Artykuł metodologiczny

Przygotowanie skrawków, organotypowe hodowanie tkanek i rejestracja aktywności genów zegarowych za pomocą lucyferazy w jądrze nadskrzyżowaniowym

36.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/2439

⸱

15 lutego 2011

 ,  ,  , 
1Swedish Medical Nanoscience Center, Department of Neuroscience, Karolinska Institutet

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Opisano procedurę przygotowania skrawków zawierających jądro nadskrzyżowaniowe (SCN) podwzgórza dorosłej myszy oraz szybką metodę hodowli tkanki SCN w warunkach hodowli organotypowej. Ponadto opisano pomiar oscylacyjnej ekspresji białek genów zegarowych z wykorzystaniem dynamicznej technologii reporterowej lucyferazy.

Streszczenie

Centralny zegar okołodobowy (~24 h) koordynujący dzienne rytmy fizjologiczne i behawioralne znajduje się w jądrach nadskrzyżowaniowych (SCN) zlokalizowanych w przedniej części podwzgórza. Zegar ten jest bezpośrednio synchronizowany przez światło za pośrednictwem siatkówki i nerwu wzrokowego. Oscylacje okołodobowe są generowane przez oddziałujące na siebie pętle ujemnego sprzężenia zwrotnego szeregu tzw. „genów zegarowych” i ich produktów białkowych, w tym genów Period (Per). Główny mechanizm zegara zależy również od depolaryzacji błony, wapnia oraz cAMP 1. SCN wykazuje codzienne oscylacje w ekspresji genów zegarowych, aktywności metabolicznej i spontanicznej aktywności elektrycznej. Co istotne, ta endogenna aktywność cykliczna utrzymuje się w skrawkach tkanek SCN pobranych od dorosłych osobników 2-4. W ten sposób zegar biologiczny można łatwo badać in vitro, co umożliwia molekularne, elektrofizjologiczne i metaboliczne analizy funkcji rozrusznika.

jądro nadskrzyżowate (SCN) jest małą, wyraźnie zdefiniowaną strukturą obustronną, zlokalizowaną bezpośrednio nad skrzyżowaniem wzrokowym 5. U szczura każde jądro zawiera około 8000 neuronów i ma wymiary około 947 μm (długość, oś rostrokaudalna) x 424 μm (szerokość) x 390 μm (wysokość) 6. Aby wypreparować SCN, konieczne jest wykonanie przekroju mózgu na konkretnym poziomie, na którym można zidentyfikować SCN. W niniejszej pracy opisujemy procedurę preparowania i krojenia SCN, która jest podobna dla mózgów myszy i szczura. Ponadto pokazujemy, jak hodować wypreparowaną tkankę organotypowo na membranie 7, technikę opracowaną dla hodowli tkanki SCN przez Yamazaki et al. 8. Na koniec demonstrujemy, w jaki sposób tkanka transgeniczna może być wykorzystana do pomiaru ekspresji genów/białek zegarowych z wykorzystaniem dynamicznej technologii reportera lucyferazy, metody pierwotnie stosowanej do pomiarów okołodobowych przez Geusz et al. 9. Wykorzystujemy tutaj tkanki SCN z transgenicznych myszy knock-in PERIOD2::LUCIFERASE stworzonych przez Yoo et al. 10. Myszy te zawierają białko fuzyjne PERIOD (PER) 2 i enzym LUCIFERASE z świetlika. Gdy PER2 jest translacyjny w obecności substratu dla lucyferazy, tj. lucyferyny, ekspresję PER2 można monitorować jako bioluminescencję, gdy lucyferaza katalizuje utlenianie lucyferyny. Liczba emitowanych fotonów koreluje dodatnio z ilością wyprodukowanego białka PER2, a rytmy bioluminescencji odpowiadają rytmowi białka PER2 in vivo 10. W ten sposób cykliczne zmiany w ekspresji PER2 mogą być stale monitorowane w czasie rzeczywistym przez wiele dni. Protokół, który stosujemy w hodowli tkanek i rejestracji bioluminescencji w czasie rzeczywistym, został szczegółowo opisany przez Yamazaki i Takahashi 11.

Protokół

1. Przygotowanie roztworów

  1. Pożywka hodowlana o zdolności do buforowania powietrznego
    1. Napełnić butelkę o pojemności 1 litra około 80 mL sterylnej H2O (autoklawowanej wody milliQ H2O).
    2. Podczas mieszania dodać i wymieszać następujące substancje: 1 opakowanie proszku DMEM o niskiej zawartości glukozy, bez surowicy, 2902, bez wodorowęglanu sodu i czerwieni fenolowej (czerwień fenolowa zakłóca sygnał bioluminescencji), 20 mL suplementu B27 50x, 4,7 mL 7,5% roztworu NaHCO3 (lub 0,35 g NaHCO3), 10 mL HEPES 1M, 2,5 mL PenStrep 10 0 U/mL oraz 3,5 g D-glukozy. Mieszać pożywkę do całkowitego rozpuszczenia składników.
      Końcowa pożywka (1 litr) będzie zawierać:
      1x DMEM, 1x suplement B27, 4,2 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 25 U/mL penicyliny, 25 U/mL streptomycyny oraz 19 mM D-glukozy.
    3. Dostosować pH do wartości 7,2, używając NaOH do obniżenia lub HCl do podwyższenia pH, a następnie dopełnić objętość do 1 litra sterylną H2O.
    4. Dostosować osmolalność za pomocą H2O (obniżenie osmolalności) lub D-glukozy (podwyższenie osmolalności). Osmolalność musi mieścić się w zakresie 285-315 mOsm/Kg, jednak optymalny zakres to 30-310 mOsm/Kg. Nie rozcieńczać pożywki bardziej niż o 5%.
    5. Przefiltrować pożywkę hodowlaną, używając sterylnych zestawów do filtracji próżniowej Corning (np. 2 x 50 mL z rozmiarem porów 0,2 μm) w sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza. Przechowywać pożywkę w temperaturze 4°C i chronić przed światłem za pomocą folii aluminiowej. Zaleca się zużycie pożywki w ciągu 3 miesięcy.
  2. Bufor HBSS (zrównoważony roztwór soli Hank'a) z suplementami (do wycinania plastrów)
    1. Napełnić szklaną butelkę o pojemności 1 litra około 60 mL sterylnej (autoklawowanej milliQ) H2O i dodać następujące substancje: 10 mL roztworu stokowego HBSS 10x, 10 mL Penicyliny-Streptomycyny 10 0 U/mL, 5 mL 7,5% roztworu NaHCO3 oraz 10 mL HEPES 1M.
      Końcowy roztwór do wycinania będzie zawierać:
      1x HBSS, 10 mM HEPES, 4,5 mM NaHCO3, 10 U/mL penicyliny i 10 U/mL streptomycyny.
    2. Sprawdzić pH i w razie potrzeby dostosować je do wartości 7,2, a następnie dopełnić objętość do 1 litra sterylną H2O.
    3. Sprawdzić osmolalność, która musi mieścić się w zakresie 285-315 mOsm/Kg.
    4. Schłodzić HBSS do 4°C. Bufor HBSS musi być bardzo zimny (4°C) podczas procedury wycinania plastrów, aby spowolnić metabolizm i zachować żywotność tkanki.

