę szczura poprzez kaniulację żyły wrotnej za pomocą cewnika 18G. Pozostawić otwarte żyłę główną dolną i górną. Organ należy utrzymać w nawilżeniu w roztworze soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) w szalce Petriego o średnicy 10 cm.
2. Przygotować układ perfuzyjny składający się z 8-litrowego zbiornika, pompy perystaltycznej oraz pułapki pęcherzykowej.
3. Napełnić układ perfuzyjny roztworem PBS i utrzymywać przepływ przez 10 minut. Nalać PBS do szalki Petriego o średnicy 10 cm i zmniejszyć szybkość przepływu roztworu PBS do 1 mL/min.
4. Ostrożnie przenieść pobraną wątrobę do szalki Petriego o średnicy 10 cm wypełnionej roztworem PBS.
5. Kontynuować perfuzję PBS przez noc.
6. Rozpocząć perfuzję 0,01% (w/v) dodecylosiarczanu sodu (SDS) w wodzie destylowanej przez 5 minut.
7. Perfuzować roztworem PBS przez 1 godzinę.
8. Powtórzyć kroki 1.6 i 1.7 jeszcze trzy razy, zwiększając czas perfuzji SDS do odpowiednio 10, 15 i 20 minut przy każdym powtórzeniu.
9. Kontynuować perfuzję 0,01% (w/v) SDS przez 24 godziny.
10. Kontynuować perfuzję 0,1% (w/v) SDS przez 24 godziny.
11. Perfuzować 0,2% (w/v) SDS przez 3 godziny.
12. Perfuzować 0,5% (w/v) SDS przez 3 godziny.
13. Perfuzować wodą destylowaną przez 15 minut.
14. Perfuzować 1% (w/v) Triton X-100 w wodzie destylowanej przez 30 minut w celu usunięcia związanych kwasów nukleinowych.
15. Aby wypłukać zdecelularyzowaną macierz wątroby (DLM), perfuzować roztworem PBS przez 2 godziny.
16. Opcjonalnie: wyciąć wszystkie płaty z wyjątkiem płata środkowego.
17. Przechowywać DLM w czystej i szczelnej szalce Petriego nasączonej PBS w temperaturze 4^oC do momentu użycia (Rycina 1).
18. Aby wysterylizować DLM: 1) Przepłukać DLM sterylnym roztworem PBS zawierającym 0,1% (v/v) kwasu nadoctowego i 4% (v/v) etanolu, a następnie inkubować przez 3 godziny w 4^oC. 2) Przemyć sterylnym roztworem PBS 2 razy. 3) Przemyć sterylnym roztworem PBS zawierającym 2% penicyliny-streptomycyny, 10ug/ mL gentamycyny i 2,5 ug/ mL amfoterycyny B. Przechowywać zdecelularyzowaną wątrobę w tym samym roztworze w 4^oC do momentu rozpoczęcia eksperymentów z recelularyzacją.

2. Rekomórkowienie odkomórkowionej macierzy wątroby

1. W warunkach sterylnych przygotować system perfuzyjny składający się z komory perfuzyjnej, pompy perystaltycznej i pułapki na pęcherzyki powietrza. Napełnić system perfuzyjny 200 mL pożywki hodowlanej, np. DMEM z wysoką zawartością glukozy (Sigma), 10% płodowej surowicy bydlęcej (Hyclone), 100 U mL^-1 penicyliny oraz 100 μg mL^-1 streptomycyny (Invitrogen).
2. Umieścić zdekulularyzowaną macierz wątrobową w komorze perfuzyjnej i połączyć DLM z systemem perfuzyjnym poprzez kaniulę żyły wrotnej, utrzymując pracę pompy z przepływem 5 mL/min, aby uniknąć powstania pęcherzyków powietrza.
3. Prowadzić perfuzję pożywki przez DLM przez 30 minut.
4. Wyizolować pierwotne hepatocyty od dorosłego szczura, zapewniając żywotność na poziomie co najmniej 90%.
5. Zatrzymać przepływ w systemie perfuzyjnym i powoli wstrzyknąć 50 milionów hepatocytów (w 1-3 mL pożywki hodowlanej) do systemu perfuzyjnego poprzez pułapkę na pęcherzyki powietrza.
6. Uruchomić przepływ z prędkością 10 mL/min i recyrkulować pożywkę przez 10 minut.
7. Powtarzać kroki 2.5 i 2.6 do momentu wprowadzenia do DLM łącznie 200 milionów komórek (Ryc. 2)⁶.
8. Po przeprowadzeniu perfuzji wszystkich komórek do DLM, zebrać perfuzat do czterech 50-ml probówek wirówkowych i wirować z prędkością 600 rpm przez 10 minut. Odrzucić nadsączniki i zebrać osady do jednej probówki. Określić liczbę komórek oraz ich żywotność za pomocą metody wykluczania błękitu trypanowego w celu ustalenia wydajności zasiewu.

