Decelularyzacja perfuzyjna jest nowoczesną techniką wytwarzania rusztowań całej wątroby, która zachowuje skład macierzy zewnątrzkomórkowej oraz mikroarchitekturę narządu. W niniejszym opracowaniu opisano metodę przygotowania rusztowań całego narządu z wykorzystaniem decelularyzacji perfuzyjnej i późniejszej repopulacji hepatocytami. Dzięki tej technice możliwe jest wytworzenie funkcjonalnych i możliwych do przeszczepienia graftów wątroby.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Decelularyzacja i recelularyzacja całych wątrób
W tym artykule
Informacja o sprostowaniu
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
Podsumowanie
Streszczenie
Wątroba jest złożonym organem, który do przetrwania wymaga stałej perfuzji w celu dostarczania składników odżywczych i tlenu oraz usuwania produktów przemiany materii1. Próby odtworzenia lub naśladowania mikrostruktury wątroby metodami od podstaw, z wykorzystaniem inżynierii tkankowej i technik mikrofabrykacji, nie odniosły dotąd sukcesu ze względu na to wyzwanie konstrukcyjne. Ponadto syntetyczne biomateriały stosowane do tworzenia rusztowań w zastosowaniach inżynierii tkankowej wątroby wykazywały ograniczoną zdolność do indukowania regeneracji i naprawy tkanek, w dużej mierze z powodu braku specyficznych motywów wiążących komórki, które indukowałyby odpowiednie funkcje komórkowe2. Z drugiej strony, decelularyzowane tkanki natywne, takie jak naczynia krwionośne3 i skóra4, znalazły wiele zastosowań w inżynierii tkankowej i dostarczyły praktycznego rozwiązania niektórych z tych problemów. Przewagą decelularyzowanej macierzy natywnej jest to, że w pewnym stopniu zachowuje ona oryginalny skład oraz mikrostrukturę, co zwiększa adhezję i reorganizację komórek5.
W niniejszej pracy opisujemy metody perfuzyjnej decelularyzacji wątroby, pozwalające na uzyskanie nienaruszonego bio-rusztowania wątroby, które zachowuje strukturę głównych naczyń krwionośnych. Ponadto opisujemy metody recelularyzacji tych bio-rusztowań przy użyciu dorosłych pierwotnych hepatocytów, co pozwala na stworzenie przeszczepu wątroby funkcjonalnego in vitro, posiadającego dostęp naczyniowy niezbędny do transplantacji in vivo.
Protokół
1. Dekomórkowanie wątroby
- Pobrać wątrobę szczura, kaniulując żyłę wrotną za pomocą cewnika 18G. Pozostawić otwarte żyłę główną dolną i górną. Przechowywać organ w stanie nawodnionym w roztworze soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) w szalce Petriego o średnicy 10 cm.
- Przygotować układ perfuzyjny składający się z 8-litrowego zbiornika, pompy perystaltycznej oraz pułapki pęcherzyków powietrza.
- Napełnić układ perfuzyjny roztworem PBS i utrzymywać przepływ przez 10 minut. Nalać PBS do szalki Petriego o średnicy 10 cm i zmniejszyć szybkość przepływu roztworu PBS do 1 mL/min.
- Ostrożnie przenieść pobraną wątrobę do szalki Petriego o średnicy 10 cm wypełnionej roztworem PBS.
- Kontynuować perfuzję PBS przez noc.
- Rozpocząć perfuzję 0,01% (w/v) dodecylosiarczanu sodu (SDS) w wodzie destylowanej przez 5 minut.
- Perfundować PBS przez 1 godzinę.
- Powtórzyć kroki 1.6 i 1.7 jeszcze trzy razy, zwiększając czas perfuzji SDS do odpowiednio 10, 15 i 20 minut przy każdej kolejnej serii.
- Kontynuować perfuzję 0,01% (w/v) SDS przez 24 godziny.