2. Przygotowania przed cięciem i hodowlą plastrów

  1. Tkanki hoduje się w ciepłej, suchej komorze bez CO2. Aby zapobiec wysychaniu, hodowle należy uszczelnić szkiełkami nakrywkowymi przymocowanymi do naczyń za pomocą smaru. W tym celu należy napełnić strzykawki 5 mL smarem próżniowym na bazie silikonu. Końcówki strzykawek należy przykryć małymi kawałkami folii aluminiowej i poddać autoklawowaniu. Należy również autoklawować papierki filtracyjne (używane podczas procedury krojenia).
  2. Bezpośrednio przed procedurą krojenia należy nałożyć autoklawowany smar próżniowy na górną krawędź 35 mm szalek Petriego. Dla każdej hodowli plastrów należy przygotować osobną szalkę Petriego.
  3. Przed rozpoczęciem procedury krojenia wszystkie nienasterylizowane narzędzia, żyletki, ostrza do wibratomu, szkiełka nakrywkowe i inne materiały używane do przygotowania plastrów i hodowli muszą zostać wysterylizowane. Wszystkie nienasterylizowane sprzęty należy spryskać 70% etanolem. Narzędzia oraz wysmarowane szalki Petriego należy naświetlać promieniami UV w komorze z laminarnym przepływem powietrza przez co najmniej 30 minut przed rozpoczęciem hodowli.
  4. W tym samym czasie należy napełnić probówkę typu Falcon pożywką hodowlaną z buforem powietrznym (obliczyć 1,2 mL na każdą hodowlę; np. dla 8 hodowli przygotować 10 mL pożywki) i dodać świeżo rozmrożoną lucyferynę (roztwór zapasowy 0,1 M; Promega, Madison, WI) (10 μL lucyferyny na 10 mL pożywki; stężenie końcowe 0,1 mM).
  5. Lucyferyna jest światłoczuła, dlatego zarówno roztwory zapasowe, jak i pożywka zawierająca lucyferynę muszą być chronione przed światłem. Probówkę typu Falcon z pożywką z lucyferyną należy umieścić w ciemnej komorze grzewczej o temperaturze 36-37°C. W razie potrzeby lucyferynę można dodać bezpośrednio do naczyń hodowlanych w momencie krojenia. Jeśli nie dodano lucyferyny, nie zajdzie reakcja świetlna między lucyferazą a lucyferyną, a w konsekwencji nie pojawi się sygnał z tkanki.
  6. Po naświetlaniu promieniami UV do wibratomu należy przymocować sterylne ostrze.

3. Procedura krojenia SCN

Poniższa procedura opisuje przygotowanie plastrów tkanek z dorosłych myszy C57/BL6, zazwyczaj w wieku od 2 do 4 miesięcy. Uwaga: procedura cięcia, jak i ekspozycja zwierzęcia na światło w nocy, mogą w różny sposób zresetować fazę SCN. Aby tego uniknąć, cięcie i hodowla powinny być wykonywane w godzinach świetlnych, najlepiej między ZT 6-12, kiedy nie dochodzi do istotnych przesunięć fazowych wywołanych procedurą 12. Jeśli pobranie próbek SCN musi odbyć się w ciemności, etapy 3.1 i 3.2 należy przeprowadzić w czerwonym świetle lub w goglach nocnych, aby uniknąć przesunięć fazowych indukowanych światłem.

