Zapisy postsynaptyczne w dendrytach aferentnych kontaktujących się z wewnętrznymi komórkami rzęsatymi ślimaka: monitorowanie uwalniania wielopęcherzykowego w synapsie wstęgowej

Podsumowanie

Nagrania z całych komórek z dendrytów włókien nerwowych słuchowych w wewnętrznej synapsie wstęgi komórek rzęsatych w ślimaku ssaków.

Streszczenie

Synapsa aferentna między wewnętrzną komórką rzęsatą (IHC) a włóknem nerwu słuchowego stanowi elektrofizjologicznie dostępne miejsce do rejestrowania aktywności postsynaptycznej pojedynczej synapsy wstęgowej ^1-4. Synapsy wstęgowe komórek czuciowych uwalniają neuroprzekaźnik w sposób ciągły, którego szybkość jest modulowana w odpowiedzi na stopniowane zmiany potencjału błonowego IHC ⁵. Wykazano, że synapsy wstęgowe działają na zasadzie uwalniania wielopęcherzykowego, w którym wiele pęcherzyków może być uwalnianych jednocześnie, aby wywołać pobudzające prądy postsynaptyczne (EPSC) o różnych amplitudach ^{1, 4, 6-11}. Ani rola wstęgi presynaptycznej, ani mechanizm leżący u podstaw uwalniania wielopęcherzykowego nie są obecnie dobrze poznane.

IHC jest unerwione przez 10-20 słuchowych włókien nerwowych, a każde włókno styka się z IHC niezmielinizowanym pojedynczym końcem, tworząc pojedynczą synapsę wstęgową. Niewielki rozmiar aferentnych boutonów stykających się z IHC (o średnicy około 1 μm) umożliwia wykonywanie nagrań o wyjątkowej rozdzielczości czasowej. Co więcej, technikę tę można dostosować do jednoczesnego rejestrowania zarówno z komórek presynaptycznych, jak i postsynaptycznych, co pozwala na bezpośrednie badanie funkcji transferu w synapsie ². Metoda ta zapewnia zatem środki, za pomocą których można badać podstawowe aspekty neuroprzekaźnictwa, od uwalniania wielopęcherzykowego po nieuchwytną funkcję wstążki w komórkach czuciowych.

Protokół

1. Rozwiązania

1. Rozwiązania można przygotować z wyprzedzeniem. Roztwory zewnątrzkomórkowe można przechowywać w temperaturze 4°C przez okres do jednego miesiąca. Podwielokrotności roztworu wewnętrznego można przechowywać w stanie zamrożonym (-20°C). Upewnij się, że roztwory mają temperaturę pokojową przed rozpoczęciem eksperymentów.
2. Roztwór preparacyjny i zewnątrzkomórkowy roztwór zapisowy (mM): 5,8 KCl; 144 NaCl; 0,9 MgCl₂; 1,3 CaCl₂; 0,7 NaH₂PO₄; 5,6 glukozy; 10 HEPES; 1 Na pirogronian, pH 7,4 (NaOH), 300 mOsm. W przypadku izolacji prądowej IHC Ca²⁺ roztwór zewnątrzkomórkowy można modyfikować zgodnie ze wskazaniami: 5,8 KCl; 114 NaCl; 0,9 MgCl₂; 1,3 CaCl₂; 0,7 NaH₂PO₄; 5,6 glukozy; 10 HEPES; 30 HERBATA Cl; pH 7,4 (NaOH); 300 mOsm.
3. Do roztworu zewnątrzkomórkowego można dodać tetrodotoksynę 1-2 μM (TTX) w celu zablokowania kanałów sodowych bramkowanych napięciem i wyizolowania pobudzających prądów lub potencjałów postsynaptycznych (EPSC lub EPSP).
4. Wewnątrzkomórkowy roztwór zapisowy (mM): 20 KCl; 110 K-metanosulfonian; 5 MgCl₂; 0,1 CaCl₂; 5 EGTA; 5 HEPES; 5 Na₂ATP; 0,3 Na₂GTP; 5 Na₂fosfokreatyna; pH 7,2 (KOH), 290 mOsm; lub 135 KCl; 3,5 MgCl₂; 0,1 CaCl₂; 5 EGTA; 5 HEPES; 4 Na₂ATP; 0,2 Na₂GTP; pH 7,2 (KOH), 290 mOsm. Roztwór wewnątrzkomórkowy do izolacji prądu IHC Ca²⁺: 135 CsMeSO3; 13 HERBATA Cl; 3,5 MgCl₂; 2.5 na₂ATP; 1 EGTA; pH 7,2 (CsOH); 290 mOsm. Takie rozwiązanie zablokowałoby znaczną ilość znacznie większych przewodności K⁺, pozostawiając prąd Ca²⁺ w tyle.