- Kontynuować perfuzję 0,1% (w/v) SDS przez 24 godziny.
- Perfundować 0,2% (w/v) SDS przez 3 godziny.
- Perfundować 0,5% (w/v) SDS przez 3 godziny.
- Perfundować wodą destylowaną przez 15 minut.
- Perfundować 1% (w/v) Triton X-100 w wodzie destylowanej przez 30 minut w celu usunięcia związanych kwasów nukleinowych.
- Aby wypłukać zdecelularyzowaną macierz wątroby (DLM), perfundować PBS przez 2 godziny.
- Opcjonalnie: wyciąć wszystkie płaty z wyjątkiem płata środkowego.
- Przechowywać DLM w czystej i szczelnie zamkniętej szalce Petriego zanurzonej w PBS w temperaturze 4oC do momentu użycia (Rysunek 1).
- Aby wysterylizować DLM: 1) Przepłukać DLM sterylnym PBS zawierającym 0,1% (v/v) kwasu nadoctowego i 4% (v/v) etanolu, a następnie inkubować przez 3 godziny w temperaturze 4oC. 2) Wypłukać sterylnym PBS 2 razy. 3) Wypłukać sterylnym PBS zawierającym 2% penicyliny-streptomycyny, 10ug/ mL gentamycyny oraz 2,5 ug/ mL amfoterycyny B. Przechowywać zdecelularyzowaną wątrobę w tym samym roztworze w temperaturze 4oC do czasu rozpoczęcia eksperymentów z recelularyzacją.
2. Rekomórkowienie odkomórkowanej macierzy wątroby
- W warunkach sterylnych przygotować układ perfuzyjny składający się z komory perfuzyjnej, pompy perystaltycznej oraz pułapki na pęcherzyki powietrza. Napełnić układ perfuzyjny 200 mL pożywki hodowlanej, np. DMEM z wysoką zawartością glukozy (Sigma), 10% płodowej surowicy bydlęcej (Hyclone,), 100 U mL-1 penicyliny oraz 100 μg mL-1 streptomycyny (Invitrogen).
- Umieścić zdecelularyzowaną macierz wątroby w komorze perfuzyjnej i połączyć DLM z układem perfuzyjnym poprzez kaniulę żyły wrotnej, podczas gdy pompa pracuje z prędkością 5 mL/min, aby uniknąć powstania pęcherzyków powietrza.
- Przeprowadzić perfuzję pożywki przez DLM przez 30 minut.
- Wyizolować pierwotne hepatocyty od dorosłego szczura o żywotności co najmniej 90%.
- Zatrzymać przepływ w układzie perfuzyjnym i powoli wstrzyknąć 50 milionów hepatocytów (w 1-3 mL pożywki hodowlanej) do układu perfuzyjnego przez pułapkę na pęcherzyki powietrza.
- Uruchomić przepływ z prędkością 10 mL/min i recyrkulować pożywkę przez 10 minut.
- Powtarzać kroki 2.5 i 2.6 do momentu wprowadzenia do DLM łącznie 200 milionów komórek (Rysunek 2)6.
- Po upłynnięciu wszystkich komórek do DLM, zebrać perfuzat do czterech 50-ml probówek wirówkowych i wirować z prędkością 600 rpm przez 10 minut. Odrzucić nadsącz i zebrać osady do jednej probówki. Określić liczbę komórek i ich żywotność za pomocą metody wykluczania błękitu trypanu, aby wyznaczyć wydajność zasiewu.
3. Kultura in vitro recelularyzowanego przeszczepu wątroby
- W warunkach sterylnych przygotować układ perfuzyjny składający się z komory perfuzyjnej, pompy perystaltycznej, natleniacza i pułapki na pęcherzyki powietrza (Rysunek 3). Napełnić układ perfuzyjny 50 mL pożywki hodowlanej, np. Williams' E (Sigma), z dodatkiem 5% płodowej surowicy bydlęcej (Hyclone,), 0,5 U mL-1 insuliny (Eli Lilly), 20 ng mL-1 EGF (Invitrogen), 14 ng mL-1 glukagonu (Bedford Laboratories), 7,5 μg mL-1 hydrokortyzonu (Pharmacia), 100 U mL-1 penicyliny oraz 100 μg mL-1 streptomycyny (Invitrogen).