  1. Uśpić mysz, najlepiej izofluranem (Baxter) w szklanej komorze. Gdy zwierzę straci odruchy bólowe (sprawdzić poprzez uszczypnięcie paznokci w łapie), ale nie przestanie jeszcze oddychać (aby jak najdłużej utrzymać dopływ tlenu), szybko oddzielić głowę za pomocą nożyczek lub podobnego narzędzia.
    Uwaga: w niektórych krajach ekspozycja na CO2 (hiperkapnia) jest nadal dopuszczalna jako metoda anestezji, choć zgłaszano, że może ona nasilać lęk u zwierząt. Dodatkowo przed dekapitacją może być wymagane zwichnięcie karku. Podczas uśmiercania zwierząt należy przestrzegać lokalnych przepisów prawnych.
  2. Usunąć oczy z głowy za pomocą nożyczek, aby zapobiec naprężeniu i dalszemu pobudzeniu nerwów wzrokowych, co mogłoby uszkodzić SCN.
  3. Jeśli nadal są przytwierdzone, usunąć ostatni kręg szyjny nożyczkami, usunąć skórę (Ryc. 1a) i wykonać dwa cięcia precyzyjnymi nożyczkami (np. nożyczkami do tęczówki) – jedno cięcie z każdej strony czaszki wzdłuż boków, tworząc w ten sposób usuwalną „klapkę”.
  4. Otworzyć czaszkę za pomocą mikro kleszczyków kostnych (u myszy można również użyć precyzyjnych nożyczek do dyssekcji) i usunąć całą kość, aż do momentu, gdy będą widoczne cebulki węchowe. Pracować od góry, nigdy nie naciskając narzędziem na mózg, aby zapobiec uszkodzeniu brzusznej części SCN (Ryc. 1b).
  5. Ostrożnie przeciąć nerw wzrokowy między cebulkami węchowymi a półkulami, używając precyzyjnych mikro nożyczek dyssekcyjnych z blaszką. Należy upewnić się, że nerw został całkowicie przecięty, ponieważ rozciąganie nerwu wzrokowego może prowadzić do uszkodzeń w SCN i rozerwania skrawków.
  6. Odwrócić głowę do góry dnem i pozwolić nienaruszonemu mózgowi wypaść (jeśli mózg jest nadal przytwierdzony, może być konieczne przecięcie innych nerwów czaszkowych zaściankowo w stosunku do nerwu wzrokowego) do naczynia (np. szklanej szalki Petriego o średnicy ≈ 10 cm) wypełnionego 50-10 mL zimnego HBSS, co umożliwi szybkie schłodzenie mózgu. Idealnie oba nerwy wzrokowe powinny pozostać nienaruszone (Ryc. 1c). Trzymać mózg w HBSS przez 30-60 sekund, aby upewnić się, że został schłodzony.
  7. Za pomocą łyżeczki lub podobnego narzędzia umieścić schłodzony mózg powierzchnią grzbietową do góry na sterylnej powierzchni do cięcia (np. odwróconej do góry dnem pokrywce szalki Petriego). Aby przygotować cięcie koronarne, wykonać cięcie prostopadłe sterylnymi żyletkami lub skalpelami między półkulami mózgu a móżdżkiem, usuwając w ten sposób móżdżek.
  8. Nanieść superglue na suchą platformę wibroslicera/wibratomu.
  9. Podnieść mózg (półkule mózgu bez móżdżku i bez cebulek węchowych), wprowadzając ostrą, zakrzywioną pęsetę w część rostralną, i ostrożnie osuszyć HBSS na sterylnym papierze filtracyjnym, wciąż trzymając mózg pęsetą. (Zamiast pęsety można użyć małego kawałka sterylnego papieru filtracyjnego do przymocowania i przeniesienia mózgu).
  10. Zamocować półkule na przyklejonej platformie końcem rostralnym do góry i powierzchnią brzuszną najbliżej ostrza tnącego. Zamocować platformę w uchwycie wibratomu (np. firmy Campden Instruments, UK) i natychmiast wypełnić ją zimnym HBSS. Jeśli cięcie prostopadłe zostało wykonane prawidłowo, półkule powinny stać prosto, zapewniając odpowiedni kąt niezbędny do wykonania cięcia koronarnego zawierającego obustronne SCN.
  11. Aby dotrzeć do docelowego obszaru SCN, rozpocząć od odcinania grubszych sekcji (50-80 μm) półkul przy wysokiej lub maksymalnej prędkości wibratomu. Ruch ostrza na początku, przed dotarciem do podwzgórza, może być dość szybki, ale należy go spowolnić, gdy pojawi się skrzyżowanie wzrokowe (wysoka częstotliwość drgań ostrza i powolny ruch poziomy zmniejszają uszkodzenia komórek podczas cięcia, zwiększając tym samym żywotność skrawka). Zredukować grubość sekcji do 10 μm, gdy skrzyżowanie wzrokowe stanie się większe (szersze), a komisura przednia mniejsza. Aby uzyskać sekcję środkową SCN, przesuwać się „w dół” (w kierunku kaudalnym), aż zaczną pojawiać się dwa jądra SCN. Do wizualizacji jąder może być potrzebna lupa. Uwaga: w mózgu myszy SCN znajduje się bardziej kaudalnie od skrzyżowania wzrokowego w porównaniu do mózgu szczura.
  12. Po osiągnięciu pożądanego poziomu SCN (w tym punkcie SCN będzie widoczny jako bardziej zdefiniowane struktury o kształcie okrągłym lub migdałowatym; Ryc. 1d; około Bregma -0,46- -0,70 mm dla regionu centralnego SCN u myszy 13, Bregma -0,92- -1,40 mm dla szczura 14), wyciąć sekcję SCN (Ryc. 1e). Odpowiednia grubość skrawka wynosi 250 ± 50 μm dla myszy oraz 350 ± 50 μm dla szczura.
  13. Używając miękkiego pędzla, podnieść i przenieść skrawka SCN na pokrywkę od średniej szalki Petriego wypełnionej zimnym HBSS, umieszczoną pod mikroskopem sekcyjnym lub stereomikroskopem. Sprawdzić pod powiększeniem, czy obustronne SCN są wyraźnie widoczne. Jeśli wybrano region środkowy SCN (który niekoniecznie musi być jedynym „optymalnym” poziomem cięcia, ale uważamy go za najprostszy sposób standaryzacji procedury cięcia i ograniczenia zmienności), powinien on być wyraźnie widoczny co najmniej po jednej stronie sekcji skrawka. Jeśli cięcie było zbyt rostralne, wykonać kolejną sekcję i ponownie sprawdzić obecność SCN pod powiększeniem.

4. Organotypowa hodowla SCN

  1. W pokrywce szalki Petriego wypełnionej HBSS, pod mikroskopem dissectingowym i za pomocą pary sterylnych skalpeli, wyciąć obustronne SCN w formie kwadratowego fragmentu tkanki (o boku ok. 1,5 mm). Do eksplantu powinien pozostać przytwierdzony mały fragment skrzyżowania wzrokowego, jednak nie należy dołączyć żadnych innych jąder. Cięcie należy wykonać jak najbliżej SCN, tak aby nie usunąć jego tkanki.
  2. Jeśli jest to odpowiednie dla planowanego eksperymentu, obustronne SCN można następnie przeciąć na pół, aby uzyskać dwa jednostronne SCN. Jedno jednostronne SCN może być wówczas wykorzystane jako kontrola (Rys. 2a).
  3. Wypełnij 1200 μL pożywki z lucyferyną do szalki Petriego o średnicy ≈ 35 mm i umieść membranę hodowlaną (Milli-CM- 0.4 μm, Millipore, Bedford, MA) na powierzchni cieczy (2b). Objętość pożywki jest kluczowa, ponieważ membrana hodowlana powinna stabilnie spoczywać na dnie naczynia hodowlanego, a nie pływać ani kołysać się w pożywce 11Upewnij się, że pod membraną nie ma pęcherzyków powietrza. Podczas pracy z lucyferyną unikaj niepotrzebnej ekspozycji na światło.
  4. Eksplanty są małe i trudne do podniesienia, dlatego należy użyć 1000 μL pipeta z końcówką do zassania eksplantu SCN do końcówki i naniesienia go na membranę. W przypadku, gdy eksplant jest zbyt duży, aby łatwo zmieścić się w 1000 μL końcówka do pipety (np. szczurze SCN oraz mysie obustronne SCN); końcówkę można odciąć sterylnym narzędziem, aby uzyskać szerszy otwór. Za pomocą pipety usunąć nadmiar HBSS z błony. W przypadku pomiaru lucyferazy umieścić tylko jedno SCN/szalkę (Rys. 2b), ponieważ probówki pomiarowe wykrywają wszystkie fotony emitowane z szalki i nie rozróżniają sygnałów pochodzących z różnych tkanek.
  5. Uszczel naczynie za pomocą szkiełka zakrywkowe (≈ 40 mm, Menzel-Gläser, Niemcy) i smaru próżniowego (Dow Corning Corp, USA)11Upewnij się, że uszczelnienie jest szczelne (Rys. 2c). W przeciwnym razie zastosuj więcej smaru w celu uszczelnienia.
  6. Przenieś naczynia do 36-37°C umieścić w komorze światłoszczelnej i niezwłocznie rozpocząć rejestrację sygnałów z PMT.

