Tworzenie kompleksowej bazy danych onkologii klatki piersiowej – narzędzie do badań translacyjnych

Podsumowanie

Opracowano bazę danych onkologii klatki piersiowej, która ma służyć jako kompleksowe repozytorium danych klinicznych i laboratoryjnych na potrzeby badań translacyjnych. Baza danych będzie służyć badaczom nowotworów w ramach Programu Badań nad Onkologią Klatki Piersiowej. Niniejsza baza danych jest możliwa do dostosowania do innych modeli nowotworowych, jak również do innych chorób ludzkich.

Streszczenie

Projekt Bazy Danych Programu Onkologii Torakalnej został stworzony, aby służyć jako kompleksowe, zweryfikowane i dostępne repozytorium dobrze opisanych próbek nowotworowych oraz danych klinicznych, przeznaczone dla badaczy w ramach Programu Badań nad Onkologią Torakalną. Baza ta gromadzi również obszerny zakres danych genomicznych i proteomicznych uzyskanych z różnych badań tkanek nowotworowych. Do zaprojektowania bazy powołano zespół badaczy nauk klinicznych i podstawowych, biostatystyka oraz eksperta w dziedzinie bioinformatyki. Zmienne o istotnym znaczeniu zostały jasno zdefiniowane, a ich opisy sporządzono w standardowej instrukcji operacyjnej, aby zapewnić spójność adnotacji danych. Zgodnie z protokołem prospektywnego biobankowania tkanek oraz oddzielnym protokołem biobankowania retrospektywnego, pobrano próbki tkanek nowotworowych i prawidłowych od pacjentów, którzy wyrazili zgodę na udział w tych procedurach. Informacje kliniczne, takie jak dane demograficzne, charakterystyka nowotworu oraz plany leczenia tych pacjentów, zostały wyekstrahowane i wprowadzone do bazy danych Access. W bazie uwzględniono dane proteomiczne i genomiczne, które powiązano z informacjami klinicznymi pacjentów opisanych w systemie. Dane z każdej tabeli zostały połączone za pomocą funkcji relacji w programie Microsoft Access, co pozwala zarządcy bazy danych na łączenie informacji klinicznych i laboratoryjnych podczas zapytania. Odpytane dane mogą być następnie eksportowane w celu przeprowadzenia analizy statystycznej i formułowania hipotez.

Protokół

1. Uniwersyteckie protokoły badań klinicznych:

1. Na potrzeby tej inicjatywy opracowano dwa protokoły uniwersyteckie. Pierwszy protokół umożliwia prospektywne pozyskiwanie tkanek od pacjentów z rakiem płuc, rakiem przełyku, guzem rakowcem, grasiczakiem i międzybłonkowcem. Protokół dopuszcza również pobieranie krwi i innych płynów ustrojowych od pacjentów do badań nad biomarkerami. Protokół pozwala badaczom na uzyskiwanie informacji klinicznych o pacjentach, będących źródłem takich próbek, poprzez analizę dokumentacji medycznej oraz przechowywanie zarówno próbek, jak i danych klinicznych w zabezpieczonej bazie danych.
2. Drugi protokół jest podobny do pierwszego, z tą różnicą, że umożliwia badaczom dostęp do tkanek i innych próbek zgromadzonych wcześniej w biobankach, uzyskanych w trakcie diagnozowania i leczenia nowotworu u pacjenta. Kwalifikowalne są pacjenci, którzy wyrazili zgodę na operację w University of Chicago i podpisali niniejszy protokół.

2. Protokół gromadzenia danych klinicznych:

1. Do niniejszego protokołu włączono pacjentów leczonych w University of Chicago Medical Center z powodu wyżej wymienionych nowotworów złośliwych.
2. Kwalifikowalnych pacjentów identyfikował ich lekarz onkolog prowadzący, a zgodę na udział w badaniu uzyskiwał członek zespołu klinicznego przeszkolony w zakresie obu protokołów.
3. Po uzyskaniu zgody, informacje z historii choroby pacjenta były pobierane poprzez analizę dokumentacji medycznej i wprowadzane do bazy danych przez członka zespołu wsparcia klinicznego.

