Adaptacyjna ewolucja bakterii przy użyciu mikrobiologicznego systemu hodowli mikrokropelek

Streszczenie

Źródło: Jian, X. i in., Zautomatyzowana uprawa drobnoustrojów i ewolucja adaptacyjna przy użyciu systemu hodowli mikrodrobnoustrojów (MMC). J. Vis. Exp. (2022).

Ten film demonstruje zastosowanie systemu hodowli mikrobiologicznych mikrokropel do kierowania adaptacyjną ewolucją bakterii w kierunku tolerancji metanolu. Mieszając zmodyfikowane kultury bakteryjne z podłożem stresowym o wysokiej zawartości metanolu i dzieląc je na mikrokropelki, system wybiera mutanty, które wykazują lepszy wzrost pod wpływem stresu metanolowego. Poprzez iteracyjne cykle wzbogacania i izolację kolonii, szczepy bakterii przystosowane do metanolu są hodowane w celu dalszej analizy lub zastosowania.

Protokół

Ewolucja adaptacyjna w programie MMC

1. Przygotowanie do początkowego roztworu bakteryjnego
   1. Postępuj zgodnie z odpowiednimi przepisami normowymi, aby przygotować specjalne płynne podłoże i stałe płytki dla MeSV2.2 i autoklaw w temperaturze 121 °C przez 15 minut.
   2. Hodować MeSV2.2 na solidnej płytce (średnica = 90 mm) w inkubatorze o stałej temperaturze 37 °C przez 72 godziny. Następnie wybrać niezależną kolonię i hodować ją w kolbie do wytrząsania o pojemności 50 ml z 10 ml specjalnej płynnej pożywki w inkubatorze z wytrząsaniem (200 obr./min) w temperaturze 37 °C przez 72 godziny.
   3. Rozcieńczyć roztwór hodowlany MeSV2.2 z pożywką do OD₆₀₀ 0,1-0,2 (upewnić się, że całkowita objętość jest nie mniejsza niż 10 ml) i kontynuować hodowlę w kolbie wstrząsowej przez 5 godzin w celu uzyskania początkowego roztworu bakterii.
      NUTA: MeSV2.2 to szczep E. coli niezbędny do produkcji metanolu. Specjalna płynna pożywka zawiera 500 mmol/L metanolu, który jest silnym obciążeniem dla MeSV2.2, powodując bardzo powolny wzrost.
2. Zainicjuj program MMC.
3. Wyjmij dwie wysterylizowane butelki z odczynnikami, z których jedna jest przeznaczona na początkowy roztwór bakterii, a druga na świeżą pożywkę. Wstrzyknij początkowy roztwór bakterii (5 ml), świeżą pożywkę (12-15 ml) i olej MMC do butelek z odczynnikami.
   NUTA: Ponieważ ewolucja adaptacyjna jest długotrwałym procesem obejmującym wiele podupraw, przechowuj jak najwięcej świeżego podłoża w MMC. Pożywki nie można uzupełnić podczas eksperymentu.
4. Zainstaluj dwie butelki z odczynnikiem w MMC. Zainstaluj jeden dla początkowego roztworu bakterii między złączem C2 i O2, a drugi dla świeżego podłoża między złączem C4 i O4.
5. Kliknij ALE, aby wybrać funkcję ewolucji adaptacyjnej (Rysunek 1B). W interfejsie ustawiania parametrów włącz przełącznik wykrywania OD.

6. Ustaw liczbę na 50, długość fali na 600 nm, stężenie na 0%, wpisz jako czas, parametr na 30 h, a powtórzenia na 99. Kliknij Start, aby rozpocząć generowanie kropel. Zajmie to około 25 minut.
   NUTA: Tutaj "koncentracja" odnosi się do maksymalnego stężenia czynników chemicznych dla ewolucji adaptacyjnej. W przypadku różnych kropel w MMC możliwe jest wprowadzenie różnych stężeń czynników chemicznych w celu zapewnienia różnych warunków wzrostu. Obliczyć wprowadzone stężenia, stosując następujące równanie:

   

   Tutaj "C" odnosi się do stężenia czynników chemicznych wprowadzanych do kropel; "a" odnosi się do stężenia czynników chemicznych w butelkach z odczynnikiem między złączem C4 i O4; "b" odnosi się do stężenia czynników chemicznych w butelkach z odczynnikiem między złączem C6 i O6; a "i" odnosi się do dostępnego stężenia. W MMC dostępnych jest osiem stężeń. Ponieważ czynnik chemiczny ma tutaj pojedyncze stężenie (500 mmol/L metanolu) i jest jednym ze składników pożywki, instalowana jest tutaj tylko jedna butelka z odczynnikiem chemicznym zawierająca czynnik chemiczny, a stężenie jest ustawione na 0%. Typ odnosi się do trybu poduprawy, który dzieli się na trzy typy: tryb czasu, tryb wartości OD i tryb fluorescencji. Pierwsza z nich oznacza hodowlę kropel przez określony czas, a następnie podkultywację, podczas gdy dwie ostatnie oznaczają hodowlę kropel do wcześniej określonej wartości OD/intensywności fluorescencji, a następnie podkultywację. Parametr odnosi się do powiązanego parametru wymaganego przy wyborze trybu poduprawy. Powtórzenia odnoszą się do liczby podupraw.