5. Pomiar aktywności lucyferazy poprzez rejestrację bioluminescencji

Sygnały bioluminescencji indukowanej lucyferazą z niewielkiej tkanki SCN są wykrywane i wzmacniane za pomocą zestawów detektorów z fotopowielaczem (PMT) zamontowanych wewnątrz komory światłoszczelnej. Fotopowielacze są zazwyczaj umieszczone na wysokości ~ 1-2 cm nad naczyniami hodowlanymi 8. Układy rejestracyjne PMT mogą być wykonane na zamówienie lub są dostępne w sprzedaży 11.

  1. Umieść naczynie pod PMT (ciepło generowane przez PMT usunie kondensację z szkiełka nakrywkowego) i zamknij komorę. Upewnij się, że komora jest w 100% szczelna pod względem świetlnym, ponieważ ciemny prąd PMT stosowanych do tkanek SCN jest bardzo niski (mniej niż 20 fotonów/min). PMT wykrywają nawet najsłabsze wycieki światła.
  2. Rozpocznij akwizycję danych za pomocą oprogramowania (na przykład LumiCycle; Actimetrics Inc., Wilmette, IL, USA). Liczba fotonów jest całkowana w odstępach 1-10 min, aby uzyskać wysoką rozdzielczość ekspresji genu/białka.
  3. Po zakończeniu rejestracji uzyskaną okołodobową ekspresję genu/białka można przeanalizować za pomocą odpowiedniego oprogramowania (Origin, OriginLab, Northampton, MA, USA; ClockLab, Actimetrics; LumiCycle, Actimetrics Inc; Chrono, Till Roenneberg, University of Munich, Munich, Germany), aby wyznaczyć fazę, okres (czas jednego cyklu) oraz amplitudę rytmu. Szczytowa ekspresja genu lub białka jest najczęściej wykorzystywana jako punkt odniesienia i definiowana jest jako najwyższa liczba fotonów w ciągu jednego cyklu. Dane można wygładzić przed analizą fazy, okresu i amplitudy, szczególnie jeśli stosunek sygnału do szumu jest niski. Linia bazowa czasami ulega zmianie i musi zostać odjęta przed przeprowadzeniem analiz.

6. Reprezentatywne wyniki:

Przedstawiamy tutaj oscylacyjną ekspresję PER2::LUC jako wskaźnik żywotności i stanu hodowanej tkanki. W optymalnych warunkach, jeżeli tkanka jest żywa, ekspresja PER2::LUC oscyluje w rytmie okołodobowym, co pokazano na rysunku 3. PER2 w SCN wykazuje maksymalną ekspresję zazwyczaj około 12-13 czasu Zeitgeber (gdzie ZT 12 oznacza wyłączenie światła w cyklu światło:ciemność 12:12 h). Im większy rozmiar żywej tkanki, tym wyższa jest liczba zliczonych fotonów. Jednakże rozmiar i grubość tkanki hodowanej organotypowo powinny być niewielkie, aby zachować jej żywotność, najlepiej nie większe niż 15 mm2 11 i nie grubsze niż 50 μm 7. SCN, jeśli zostanie wypreparowany zgodnie z opisem, zazwyczaj wykazuje liczbę fotonów w zakresie 10.0-40.00/min, jeżeli tkanka pochodzi od zwierzęcia homozygotycznego PER2::LUC. Amplituda oscylacji w organotypowych kulturach SCN jest zazwyczaj bardzo wysoka podczas pierwszego cyklu w porównaniu z cyklami następnymi. Nie jest do końca jasne, dlaczego pierwszy cykl charakteryzuje się tak wysoką amplitudą. Jednym z możliwych wyjaśnień jest fakt, że znaczna część komórek w tkance może obumrzeć krótko po początkowym cięciu i posadzeniu w hodowli, przez co nie wykorzystują one lucyferyny po pierwszym cyklu. Procedura cięcia może również powodować nadmierne pobudzenie, co mogłoby wzmocnić sygnał lucyferazy podczas pierwszego cyklu.

Rycina 3 przedstawia przebiegi luminescencji z przekrojów SCN i zawiera jeden przebieg (czerwony) uzyskany z przekroju, który początkowo nie był zdrowy. Martwe lub niezdrowe tkanki charakteryzują się niskimi poziomami bazowymi liczby fotonów. (Ponadto martwe tkanki często ulegają dysocjacji w naczyniu i nie mogą zostać usunięte z membrany w jednym kawałku).