- Umieścić recelularyzowany przeszczep wątroby w komorze perfuzyjnej i połączyć DLM z układem perfuzyjnym poprzez kaniulę żyły wrotnej podczas pracy pompy z prędkością 5 mL/min, aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków powietrza.
- Aseptycznie zamknąć komorę perfuzyjną i szczelnie ją uszczelnić, aby uniknąć wszelkich wycieków podczas hodowli.
- Przenieść układ perfuzyjny do inkubatora w temperaturze 37oC z zawartością 10% CO2 i zwiększyć prędkość przepływu perfuzyjnego do 15 mL/min.
- Podłączyć natleniacz do zbiornika z mieszaniną gazową 95% O2 i 5% CO2 oraz ustawić przepływ gazu na 0,5 litra/min. Powinno to zapewnić ciśnienie parcjalne tlenu na poziomie około 400 mmHg.
- Hodowlę można kontynuować do 10 dni, dokonując codziennej wymiany pożywki. Można codziennie pobierać próbki pożywki w celu monitorowania funkcji wątroby przeszczepu, takich jak wydzielanie albumin, mocznika i całkowitych kwasów żółciowych. Po zakończeniu okresu hodowli z recelularyzowanego przeszczepu wątroby można pobrać próbki do analizy molekularnej i histologicznej.
4. Reprezentatywne wyniki:
Całkowita decelularyzacja wątroby szczura trwa około 72 godzin przy zastosowaniu opisanego protokołu. Powstała macierz zachowuje 100% kolagenu włóknistego, 50% glikozaminoglikanów i jedynie 5% DNA natywnej wątroby (Tabela 1)6. Struktura naczyniowa macierzy zostaje zachowana, co potwierdzono za pomocą odlewania korozyjnego oraz analizy z wykorzystaniem skaningowej mikroskopii elektronowej (Rycina 4)6. Obecność mikroarchitektury naczyniowej w DLM ułatwia ponowne zasiedlenie jej komórkami z wydajnością 96% oraz jej późniejszą perfuzję w celu hodowli in vitro. Recelularyzowany przeszczep wątroby może być hodowany in vitro do 10 dni i wykazuje prawidłowe funkcje wątrobowe, co potwierdzono poprzez pomiar wydzielania albuminy, mocznika i całkowitych kwasów żółciowych (Rycina 5)6.
Rycina 1. Decelularyzowana macierz wątroby po zakończeniu procesu decelularyzacji. (a) cała wątroba (b) płat środkowy po resekcji.
Rycina 2. Schematyczne przedstawienie recelularyzacji DLM.
Rycina 3. Konfiguracja układu perfuzyjnego do hodowli in vitro recelularyzowanego przeszczepu wątroby.
Rysunek 4. Struktura mikro naczyniowa zostaje zachowana w decelularyzowanej macierzy wątroby. Obrazy z odlewów korozyjnych a) prawidłowej wątroby b) wątroby decelularyzowanej, unaczynienie wrotne (czerwone) i żylne (niebieskie). Obrazy z mikroskopii skaningowej elektronowej DLM c) naczynia, d) przekroju zawierającego małe naczynia przypominające przewodowe żółciowe (strzałki), Paski skali (a,b) 5 mm (c,d) 20 μm.