3. Protokół pobierania próbek:

Próbki tkanek

1. W ramach niniejszego protokołu uwzględniono tkanki zawierające potwierdzony lub podejrzewany proces nowotworowy, pobrane podczas standardowej opieki klinicznej nad pacjentem drogą biopsji lub operacyjnie. Nie pobierano żadnych dodatkowych tkanek poza tymi, które były niezbędne do diagnostyki pacjenta.
2. Po chirurgicznym usunięciu próbki niezbędnej do przygotowania preparatów trwałych, pozostałą tkankę umieszczono w lodzie.
3. Technik ds. pozyskiwania tkanek przetransportował pozostałą próbkę w lodzie do oddziału patomorfologii.
4. Pozostałe tkanki zważono, zmierzono, przekazano do magazynowania, oznakowano i odpowiednio udokumentowano zgodnie ze standardową procedurą operacyjną.
5. Długoterminowe przechowywanie preparatów odbywało się w zamrażarce o temperaturze -80°C w oddziale patomorfologii.
6. W celu uzyskania próbek tkanek od pacjentów, którzy przeszli już operację z powodu nowotworu klatki piersiowej, korzystano z list pacjentów prowadzonych przez współpracujących chirurgów i radioterapeutów. W ten sposób zidentyfikowano odpowiednich pacjentów. Próbki ich tkanek nowotworowych można było pobrać z oddziału patomorfologii po uzyskaniu zgody.

Próbki krwi

7. Podczas pobrań krwi wskazanych klinicznie, protokół dopuszczał również pobranie dodatkowych od dwóch do sześciu probówek krwi 5 mL z zieloną zakrętką (heparyna), jednej probówki 10 mL z fioletową zakrętką (EDTA, DNA linii zarodkowej) oraz jednej probówki 10 mL z czerwoną zakrętką (surowica).
8. Pobrano do sześciu próbek w różnych punktach czasowych, z odnotowaniem daty pobrania krwi.
9. Próbki krwi wirowano przy 2000 rpm przez 10 minut.
10. Składniki osocza i surowicy rozdzielono do probówek kriowych w porcjach 1 mL.
11. W celu izolacji białych krwinek, górne 1-2 mL frakcji międzyfazowej/erytrocytarnej resuspensowano w 1-2 mL medium do konserwacji komórek (medium MEM EBS + 10% fetal cal serum + 5% DMSO).
12. Wszystkie próbki zamrażano powoli w izopropylowym pojemniku do zamrażania w temperaturze 70-80°C przez 16-24 godziny, a następnie przeniesiono do pojemnika do przechowywania w temperaturze od -70°C do -80°C.
13. Wszystkie próbki zostały oznakowane unikalnym identyfikatorem z kodem kreskowym i odpowiednio udokumentowane w formularzu pozyskiwania próbek przez technika laboratoryjnego.

Inne płyny ustrojowe:

14. Płyn niepobrany do celów klinicznych mógł zostać pobrany i przechowywany zgodnie z niniejszym protokołem. Próbki plwociny pobrano i przekazano do badania cytologicznego. Próbki plwociny transportowano w lodzie w temperaturze 4°C.
15. Próbki plwociny przeniesiono następnie do probówek typu Falcon o pojemności 15 mL i odwirowano przy 1400 rpm przez 10 minut.
16. Nadosad podzielono na porcje 4 mL w krio probówkach o pojemności 6 mL. Krio probówki umieszczono w zamrażarce, na suchym lodzie lub w pudełku do mrożenia z izopropanolem, aby następnie zamrozić je w temperaturze od -70°C do -80°C. Po 16–24 godzinach próbki przeniesiono do pudełka do przechowywania w temperaturze od -70°C do -80°C.
17. Wszystkie próbki zostały oznakowane unikalnym identyfikatorem z kodem kreskowym i odpowiednio udokumentowane w formularzu pozyskiwania próbek przez technika laboratoryjnego.