Technika opisana w niniejszym raporcie może znaleźć zastosowanie w eksperymentach farmakologicznych. Rycina 4 przedstawia zapis z hodowli, którą traktowano między 1. a 2. dniem blokerem kanałów HCN (ZD728, 10 μM). Jak widać na rycinie oraz jak opublikowano wcześniej 15, bloker znacząco zredukował amplitudę oscylacji okołodobowych PER2; jednak po wypłukaniu zwykłą pożywką oscylacje powróciły, co dowodzi, że bloker wpłynął na zegar molekularny, lecz tkanka pozostała żywotna i zdrowa.

procedura pobierania przekrojów SCN; sekcja mózgu myszy; analiza anatomiczna; badanie jądra nadskrzyżowaniowego.
Rysunek 1. Procedura krojenia
A) Głowa uśpionej i zdekapitowanej myszy z usuniętymi oczami i skórą. B) Czaszkę usuwa się za pomocą mikrokleszczyków do kostek. Podczas korzystania z narzędzia należy pracować w kierunku góry i nigdy nie naciskać narzędziem na mózg. C) Mózg przedstawiony odwrócony (stroną brzuszna do góry) bez opuszki węchowych. Widoczny jest biały skrzyżowanie wzrokowe z dwoma nienaruszonymi nerwami wzrokowymi. Jądro nadskrzyżowaniowe (SCN, granice zaznaczone na czerwono) znajduje się blisko skrzyżowania wzrokowego. D) Mózg przecięty w płaszczyźnie czołowej, zamocowany na platformie vibroslicera na poziomie SCN. E) Przekrój mózgu w płaszczyźnie czołowej (250 μm (gruba) zawierająca skrzyżowanie wzrokowe (OC), trzecią komorę (3V) oraz obustronne jądra nadoczno-podwzgórzowe (SCN).

Konfiguracja organotypowej hodowli tkankowej; widok eksplantu oraz naczyń do wzrostu i analizy in vitro.
Rysunek 2. Organotypowe hodowle tkankowe.
A) Dwa jednostronne jądra SCN (wstawka) wypreparowane z przedstawionego skrawka. B) Naczynie hodowlane (szalka Petriego 35 mm) z membraną hodowlaną, pożywką i eksplantem, ale bez smaru próżniowego i szkiełka zakrywowego. Pożywka (1,2 ml) widoczna jest jako ciecz pomiędzy naczyniem a membraną. Na membranie hodowlanej umieszczono jedno jednostronne jądro nadskrzyżowalne (SCN). Najbielsza część niewielkiego fragmentu tkanki to fragment skrzyżowania wzrokowego (wstawka). C) Szalka hodowlana z membraną i tkanką SCN, uszczelniona smarem próżniowym i okryta okrągłym szkiełkiem nakrywką.

Wykres bioluminescencji; porównanie stanu zdrowia; linie czarna, czerwona, niebieska; dni vs. liczba impulsów/min.
Rysunek 3. Rejestracje bioluminescencji z hodutek tkankowych jądra nadskrzyżowaniowego (SCN) zdrowych i niezdrowych.
Przykłady zapisów bioluminescencji ekspresji PERIOD2::LUCIFERASE (PER2::LUC) w skrawkach jąder nadskrzyżowaniowych (SCN) uzyskanych od myszy utrzymywanych w 12-godzinnym cyklu światło:ciemność. Białko PER2::LUC oscyluje z dobową zmiennością (~24 h), w której maksymalna ekspresja białka występuje w czasie Zeitgeber (ZT) 12–13. Zatem faza rytmu genowego zależy od harmonogramu cyklu światło:ciemność, w którym zwierzę było utrzymywane przed ubojem. Typowo bioluminescencja z jednostronnych tkanek SCN wypreparowanych zgodnie z opisem w protokole wykazuje liczbę fotonów w przedziale od ~10 0 do 40 0/minutę. Rysunek przedstawia przebiegi z jednej zdrowej kultury SCN (czarny), jednej niezdrowej kultury SCN (czerwony) oraz jednej kultury SCN, która wyschła (niebieski) po otwarciu szczelnej szalki hodowlanej w 4. dniu i nieprawidłowym ponownym zamknięciu naczynia (wskazane strzałką).

Wykres bioluminescencji w funkcji dni; piki danych wskazujące na wyniki eksperymentalne w okresie 10 dni.
Rycina 4. Rejestracja bioluminescencji podczas i po ekspozycji na lek.
ekspresja PER2::LUC w hodowli przed, w trakcie i po działaniu blokera kanałów HCN (ZD7288, 10 μM). Pierwsza strzałka wskazuje moment dodania blokera. Druga strzałka wskazuje wypłukiwanie, które wykonano poprzez zastąpienie medium zawierającego lek medium kontrolnym. Zwrócono uwagę na zmniejszoną amplitudę po 2 dniach ekspozycji na lek, brak oscylacji w 4. dniu oraz szybki powrót rytmu białka po wypłukiwaniu.

Dyskusja

Zalety i wady technologii raportowej opartej na lucyferazie

W przeciwieństwie do metod ex vivo, takich jak RT-PCR, hybrydyzacja in situ i Western blot, które wymagają pobierania próbek tkankowych w wielu różnych punktach czasowych (co daje niską rozdzielczość czasową, zazwyczaj 2-4 h w zależności od częstotliwości pobierania), w celu badania dobowych zmian w ekspresji genów i białek, technologia reporterowa lucyferazy umożliwia badania oscylacji okołodobowych o wysokiej rozdzielczości (1-10 min) przez wiele dni w tej samej preparacji. Dzięki temu zminimalizowano liczbę wykorzystywanych zwierząt i możliwe są szczegółowe badania wpływu na fazę i okres rytmu, co zazwyczaj nie jest osiągalne przy użyciu konwencjonalnych technik pobierania próbek o niskiej rozdzielczości czasowej. Należy jednak podkreślić, że mimo możliwości pomiaru względnej amplitudy rytmu, technologia reporterowa nie jest ilościowa, a zatem nie może być stosowana do pomiaru ilości transkrybowanych genów lub translowanych białek.