Rysunek 5. Funkcje specyficzne dla wątroby recelularyzowanego przeszczepu wątroby podczas hodowli perfuzyjnej in vitro. a) sekrecja albuminy (p = 0,5249), b) produkcja mocznika (p = 0,5271) oraz c) całkowita sekrecja kwasów żółciowych (p = 0,0114). Analizę statystyczną różnicy między grupą eksperymentalną a kontrolną przeprowadzono w ciągu 10-dniowego okresu hodowli za pomocą testu Friedmana przy a = 0,01. Słupki błędów reprezentują s.e.m. (n = 3).
| Świeża wątroba | Decelularyzowana macierz wątrobowaa | pwartości p | % świeżej wątroby | |
| n = 4 | n = 8 | |||
| Kolagen | 0.07 ± 0.01 | 0.08 ± 0.03 | 0.56 | 114% |
| (mg na g wątroby) | ||||
| Glikozaminoglikany | 73.1 ± 6.7 | 34.2 ± 2.9 | 0.004 | 47% |
| (mg na g wątroby) | ||||
| Kwas deoksyrybonukleinowy | 14.9 ± 5.6 | 0.44 ± 0.08 | 3.3 10-5 | 2.9% |
| (mg na g wątroby) |
Tabela 1. Skład biochemiczny odkomórkowanej macierzy wątrobowej w porównaniu z wątrobą natywną.
aWartości przedstawiono jako średnia ± s.e.m.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opisana tutaj metoda decelularyzacji perfuzyjnej pozwala na otrzymanie rusztowania całej wątroby, które zachowuje taką samą strukturę makroskopową i mikroarchitekturę naczyniową jak wątroba natywna. Rusztowanie to posiada skład macierzy pozakomórkowej zbliżony do naturalnej tkanki wątroby. Metoda recelularyzacji zapewnia wysoką wydajność ponownego zasiedlenia rusztowania komórkami, które pozostają żywe i funkcjonalne podczas testowanego okresu hodowli in vitro. Dzięki wprowadzeniu komórek nieparenchymalnych do r...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano konfliktów interesów.
Podziękowania
Autorzy chcieliby podziękować Jackowi Milwidowi za zaprojektowanie komory perfuzyjnej in vitro. Praca ta była wspierana przez granty z amerykańskiego NIH, R01DK59766 oraz R01DK084053 dla M.Y., R00DK080942 dla K.U., amerykańskiego NSF CBET- 0853569 dla K.U. oraz Shriners Hospitals for Children dla B.E.U. (grant nr 8503). Dziękujemy również za wsparcie udzielone przez Shriners Hospitals for Children.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Dodecylosiarczan sodu | Sigma-Aldrich | L4390 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Napęd cyfrowy Masterflex L/S | Cole-Parmer | EW-07523-80 | |
| Standardowa głowica pompy Masterflex L/S | Cole-Parmer | EW- 07013-81 | |
| Pułapka pęcherzykowa | Radnoti Glass Technology Inc. | 130149 |
Bibliografia
- Kulig, K. M., Vacanti, J. P. Hepatic tissue engineering. Transpl Immunol. 12, 303-310 (2004).
- Lutolf, M. P., Hubbell, J. A. Synthetic biomaterials as instructive extracellular microenvironments for morphogenesis in tissue engineering. Nature biotechnology. 23, 47-55 (2005).
- Dahl, S. L., Koh, J., Prabhakar, V., Niklason, L. E. Decellularized native and engineered arterial scaffolds for transplantation. Cell Transplant. 12, 659-666 (2003).
- Schechner, J. S. Engraftment of a vascularized human skin equivalent. FASEB J. 17, 2250-2256 (2003).
- Gilbert, T. W., Sellaro, T. L., Badylak, S. F., F, S. Decellularization of tissues and organs. Biomaterials. 27, 3675-3683 (2006).
- Uygun, B. E. Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nat Med. , (2010).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
Sprostowanie
Formal Correction: Erratum: Decellularization and Recellularization of Whole Livers
Posted by JoVE Editors on 3/14/2011. Citeable Link.
A correction was made to Decellularization and Recellularization of Whole Livers. There was an error with an author's name. The author's last name had a typo and was corrected to:
Nima Saeidi
instead of:
Nima Saedi.