4. Budowa infrastruktury informatycznej:

1. Po ocenie wielu programów do zarządzania bazami danych, wybrano program Microsoft Access jako narzędzie do przechowywania danych klinicznych i laboratoryjnych dla projektu bazy danych programu onkologii klatki piersiowej (Thoracic Oncology Program Database Project), ze względu na jego funkcjonalność oraz możliwość łączenia powiązanych zestawów danych.
2. Zwołano zespół składający się z klinicystów, badaczy nauk podstawowych, biostatystyka oraz eksperta w dziedzinie bioinformatyki w celu zidentyfikowania zmiennych, które powinny zostać ujęte w bazie danych.
3. Zespół zidentyfikował elementy danych dotyczące demografii pacjentów, charakterystyki nowotworu, czynników epidemiologicznych oraz adnotacji do próbek, opierając się na potrzebach badaczy onkologii klatki piersiowej oraz odwołując się do standardów Wspólnych Elementów Danych (CDEs) ustanowionych przez National Cancer Institute.
4. Zespół opracował schemat kodowania, aby umożliwić analizę danych do celów badawczych. Tam, gdzie było to możliwe, dane kodowano za pomocą zmiennych numerycznych, aby ograniczyć ilość tekstu wpisywanego w formie swobodnej do bazy danych.
5. Zmienne zainteresowania podzielono na siedem różnych tabel w programie Microsoft Access, aby zarejestrować zróżnicowane aspekty powiązanych informacji.