Rejestrację sygnałów z tkanki można rozpocząć i analizować natychmiast po hodowli, co stanowi ogromną zaletę przy bezpośrednim badaniu molekularnych efektów stresu in vivo, przesunięć fazy indukowanych światłem in vivo itp. Organotypowa hodowla SCN umożliwia długoterminową (trwającą tygodnie) manipulację farmakologiczną tkanką dorosłego mózgu zawierającą nienaruszoną, dojrzałą sieć synaptyczną, a technologia reporterowa oparta na lucyferazie pozwala na stabilne pomiary przez wiele tygodni. Dzięki temu tkanka nie musi pochodzić z okresu neonatalnego lub wczesnopostnatalnego, aby uzyskać zdrowe hodowle, a w przeciwieństwie do ostrych przekrojów, możliwe jest prowadzenie przewlekłych terapii farmakologicznych. W przeciwieństwie do transfekcji plazmidowych reporterów w hodowlach komórkowych, które nie prowadzą do wbudowania DNA w genom, transgeniczne modele zwierzęce z lucyferazą (podobnie jak transfekcje lentiwirusowe) są korzystne w przypadku badania zmian epigenetycznych. W tym kontekście należy również wspomnieć, że obrazowanie luminescencyjne jest obecnie możliwe dzięki wysokoczułym kamerom CCD 11, co pozwala na rejestrację sygnałów nawet z pojedynczych neuronów SCN (~ 6-10 μm) i innych typów komórek, co jest wykorzystywane przez główne laboratoria badające rytmy okołodobowe. Wreszcie, wielu badaczy rytmów okołodobowych powszechnie stosuje monitorowanie ekspresji molekularnej przy użyciu innych reporterów, takich jak zielone białko fluorescencyjne (GFP), w celu badania oscylacji genów/białek zegarowych 16-19.

Kwestie dotyczące grubości przekroju

Rekomendowana tutaj grubość przekroju SCN (200-300 μm) może zostać zmniejszona lub zwiększona w zależności od potrzeb. Jednak mimo że tkanka spłaszcza się na membranie po kilku dniach hodowli, nie zaleca się przekraczania grubości 500 μm początkowo wyciętego przekroju, aby zachować żywotność tkanki 7. Przekrój o grubości mniejszej niż 100 μm jest ze względów mechanicznych i praktycznych trudny w obsłudze. Ponieważ tkanka SCN jest heterogeniczna, grubość przekroju może wpływać na fazę sygnału wyjściowego lucyferazy, ponieważ różne obszary w obrębie SCN (na przykład „rdzeń” w przeciwieństwie do „otoczki” oraz obszary grzbietowe w przeciwieństwie do brzusznych) oscylują z różnymi fazami 20 i różnie resynchronizują się po przesunięciach fazowych 21. Grubość przekroju wpływa również na poziom bazowy liczby fotonów, ponieważ większa ilość tkanki emituje większą liczbę fotonów. W ten sposób amplituda oscylacji molekularnych może być pośrednio zależna od wielkości eksplantu. Z tych powodów hodowle kontrolne i traktowane powinny zawsze mieć ten sam rozmiar, grubość i zawierać ten sam obszar SCN, aby oscylowały w tej samej fazie i z tą samą amplitudą. Z kolei dwa jednostronne jądra oscylują w fazie względem siebie i z podobnymi amplitudami, pod warunkiem że cięcie wibratomem jest poziome, a nie pod kątem (co z kolei zależy od tego, czy cięcie separacyjne między móżdżkiem a obiema półkulami jest prostopadłe do powierzchni stołu). Badacz przeprowadzający hodowle SCN może zauważyć, że hodowle SCN nie oscylują w fazie względem siebie. Praktyka i standaryzacja techniki cięcia, t.o. zawsze wycinanie przekrojów na tym samym poziomie rostro-kaudalnym SCN, poprawią końcowy wynik.

Kluczowe etapy

  1. Dostawa tlenu jest krytyczna.
    Ponieważ mózg wymaga dużej ilości tlenu 22, procedura krojenia musi być szybka (im bardziej czas trwania kroków 3.1-3.10 zbliża się do ~5-6 minut, tym lepiej dla zachowania zdrowia tkanki).
  2. SCN jest wrażliwe na zmiany temperatury i wymianę medium.
    SCN jest wrażliwe na temperaturę, a duże zmiany temperatury mogą spowodować przesunięcie fazy rozrusznika i wywołać artefakty eksperymentalne 23. Jeśli podczas trwającego eksperymentu wymieniane są lub dodawane media bądź roztwory, na przykład podczas podawania leku po kilku dniach hodowli, medium lub roztwór musi zostać uprzednio podgrzany do 36-37°C (tej samej temperatury, co w komorze) przed dodaniem. W eksperymentach farmakologicznych obejmujących wymiany mediów ważne jest, aby zawsze pracować z uprzednio kondycjonowanym medium do hodowli komórkowej. Dodanie lub wypłukanie świeżym, niekondycjonowanym medium może potencjalnie przesunąć fazę molekularnego rytmu SCN 24, jak i rytmów w hodowlach innych typów komórek 25.
  3. Skład medium.
    Ważne jest, aby hodować tkankę przy prawidłowym pH i osmolalności. Medium buforowane powietrzem zawiera dużą ilość HEPES, który ma optymalną pojemność buforową w zakresie pH 6.8-8.2 i nadaje się również do buforowania zmian pH, które mogą wystąpić w wyniku oddychania komórkowego. HEPES z kolei jest bardziej wrażliwy na zmiany temperatury w porównaniu z wodorowęglanem sodu, który jest zawarty w niewielkich ilościach w medium hodowlanym. Wodorowęglan sodu ma większą pojemność buforową w niższym zakresie pH (5.1-7.1) 26, przez co jest odpowiedni w atmosferze CO2. Jednak zwiększenie ilości wodorowęglanu sodu w medium buforowanym powietrzem (DMEM 2902) znacząco zwiększa osmolalność i nie może być dodawane bez jednoczesnego rozcieńczania medium, co z kolei prowadzi do nieprawidłowego składu aminokwasów, witamin i jonów.
    Wskazówki dotyczące przygotowania medium:
    1. Należy być precyzyjnym i ostrożnym podczas mieszania medium.
    2. Należy używać tylko świeżych lub świeżo rozmrożonych roztworów stokowych.
    3. W przypadku bardzo wysokiej osmolalności nie warto rozcieńczać medium. Medium rozcieńczone o więcej niż 5-6% najprawdopodobniej nie będzie działać. W przypadku zbyt niskiej osmolalności należy użyć D-glukozy, aby ją zwiększyć.
  4. Przesunięcia fazy wynikające z czasu przygotowania
    Czas przygotowania skrawka jest krytyczny. Zerowy lub minimalny wpływ na fazę uzyskuje się, jeśli procedura krojenia jest przeprowadzana między ZT 6-12 12. Wszystkie sekcje skrawków powinny być wykonywane w tej samej fazie cyklu dobowego lub okołodobowego, aby zminimalizować błąd wynikający z różnic w fazie między preparatami.