2. Wykonywanie uchwytów do wypreparowanej tkanki

1. Zmodyfikowane szkiełka nakrywkowe służące do utrzymywania preparatu na miejscu podczas nagrań mogą być również przygotowane z wyprzedzeniem.
2. Nałóż kroplę Sylgard (Dow Corning, Midland, MI) w kierunku krawędzi okrągłego szklanego szkiełka nakrywkowego (8-12 mm). Umieść gruby koniec cienkiej szpilki do owadów (FST, nr art. 26002-10) na szkiełku nakrywkowym. Przytrzymaj mocno szpilkę przeciw owadom przy szkle za pomocą kleszczy i przytrzymaj w pobliżu rozgrzanej cewki, aby ustawić sylgard.

3. Tworzenie elektrod

1. Elektrody należy przygotowywać na świeżo w każdym dniu eksperymentu i przechowywać w hermetycznym pudełku. Wytwarzaj od dziesięciu do dwudziestu elektrod dla każdego preparatu.
2. Wybierz szkło elektrody, używamy kapilar ze szkła borokrzemianowego o średnicy 1 mm (1B100F-4 firmy WPI, Sarasota, FL).
3. Zaprojektuj program na ściągaczu wielostopniowym do wyciągania elektrod o średnicy końcówki około 2-3 μm (~ 6 MΩ w roztworach opisanych powyżej). Używamy wielostopniowego ściągacza poziomego Sutter P-87 lub ściągacza pionowego Narishige PC-10.
4. Ostrożnie pokryj trzpień elektrody Sylgardem jak najbliżej końcówki. Zmniejsza to pojemność pipet i minimalizuje szumy nagrywania.
5. Elektrody polerowane ogniowo za pomocą mikrokuźni z podgrzewanym żarnikiem, takim jak ta dostępna w WPI. Elektrody polerowane ogniowo powinny mieć zewnętrzną średnicę końcówki około 1 μm (10-15 MΩ w roztworach opisanych powyżej). Grubość ścianki pipety wynosi około 1/3 μm. Średnica zewnętrzna ma mniej więcej rozmiar aferentnego boutonu, który ma zostać załatany.
6. W przypadku realizacji nagrań symultanicznych: pipeta IHC powinna być skonstruowana w ten sam sposób (ta sama szklanka, ten sam program ciągnięcia), z tym zastrzeżeniem, że polerowanie ogniowe powinno pozostawić większą średnicę końcówki wynoszącą ~3 μm (6 - 8 MΩ).

4. Przygotowanie eksperymentu

1. Napełnij komory połączone z grawitacyjnym systemem perfuzyjnym roztworem zewnątrzkomórkowym i roztworami testowymi zawierającymi leki lub toksyny będące przedmiotem zainteresowania.
2. Ustaw perfuzję tak, aby objętość kąpieli wynosiła około 2 ml, stale perfuzjuj z szybkością rzędu 1,5 ml min-1.
3. Jeśli podczas eksperymentu mają być stosowane różne roztwory z miejscowym systemem perfuzji, należy napełnić zbiorniki roztworami. Przepuść roztwory przez system i upewnij się, że nie ma pęcherzyków powietrza.