5. Projektowanie zawartości każdej tabeli:

1. Utworzono siedem głównych tabel: 1) tabela Pacjenci, 2) tabela Dane próbek, 3) tabela TMA, 4) tabela Próbki DNA, 5) tabela Konferencja Onkologii Klatki Piersiowej oraz 6) tabela Linie komórkowe i 7) tabela C. elegans.
2. Tabela Pacjenci została zaprojektowana jako jedyna tabela w bazie danych przechowująca klinicznie istotne informacje o pacjentach, ich nowotworach, przebiegu klinicznym, czynnikach ryzyka oraz rokowaniu (Ryc. 1). Celem takiego projektu było ograniczenie redundancji w bazie danych.
3. Tabela Dane próbek wiąże materiały patomorfologiczne z pacjentami, od których je pobrano. Każdej próbce przypisuje się numer patomorfologiczny, który jest powiązany z numerem dokumentacji medycznej pacjenta. Od każdego pacjenta można pobrać wiele próbek, dlatego tabela zawiera również informacje o dacie pobrania materiału oraz rodzaju pobranej próbki: guz pierwotny, guz nawrotowy lub materiał z autopsji.
4. Tabela TMA była dotychczas wykorzystywana do rejestrowania danych o ekspresji 63 unikalnych białek. TMA można wykorzystać do charakterystyki rozkładu białek o zróżnicowanej ekspresji w tkance nowotworowej i nienowotworowej, stosując przeciwciała w celu lokalizacji białek (Ryc. 2). Ekspresja białka jest reprezentowana przez wynik 0, 1, 2 lub 3, w zależności od oceny patomorfologa dotyczącej intensywności i procentowego zasięgu barwienia TMA.
   W przypadku pomiaru procentowego barwienia wynik 0 oznacza brak barwienia, 1 oznacza barwienie poniżej 11%, 2 oznacza barwienie poniżej 50%, a 3 oznacza barwienie powyżej 50%. W przypadku pomiaru intensywności wynik jest przypisywany na podstawie względnej ilości barwienia, również w skali od 0 do 3. W niektórych przypadkach preparaty IHC są dodatkowo skanowane w wysokiej rozdzielczości, a intensywność barwienia jest kwantyfikowana przez oprogramowanie obrazujące Automated Cellular Imaging System (ACIS) równolegle do oceny patomorfologa. Jednak w obu technikach wyższy wynik wskazuje na większą ekspresję białka.
   Dodatkowo tabela TMA zawiera adnotacje dotyczące lokalizacji wycięcia TMA do przyszłego wglądu. Ponadto baza danych obejmuje źródło tkanki (nowotwór, tkanka prawidłowa, węzeł chłonny, tkanka przerzutowa), lokalizację w próbce (centrum, krawędź), histologię nowotworu oraz numer dokumentacji medycznej, aby powiązać te informacje z tabelą Pacjenci.
5. Tabela Próbki DNA zawiera listę całego DNA przechowywanego w laboratorium. Próbki DNA są powiązane z pacjentem za pomocą numeru jego dokumentacji medycznej. Rejestrowane są podstawowe informacje o próbce, opisujące źródło materiału, w tym lokalizację i histologię guza. Celem tej tabeli jest opisanie zmian genetycznych, które zostały zidentyfikowane w próbce przy użyciu reakcji łańcuchowej polimerazy, standardowego sekwencjonowania DNA oraz analiz mutacyjnych.
   Tabela rejestruje również zmienne takie jak zmiany aminokwasowe, zmiany nukleotydowe, homozygotyczność, synonimiczność oraz gen, w którym wystąpiła mutacja. Przykłady badanych genów obejmują Paxillin, cCbl, EGFR, p53, KRAS, cMet i EphB4. Wymieniony jest również badacz, który scharakteryzował dane mutacje.
6. Piątą tabelą w bazie danych jest tabela Konferencja Onkologii Klatki Piersiowej. Konferencja onkologii klatki piersiowej to cotygodniowe spotkanie onkologów klinicznych, chirurgów klatki piersiowej, patomorfologów, radiologów, radioterapeutów i innych członków klinicznego zespołu onkologii klatki piersiowej, którzy spotykają się w celu opracowania skoordynowanych planów leczenia pacjentów. Celem tej tabeli jest lista pacjentów, których przypadek był omawiany na konferencji w ramach standardu opieki. W tabeli tej rejestrowane są również informacje o dostępności materiałów patomorfologicznych dla każdego pacjenta.
7. Szóstą tabelą jest tabela Linie komórkowe. Jest to tabela autonomiczna w bazie danych, ponieważ nie jest powiązana z żadną inną tabelą. Opisuje ona linie komórkowe wykorzystywane w laboratorium do celów badawczych. Tabela rejestruje zmiany aminokwasowe, zmiany nukleotydowe, homozygotyczność i synonimiczność mutacji oraz lokalizację mutacji w DNA linii komórkowej.
8. Siódmą tabelą jest tabela C. elegans, która również jest tabelą autonomiczną. Tabela ta wymienia ortologiczne kinazy tyrozynowe receptorowe i zawiera wynik needle score, który jest miarą podobieństwa do białek ludzkich.

6. Ustanawianie relacji między tabelami:

1. Każdej tabeli przypisano klucz główny, który służy jako unikalny identyfikator dla każdego wpisu w obrębie tabeli. Z definicji wartość unikalnego identyfikatora nie może się powtarzać. Na przykład w tabeli Pacjenci kluczem głównym jest numer dokumentacji medycznej, ponieważ MRN może oznaczać tylko jedną, konkretną osobę. W tabeli Dane Próbek kluczem głównym jest numer patomorfologiczny próbki (SP). Ponieważ tabele TMA i Próbki DNA nie posiadały unikalnych identyfikatorów, jako klucz główny ustalono numer zastępczy. Tabele TMA i DNA zostały następnie powiązane z pozostałymi tabelami odpowiednio za pomocą numerów MRN i SP. Zapewnia to, że każdy wycinek TMA i próbka DNA są powiązane zarówno ze szczegółowymi informacjami o próbce, jak i z informacjami klinicznymi pacjenta-donora.
2. W programie Microsoft Access poszczególne tabele są łączone za pomocą ich kluczy głównych w taki sposób, aby ustanowić relacje logiczne (Rys. 3). Relacje te są niezbędne do generowania zapytań, w których dane są gromadzone z wielu tabel.