Możliwe modyfikacje

  1. W przypadku ostrej elektrofizjologii SCN, przygotowanie przekrojów musi odbywać się w buforze Ringera (Sztuczny Płyn Mózgowo-Rdzeniowy; ACSF), nasyconym tlenem (95% O2, 5% CO2) przed rozpoczęciem procesu cięcia. Ponadto tlen musi być stale dostarczany do buforu przez całą procedurę przygotowywania przekrojów, ponieważ aktywność elektryczna i synaptyczna jest bezpośrednio zależna od dostaw tlenu 22.
  2. Z SCN można również z powodzeniem przygotować i hodować przekroje poziome oraz strzałkowe. Autorzy posiadają doświadczenie w rejestracji lucyferazy w przekrojach poziomych, które według naszych obserwacji wykazują oscylacje okołodobowe o niższej amplitudzie w porównaniu do cięć czołowych.
  3. SCN ma długość około 1 mm w osi rostro-kaudalnej, a opisana tutaj technika cięcia jest ukierunkowana na uzyskanie sekcji SCN z regionu centralnego. Niemniej jednak z mózgów myszy i szczurów można uzyskać więcej niż jedną sekcję SCN, co pozwala na badanie ekspresji genów/białek okołodobowych na poziomach bardziej rostralnych i kaudalnych jądra SCN.
  4. Można również przygotować hodowle z przekrojów młodych zwierząt, szczeniąt urodzonych po okresie prenatalnym, a nawet embrionów. Należy pamiętać, że mózg i czaszka bardzo młodych szczeniąt są bardzo miękkie i wrażliwe. Ponadto nerw wzrokowy jest cienki i nie w pełni rozwinięty. Należy zachować ostrożność podczas preparowania mózgu szczeniąt, aby nie uszkodzić obszaru SCN. Na przykład mikro-kleszczyków kostnych nie można stosować do otwierania czaszki szczeniąt myszy, ponieważ są one zbyt duże. Do przecięcia miękkich tkanek u młodych szczeniąt wystarczają precyzyjne nożyczki.
  5. Opisana tutaj technika hodowli na szkiełkach podstawowych może być również wykorzystana do obrazowania luminescencji przy użyciu kamery CCD/EM-CCD, w tym w pojedynczych neuronach SCN.
  6. Inne regiony ośrodkowego układu nerwowego oraz tkanki narządów obwodowych od zwierząt transgenicznych PER2::LUC mogą być łatwo pozyskiwane, hodowane i analizowane pod kątem oscylacji molekularnych, ponieważ ekspresja PER2::LUC oscyluje przez wiele dni również w wielu innych tkankach i typach komórek 10. Większość tych tkanek obwodowych, na przykład wątroba, nie wymaga membrany do przeżycia, lecz są hodowane poprzez bezpośrednią kąpiel w medium 11. Proszę pamiętać, że przesunięcie fazy wynikające z sekcjonowania, hodowli i wymiany medium może nie przebiegać zgodnie z tymi samymi zasadami, co w przypadku SCN.

Znaczenie

W transgenicznych szczepach myszy i szczurów (mPER2::LUC; mPer1-luc 8, 10, 27) aktywność enzymu lucyferazy odzwierciedla rytmy ekspresji białek lub genów i może być oceniana za pomocą rejestracji bioluminescencji. Bioluminescencja generowana przez lucyferazę daje słaby sygnał, ale luminescencja tła jest bliska zeru, co czyni tę metodę korzystną. Ponadto, ponieważ cząsteczka lucyferazy jest niestabilna i ulega szybkiej degradacji, nie występuje fototoksyczność, która może pojawić się podczas długotrwałego naświetlania pobudzającego 28. Sumarycznie właściwości te pozwalają na prowadzenie długofalowych eksperymentów, co sprawia, że technologia reporterowa oparta na lucyferazie jest bardzo korzystna w badaniach nad rytmami okołodobowymi.

Oświadczenia

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Niniejsza praca była finansowana przez Szwedzką Radę Badań Medycznych (K2009-75SX-21028-01-3, K2008-61X-20700-01-3); FONCICYT 000000000091984; fundacje Jeansson, Söderström Königska sjukhemmet, Märtha Lundqvist oraz Sigurd och Elsa Goljes Minne; a także Szwedzkie Towarzystwo Medyczne SLS-95151. Wyrażamy wdzięczność profesorowi Gene D. Blockowi z UCLA za cenne uwagi do manuskryptu. Dziękujemy dr. Michaelowi Andängowi i dr Helenie Johard za dostarczenie blokera kanałów HCN oraz prof. Abdelowi El-Manira za udostępnienie mikroskopu wideo.

Kwestie etyczne:

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi i przepisami ustalonymi przez Karolinska Institutet oraz „Stockholm's Norra Djurförsöksetiska Nämnd”. Wszystkie doświadczenia na zwierzętach są przeprowadzane z zamiarem zminimalizowania wszelkiego możliwego stresu lub dyskomfortu zwierzęcia.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Suplement B27 50xInvitrogen17504-044
Szkiełka coverglassMenzel-Glaser40#1≈ 40 mm
Membrany hodowlaneEMD MilliporePICMORG500.4 μm
DMEM z niską zawartością glukozy bez czerwieni fenolowejSigma-AldrichD2902Proszek na 1L
Papier filtracyjnyWhatman, GE Healthcare1003 055≈ 55 mm
Zestaw do filtracjiCorning431097Wielkość porów 0.22 μm, polietersulfon
PęsetaAllgaier Instrumente0203-7-PSDumant #7
HEPESInvitrogen15630-056100 ml
HBSS 10xInvitrogen14065-049500 ml
NaOCH3 7.5%Invitrogen25080-06050 ml
LucyferynaPromega Corp.E1602Lucyferyna świetlikowa, sól potasowa
Mikro-kumer krawędziowyAllgaier Instrumente332-097-140
PenStrep 10 000 U/mlInvitrogen15140-122100 ml
Szalki PetriegoCorning430165≈ 35 mm
PMTHamamatsu Corp.H9319-11MOD
Skalpele jednorazoweParagonP503Rozmiar 11
Filtr próżniowyFisher Scientific09-761-5
Smar próżniowyDow Corning50 g
WibrotomCampden Instruments