3. Hodowla in vitro recelularyzowanego przeszczepu wątroby

1. W warunkach sterylnych przygotować system perfuzyjny składający się z komory perfuzyjnej, pompy perystaltycznej, natleniacza i pułapki pęcherzyków powietrza (Rysunek 3). Napełnić system perfuzyjny 50 mL pożywki hodowlanej, np. Williams' E (Sigma), zawierającej 5% płodowej surowicy bydlęcej (Hyclone), 0,5 U mL^-1 insuliny (Eli Lilly), 20 ng mL^-1 EGF (Invitrogen), 14 ng mL^-1 glukagonu (Bedford Laboratories), 7,5 μg mL^-1 hydrokortyzonu (Pharmacia), 100 U mL^-1 penicyliny oraz 100 μg mL^-1 streptomycyny (Invitrogen).
2. Umieścić recelularyzowany przeszczep wątroby w komorze perfuzyjnej i połączyć DLM z systemem perfuzyjnym poprzez kaniulę żyły wrotnej, utrzymując pracę pompy z prędkością 5 mL/min, aby uniknąć powstania pęcherzyków powietrza.
3. Aseptycznie zamknąć komorę perfuzyjną i szczelnie ją uszczelnić, aby zapobiec jakimkolwiek wyciekom podczas hodowli.
4. Przenieść system perfuzyjny do inkubatora w temperaturze 37^oC i przy zawartości 10% CO₂, a następnie zwiększyć szybkość przepływu perfuzyjnego do 15 mL/min.
5. Podłączyć natleniacz do zbiornika z mieszanką gazową 95% O₂ i 5% CO₂ i ustawić przepływ gazu na 0,5 litra/min. Powinno to pozwolić na osiągnięcie ciśnienia parcjalnego tlenu na poziomie około 400 mmHg.
6. Hodowlę można kontynuować do 10 dni, codziennie wymieniając pożywkę. Codziennie można pobierać próbki pożywki w celu monitorowania funkcji wątroby przeszczepu, takich jak wydzielanie albuminy, mocznika i całkowitych kwasów żółciowych. Po zakończeniu okresu hodowli z recelularyzowanego przeszczepu wątroby można pobrać próbki do analizy molekularnej i histologicznej.

4. Reprezentatywne wyniki:

Całkowita decelularyzacja wątroby szczura zajmuje około 72 godzin przy zastosowaniu opisanego protokołu. Otrzymana macierz zachowuje 100% kolagenu włóknistego, 50% glikozaminoglikanów i tylko 5% DNA natywnej wątroby (Tabela 1)⁶. Struktura naczyniowa macierzy zostaje zachowana, co potwierdzono za pomocą odlewu korozyjnego i analizy w skaningowej mikroskopii elektronowej (Rycina 4)⁶. Obecność mikroarchitektury naczyniowej w DLM ułatwia ponowną populację komórkami z wydajnością 96% oraz późniejszą perfuzję do hodowli in vitro. Recelularyzowany graft wątroby może być hodowany in vitro do 10 dni i wykazuje prawidłowe funkcje wątroby, co potwierdzono poprzez pomiar wydzielania albumin, mocznika i całkowitych kwasów żółciowych (Rycina 5)⁶.

Rysunek 1. Decelularyzowana macierz wątroby po zakończeniu procesu decelularyzacji. (a) cała wątroba (b) płat środkowy po resekcji.

Rycina 2. Schematyczne przedstawienie recelularyzacji DLM.

Rysunek 3. Konfiguracja systemu perfuzji do hodowli in vitro recelularyzowanego przeszczepu wątroby.

Rycina 4. Struktura mikronaczyniowa zostaje zachowana w decelularyzowanej macierzy wątroby. Obrazy z odlewu korozyjnego a) prawidłowej wątroby, b) wątroby decelularyzowanej, naczynia wrotne (czerwone) i żylne (niebieskie). Obrazy z pomiarów za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej DLM: c) naczynie, d) przekrój zawierający małe naczynia przypominające przewodowe żółciowe (strzałki). Paski skali (a,b) 5 mm (c,d) 20 μm.

Rycina 5. Specyficzne funkcje wątroby zrecelularyzowanego przeszczepu wątroby podczas hodowli perfuzyjnej in vitro. a) wydzielanie albuminy (p = 0,5249), b) produkcja mocznika (p = 0,5271) oraz c) całkowite wydzielanie kwasów żółciowych (p = 0,0114). Analizę statystyczną różnic między grupą eksperymentalną a kontrolną przeprowadzono w okresie 10-dniowej hodowli za pomocą testu Friedmana przy a = 0,01. Słupki błędów reprezentują s.e.m. (n = 3).

	Świeża wątroba	Decelularyzowana macierz wątrobowaa	p-wartości	% świeżej wątroby
	n = 4	n = 8
Kolagen	0.07 ± 0.01	0.08 ± 0.03	0.56	114%
(mg na g wątroby)
Glikozaminoglikany	73.1 ± 6.7	34.2 ± 2.9	0.004	47%
(mg na g wątroby)
DNA	14.9 ± 5.6	0.44 ± 0.08	3.3 10-5	2.9%
(mg na g wątroby)

Tabela 1. Skład biochemiczny decelularyzowanej macierzy wątrobowej w porównaniu z wątrobą natywną.
^aWartości przedstawiono jako średnia ± s.e.m.

Dyskusja

Opisana tutaj metoda decelularyzacji perfuzyjnej pozwala na otrzymanie rusztowania całej wątroby, które zachowuje taką samą strukturę makroskopową i mikroarchitekturę naczyniową jak wątroba natywna. Rusztowanie to posiada skład macierzy pozakomórkowej zbliżony do naturalnej tkanki wątroby. Metoda recelularyzacji zapewnia wysoką wydajność ponownego zasiedlenia rusztowania komórkami, które pozostają żywe i funkcjonalne podczas testowanego okresu hodowli in vitro. Dzięki wprowadzeniu komórek nieparenchymalnych do r...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Dodecylosiarczan sodu	Sigma-Aldrich	L4390
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Napęd cyfrowy Masterflex L/S	Cole-Parmer	EW-07523-80
Standardowa głowica pompy Masterflex L/S	Cole-Parmer	EW- 07013-81
Pułapka pęcherzykowa	Radnoti Glass Technology Inc.	130149