7. Odpytywanie:

1. Wykonanie zapytania dotyczącego powiązanych zestawów danych w programie Microsoft Access jest stosunkowo proste. Zapytanie można zaprojektować, wybierając „opcję projektowania zapytania” w karcie tworzenie.
2. Tabele zawierające interesujące pola są wybierane i wyświetlane.
3. Z wybranych tabel wybiera się zmienne, które w razie potrzeby można filtrować zgodnie z kryteriami badacza (Ryc. 4).
4. Następnie można uruchomić zapytanie, w wyniku czego wybrane pola zostaną wyświetlone w formie arkusza kalkulacyjnego.

8. Eksport danych:

1. Po wygenerowaniu zapytania dane można wyeksportować. Choć większość badaczy preferuje formę arkusza Microsoft Excel, dane można wyeksportować do wielu innych programów, korzystając z menu eksportu w zakładce „external data”. Dane można zapisać, używając odpowiedniego rozszerzenia pliku.
2. W przypadku eksportu danych do celów statystycznych, do pliku dołączany jest określony zestaw zmiennych, aby umożliwić przeprowadzenie kompleksowej analizy z uwzględnieniem współzmiennych.

9. Importowanie danych:

1. Importowanie danych wymaga pełnej zgodności między formatem importowanych danych a formatem tabeli w programie Access. Zmienne w tabeli przeznaczonej do importu muszą mieć takie same nazwy, jak w tabeli w Accessie. Pisownia musi być identyczna i nie może być dopuszczonych spacji w miejscach, w których nie występują one w tabeli w Accessie.
2. Po osiągnięciu spójności między obiema tabelami, użytkownik może skorzystać z zapytania do dopisania lub aktualizacji, aby zaimportować dane do Accessa. Zapytanie do dopisania pozwoli użytkownikowi na dodanie nowych wierszy danych do bazy danych Access. Na przykład, jeśli dostępne są informacje o pacjentach, którzy nie znajdowali się wcześniej w bazie danych, można użyć zapytania do dopisania, aby ich dodać. Jeśli natomiast dostępne są nowe dane dotyczące pacjentów lub próbek, które wymagają modyfikacji, należy przeprowadzić zapytanie do aktualizacji dla tych wpisów.

10. Aktualizacja bazy danych:

1. Członkowie projektu bazy danych mają określone role w zapewnieniu aktualności zawartych w niej informacji. Jeden pełnoetatowy pracownik jest odpowiedzialny za regularne uzupełnianie i aktualizowanie bazy danych o informacje kliniczne dotyczące pacjentów, którzy wyrazili zgodę w klinice.
2. Inny pełnoetatowy pracownik, pełniący funkcję menedżera danych, jest odpowiedzialny za pozyskiwanie danych laboratoryjnych w miarę ich dostępności oraz wprowadzanie tych informacji do bazy danych za pomocą zapytania aktualizującego lub dopisującego.
3. Asystenci badawczy przeszkoleni w protokole są odpowiedzialni za przeprowadzanie systematycznej aktualizacji bazy danych co sześć miesięcy w celu pozyskania najnowszych dostępnych danych. Jest to szczególnie istotne w przypadku takich pól jak status życiowy i data ostatniego kontaktu, ponieważ dane te mają bezpośredni wpływ na analizy przeżywalności wykonywane na podstawie zgromadzonych informacji.