7. Wyjmij butelkę z odczynnikiem umieszczoną między złączami C2 i O2.
8. Należy obserwować, czy maksymalne wartości OD kropelek podczas każdego okresu uprawy uległy znacznemu wzrostowi. Jeśli wzrost nastąpi i spełni wymagania eksperymentu, kliknij przycisk Eksport danych, aby wyeksportować dane OD.
   UWAGA: W tym przypadku okres uprawy zależy od parametru. Na przykład, przy ustawieniu Typu jako Czas i Parametru na 30 godzin, okres poduprawy wynosi 30 godzin. Podczas każdego okresu poduprawy ustalane są maksymalne wartości OD kropel. Oszacować, czy ewolucja adaptacyjna spełnia wymagania eksperymentu, poprzez zwiększenie maksymalnych wartości OD (wzrost zależy od rzeczywistego procesu uprawy szczepu, na przykład zwiększonego o ponad 20%). UWAGA: Zwróć uwagę, czy przechowywane świeże podłoże jest wyczerpane. Jeśli znaczny wzrost nie nastąpił nawet po wyczerpaniu pożywki, wyekstrahuj lepiej rosnące kropelki i przeprowadź nową rundę ewolucji adaptacyjnej.
9. Wyodrębnij docelowe kropelki z konsoli MMC.
   1. Kliknij przycisk Screening (Ekranowanie), aby wybrać funkcję ekstrakcji kropelek (Rysunek 1C). Wybierz opcję Zbierz, kliknij liczbę docelowych kropel, a następnie kliknij OK.
      NUTA: Przesiewanie kropelek obejmuje "Zbieranie", "Odrzucanie" i "Ekstrakcję roztworu nasion". "Ekstrakt z roztworu nasion" oznacza zebranie pozostałych kropelek po operacji poduprawy.
   2. Poczekaj, aż w wyskakującym okienku pojawi się komunikat "Wyciągnij szybkozłącze CF i włóż je do rurki EP". Umieść szybkozłączkę CF w probówce mikrowirówki w celu zebrania zgodnie z monitem oprogramowania, a następnie kliknij OK (rysunek 2D).
   3. Po 1-2 minutach w interfejsie oprogramowania pojawi się nowe okno z monitem: "Włóż łącznik z powrotem i kliknij OK, jeśli zakończono". Następnie włóż z powrotem szybkozłącze CF i kliknij przycisk OK, aby program MMC kontynuował działanie (Rysunek 2D).
      NUTA: Po zebraniu wszystkich docelowych kropel, MMC będzie kontynuować hodowlę pozostałych kropel. Jeśli uprawa nie jest konieczna, kliknij Zatrzymaj, aby bezpośrednio zakończyć operację.
   4. Pobrać kroplę za pomocą pipety o pojemności 2,5 μl, upuścić ją na płytkę agarozową o średnicy 90 mm i równomiernie rozprowadzić za pomocą trójkątnego szklanego pręta do rozprowadzania o boku długości 3 cm. Następnie hoduj ją w inkubatorze o stałej temperaturze 37 °C przez 72 godziny.
   5. Zebrać 3-5 niezależnych kolonii i oddzielnie hodować je w kolbach do wytrząsania o pojemności 50 ml z 10 ml świeżej pożywki w inkubatorze z wytrząsaniem (200 obr./min) w temperaturze 37 °C przez 48-72 godzin. Postępuj zgodnie z odpowiednimi przepisami standardowymi, aby przechowywać roztwór bakterii hodowlanych w probówce z glicerolem do kolejnych eksperymentów.

Wyniki

Rysunek 1: Interfejs oprogramowania operacyjnego MMC. (A) Główny interfejs oprogramowania. (1) Temperatura w komorze operacyjnej. (2) Wartość sygnału fotoelektrycznego rozpoznawania kropel. Gdy kropla przechodzi, wartoś...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Metanol	MACKLIN	M813895	Składnik specjalnego podłoża dla MeSV2.2.
System hodowli mikrokropelek drobnoustrojów (MMC)	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Sp. z o.o.	MMC-I	Wyznaczanie krzywej wzrostu i ewolucja adaptacyjna. Zapoznaj się z http://www.tmaxtree.com/en/index.php?v=news&id=110
Układ mikroprzepływowy	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Sp. z o.o.	MMC-ALE-OD	Do różnych operacji kropelkowych. Zapoznaj się z http://www.tmaxtree.com/en/
Olej MMC	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Sp. z o.o.	MMC-M/S-OD	Faza olejowa dla mikrofluidyki kropelkowej. Zapoznaj się z http://www.tmaxtree.com/en/
szalka Petriego	Corning Incorporated	90 mm	Do przygotowania podłoża stałego
Pipeta	Eppendorf powiedział:	2,5 μL, 10 μL, 100 μL, 1000 μL	Do pracy z cieczami
Szybkozłączka A	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Sp. z o.o.	—	Do połączenia każdego złącza. Zapoznaj się z http://www.tmaxtree.com/en/
Butelka z odczynnikiem	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Sp. z o.o.	Płytka PCB MMC	Pobieranie próbek i przechowywanie roztworu bakteryjnego i odczynników. Zapoznaj się z http://www.tmaxtree.com/en/
Wstrząśnij kolbą	Unia-Biotechnologia	50 ml	Do hodowli mikrobiologicznej
Inkubator z wytrząsaniem	Szanghaj Sukun Industrial Co., Ltd.	SKY-210 2B	Do hodowli mikrobiologicznej w kolbie wstrząsowej
Siarczan streptomycyny	Solarbio (Słoneczna Biologia)	Zobacz materiał S8290	Składnik specjalnego podłoża dla MeSV2.2.
Strzykawka	INSTRUKCJA MEDYCZNA JIANGSU ZHIYU CO., LTD	10 ml	Pobrać płyn i wstrzyknąć go do butelki z odczynnikiem
Igła do strzykawki	Sklep z narzędziami OUBEL	22 GB	Średnica wewnętrzna wynosi 0,41 mm, a średnica zewnętrzna 0,71 mm.