Bibliografia

  1. Welsh, D. K., Takahashi, J. S., Kay, S. A. Suprachiasmatic nucleus: cell autonomy and network properties. Annu Rev Physiol. 72, 551-577 (2010).
  2. Green, D. J., Gillette, R. Circadian rhythm of firing rate recorded from single cells in the rat suprachiasmatic brain slice. Brain Res. 245, 198-200 (1982).
  3. Shibata, S., Oomura, Y., Kita, H., Hattori, K. Circadian rhythmic changes of neuronal activity in the suprachiasmatic nucleus of the rat hypothalamic slice. Brain Res. 247, 154-158 (1982).
  4. Groos, G., Hendriks, J. Circadian rhythms in electrical discharge of rat suprachiasmatic neurones recorded in vitro. Neurosci Lett. 34, 283-288 (1982).
  5. Klein, D., Moore, R., Reppert, S. The suprachiasmatic nucleus and the circadian timing system. Suprachiasmatic nucleus--The mind's clock. , Oxford University Press. New York. 13-15 (1991).
  6. Pol, A. N. V. anden The hypothalamic suprachiasmatic nucleus of rat: intrinsic anatomy. J Comp Neurol. 191, 661-702 (1980).
  7. Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).
  8. Yamazaki, S., Numano, R., Abe, M., Hida, A., Takahashi, R., Ueda, M., Block, G. D., Sakaki, Y., Menaker, M., Tei, H. Resetting central and peripheral circadian oscillators in transgenic rats. Science. 288, 682-685 (2000).
  9. Geusz, M. E., Fletcher, C., Block, G. D., Straume, M., Copeland, N. G., Jenkins, N. A., Kay, S. A., RN, D. ay Long-term monitoring of circadian rhythms in c-fos gene expression from suprachiasmatic nucleus cultures. Curr Biol. 7, 758-766 (1997).
  10. Ko, C. H., Buhr, E. D., Siepka, S. M., Hong, H. K., Oh, W. J., Yoo, O. J., Menaker, M., Takahashi, J. S. PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 5339-5346 (2004).
  11. Yamazaki, S., Takahashi, J. S. Real-time luminescence reporting of circadian gene expression in mammals. Methods Enzymol. 393, 288-301 (2005).
  12. Yoshikawa, T., Yamazaki, S., Menaker, M. Effects of preparation time on phase of cultured tissues reveal complexity of circadian organization. J Biol Rhythms. 20, 500-512 (2005).
  13. Franklin, K. B. J., Paxinos, G. The mouse brain in stereotaxic coordinates. , Academic Press. (1997).
  14. Paxinos, G., Watson, C. The rat brain in stereotaxic coordinates. , 4 Edition, Academic Press. San Diego. (1998).
  15. O'Neill, J. S., Maywood, E. S., Chesham, J. E., Takahashi, J. S., Hastings, M. H. cAMP-dependent signaling as a core component of the mammalian circadian pacemaker. Science. 320, 949-953 (2008).
  16. Hughes, A. T., Guilding, C., Lennox, L., Samuels, R. E., McMahon, D. G., Piggins, H. D. Live imaging of altered period1 expression in the suprachiasmatic nuclei of Vipr2-/- mice. J Neurochem. 106, 1646-1657 (2008).
  17. Zhang, D. Q., Zhou, T., Ruan, G. X., McMahon, D. G. Circadian rhythm of Period1 clock gene expression in NOS amacrine cells of the mouse retina. Brain Res. 1050, 101-109 (2005).
  18. Quintero, J. E., Kuhlman, S. J., McMahon, D. G. The biological clock nucleus: a multiphasic oscillator network regulated by light. J Neurosci. 23, 8070-8076 (2003).
  19. LeSauter, J., Yan, L., Vishnubhotla, B., Quintero, J. E., Kuhlman, S. J., McMahon, D. G., Silver, R. A short half-life GFP mouse model for analysis of suprachiasmatic nucleus organization. Brain Res. 964, 279-287 (2003).
  20. Nakamura, W., Yamazaki, S., Takasu, N. N., Mishima, K., Block, G. D. Differential response of Period 1 expression within the suprachiasmatic nucleus. J Neurosci. 25, 5481-5487 (2005).
  21. Davidson, A. J., Yamazaki, S., Arble, D. M., Menaker, M., Block, G. D. Resetting of central and peripheral circadian oscillators in aged rats. Neurobiol Aging. 29, 471-477 (2008).
  22. Croning, M. D., Haddad, G. G. Comparison of brain slice chamber designs for investigations of oxygen deprivation in vitro. J Neurosci Methods. 81, 103-111 (1998).
  23. Burgoon, P. W., Boulant, J. A. Temperature-sensitive properties of rat suprachiasmatic nucleus neurons. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 281, 706-715 (2001).
  24. Nishide, S. Y., Honma, S., Honma, K. The circadian pacemaker in the cultured suprachiasmatic nucleus from pup mice is highly sensitive to external perturbation. Eur J Neurosci. 27, 2686-2690 (2008).
  25. Yoshikawa, T., Sellix, M., Pezuk, P., Menaker, M. Timing of the ovarian circadian clock is regulated by gonadotropins. Endocrinology. 150, 4338-4347 (2009).
  26. Kohn, R. A., Dunlap, T. F. Calculation of the buffering capacity of bicarbonate in the rumen and in vitro. J Anim Sci. 76, 1702-1709 (1998).
  27. Wilsbacher, L. D., Yamazaki, S., Herzog, E. D., Song, E. J., Radcliffe, L. A., Abe, M., Block, G., Spitznagel, E., Menaker, M., Takahashi, J. S. Photic and circadian expression of luciferase in mPeriod1-luc transgenic mice in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 489-494 (2002).
  28. Sellix, M. T., Currie, J., Menaker, M., Wijnen, H. Fluorescence/luminescence circadian imaging of complex tissues at single-cell resolution. J Biol Rhythms. 25, 228-232 (2010).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Organotypowa hodowla tkanekprzygotowanie skrawk w m zgumyszy PER2 LUCIFERASEpomiar bioluminescencjianaliza rytmu oko odobowegodetekcja za pomoc fotopowielaczahodowla tkanek na membranach
Przygotowanie skrawków, organotypowe hodowanie tkanek i rejestracja aktywności genów zegarowych za pomocą lucyferazy w jądrze nadskrzyżowaniowym
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.