11. Dostęp do bazy danych:

1. Baza danych jest dostępna wyłącznie dla osób spełniających wymogi HIPAA i ujętych w protokole IRB. Dostęp jest dodatkowo ograniczony do osób przeszkolonych w obsłudze programu Microsoft Access i posiadających bezpośrednią odpowiedzialność za aktualizację lub modyfikację danych.
2. Badacze, którzy przyczynili się do stworzenia bazy danych, mogą wnioskować o informacje z tej bazy do administratora danych, jednak sami nie mają uprawnień do bezpośredniego dostępu do danych.
3. Administrator danych przekazuje wnioskującym badaczom zanonimizowane informacje, usuwając zmienne takie jak numer dokumentacji medycznej oraz imię i nazwisko pacjenta podczas generowania zapytania eksportowego.

12. Reprezentatywne wyniki:

Badacz może być zainteresowany poznaniem znaczenia klinicznego nadekspresji białka Paxillin w niedrobnokomórkowym raku płuca. Ponieważ badacz ten wygenerował w bazie danych znaczną ilość danych TMA dla białka Paxillin, zarządca danych zatwierdza prośbę badacza o dostęp do informacji klinicznych w celu skorelowania ich z danymi laboratoryjnymi. Zarządca danych wykonuje zapytanie, w którym łączy tabelę Pacjentów (Patients Table) z tabelą TMA (TMA Table). Zmienne z tabeli Pacjentów, które są przedmiotem zainteresowania, obejmują datę urodzenia pacjenta, jego rasę, histologię nowotworu, stopień zaawansowania nowotworu, datę diagnozy, status życiowy, datę zgonu oraz datę ostatniego kontaktu. Wykorzystując te zmienne, takie jak wiek w momencie diagnozy i stopień zaawansowania, można uwzględnić i kontrolować istotne czynniki zakłócające. Z tabeli TMA można ustalić ważne informacje, takie jak typ guza oraz ekspresja białka.

Ponieważ obie tabele są powiązane za pomocą numeru dokumentacji medycznej, w wynikach uwzględnione są informacje o pacjentach, u których badano ekspresję Paxillin w guzach. Wyniki można filtrować tak, aby wyświetlać wyłącznie pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca. Wyniki można dalej doprecyzować w zależności od potrzeb badacza.

Wyniki te mogą zostać wyeksportowane do wstępnej analizy danych przez biostatystyka, a następnie przekazane badaczowi.

Strona główna projektu: Szablon bazy danych Access oraz Standardowa Procedura Operacyjna są dostępne pod adresem:
http://www.ibridgenetwork.org/uctech/salgia-thoracic-oncology-access-template

Licencja: Bezpłatnie dostępne do użytku akademickiego i niekomercyjnego.

Ograniczenia w użytkowaniu przez osoby spoza środowiska akademickiego: Użytkownicy komercyjni wymagają licencji. W przypadku pytań dotyczących zastosowań komercyjnych prosimy o kontakt z Biurem Technologii i Własności Intelektualnej Uniwersytetu w Chicago (UChicagoTech) pod numerem telefonu (773) 702-1692 lub pod adresem www.tech.uchicago.edu

Rycina 1. Zrzut ekranu z bazy danych Access przedstawiający fragment Tabeli Pacjentów.

Rysunek 2. Schemat przedstawiający macierz tkankową (TMA)²

Rycina 3. Zrzut ekranu przedstawiający relacje ustanowione pomiędzy tabelami w bazie danych Access. Tabele są powiązane za pomocą kluczy głównych.

Rycina 4. Przykładowe zapytanie dotyczące mutacji Paxillin, wyników TMA oraz zmiennych klinicznych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Wirówka	Eppendorf
Stożkowata probówka do wirowania	Falcon BD	518-PG
Podstawowa pożywka Eagle (MEM)	Sigma-Aldrich	M4655-500ML
Płodowa surowica cielęca	Cellgro	MTT35011CV
Dimetylosulfotlenek (DMSO)	American Bioanalytical	AB03091
Probówki do surowicy BD Vacutainer	Fisher Scientific	367815