5. Sekcja i przygotowanie próbki

1. Załączony film ilustruje sekcję narządu Cortiego u trzytygodniowych szczurów (Sprague Dawley, Charles River), która jest trudniejsza niż we wcześniejszych stadiach pourodzeniowych. W dyskusji omówiono zalety i wady nagrywania od szczurów w różnym wieku.
2. Głęboko znieczulić szczura przez inhalację izofluranu. Gdy odruchy odstawienia są nieobecne, a odruchy rogówkowe są poważnie obniżone, odetnij głowę. Procedury te zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Johnsa Hopkinsa.
3. Usuń pysk i skórę z odciętej głowy. Przetnij głowę na pół i usuń mózg, aby odsłonić kości skroniowe.
4. Usuń obie kości skroniowe i umieść w czystych naczyniach preparacyjnych zawierających standardowy roztwór zewnątrzkomórkowy.
5. Usunąć kość otaczającą kość skroniową tak, aby odsłonić ślimak. Trzymaj kość skroniową bezpiecznie u podstawy za pomocą kleszczy. Zidentyfikuj okrągłe i owalne okna. Ustaw ślimak tak, aby owalne okienko i spiralna strona ślimaka były skierowane do góry i usuń nadmiar kości wokół ślimaka.
6. Usuń kość otaczającą ślimak, aby odsłonić nabłonek czuciowy, zwracając uwagę na ochronę cewki wierzchołkowej, która zostanie wykorzystana w eksperymencie. Użyj drugiej pary cienkich kleszczy, aby odłupać kość bezpośrednio ze ślimaka, zaczynając od obszaru, który jest bardziej przezroczysty niż reszta kości. Tutaj kość jest cieńsza i łatwiejsza do usunięcia. Kontynuuj usuwanie kości z okolic cewki wierzchołkowej.
7. Użyj nożyczek do mikropreparowania, aby przeciąć modiolus pod zwojem wierzchołkowym. Następnie odłącz zwój wierzchołkowy od dolnych zwojów ślimaka.
8. W razie potrzeby ponownie użyj nożyczek do mikropreparowania, aby upewnić się, że skręt wierzchołkowy został całkowicie odcięty. Zadbaj o ochronę cewki wierzchołkowej; Nie należy go ciągnąć ani rozciągać. Użyj cienkich kleszczy, aby nakłonić skręt wierzchołkowy od reszty ślimaka.
9. Usuń resztę kości z obu stron zwoju wierzchołkowego.
10. Ostrożnie usuń prążki naczyniowe, błyszczący pasek tkanki znajdujący się poza obszarem komórek rzęsatych (Schemat 1). Upewnij się, że nie usuwasz czuciowych komórek rzęsatych, które mogą łatwo odłączyć się wraz z prążkowiem naczyniowym.
11. Użyj cienkich kleszczyków, aby odłączyć błonę tektorialną, błyszczącą, półprzezroczystą membranę, która znajduje się nad czuciowymi komórkami rzęsatymi.
12. Teraz przyciąć nadmiar tkanki i kości i spłaszczyć preparat za pomocą kleszczy. Jest to konieczne, aby tkankę można było równomiernie umieścić pod szpilką.
13. Preparat należy umieścić pod szpilką przymocowaną do szkiełka nakrywkowego (przygotowanego wcześniej), zwracając uwagę na to, aby umieścić szpilkę z dala od komórek włosa.
14. Użyj kleszczy, aby przenieść szkiełko nakrywkowe do komory nagraniowej. Upewnij się, że tkanka ślimaka jest całkowicie pokryta kroplą roztworu zewnątrzkomórkowego podczas przenoszenia szkiełka nakrywkowego. Mocno dociśnij szkiełko nakrywkowe do szklanego dna komory, aby upewnić się, że nie przesuwa się podczas nagrywania.
15. Natychmiast rozpocznij perfuzję roztworem zewnątrzkomórkowym, aby zapewnić lepsze przeżycie preparatu.

6. Nagrywanie

1. Zlokalizuj preparat przez okulary mikroskopu za pomocą obiektywów DIC z 10x i 40x zanurzeniem w wodzie. Ustawić przygotowanie w taki sposób, aby elektrody rejestrujące mogły zbliżać się do IHC prostopadle do bocznej ścianki IHC.
2. Jeśli preparat jest zwinięty na bok, co ogranicza widoczność obszaru podstawnego IHC, należy użyć elektrody rejestrującej, aby docisnąć zewnętrzną krawędź preparatu do szklanego szkiełka nakrywkowego, uważając, aby nie naciskać samych IHC.
3. * W przypadku stosowania młodych szczurów, na tym etapie grubą warstwę komórek podporowych nad komórkami rzęsatymi można usunąć za pomocą pipety czyszczącej (o średnicy końcówki ~ 10-20 μm), aby uzyskać dostęp do komórek czuciowych ^{1, 12}.
4. Użyj monitora, aby ocenić, czy tkanka jest zdrowa. Użycie obiektywu o 4-krotnym powiększeniu między mikroskopem a kamerą NC70 Newvicon dodatkowo powiększa obraz i wyświetla na monitorze obszar około 4800^μm2. Komórki rzęsate powinny być wydłużone z nienaruszonymi wiązkami włosów. Kiedy tkanka ulega zniszczeniu, komórki rzęsate pęcznieją i stają się bardziej przezroczyste i ziarniste.
5. Zlokalizuj aferentne buliony wokół podstawy IHC. Boutony są kuliste lub elipsoidalne, o średnicy około 1 μm i mają jasny kolor i błyszczący wygląd. Większość butonów zlokalizowana jest poniżej poziomu jądra. Kiedy tkanka jest niezdrowa, butony pęcznieją do około 4 razy większej niż normalnie i stają się przezroczyste, a nie błyszczące.
6. Napełnij elektrodę rejestrującą roztworem wewnątrzkomórkowym, zastosuj nadciśnienie i użyj mikromanipulatora, aby manewrować elektrodą do preparatu.
7. Wykonać nacięcie w preparacie na poziomie podstawy IHC za pomocą elektrody. Wepchnij elektrodę między cienką warstwę ogniw nośnych a IHC, używając nadciśnienia, aby wykuć drogę dostępu do obszaru u podstawy IHC. Ten krok jest "kluczowy" do dotarcia do doprowadzającego boutonu i do uniknięcia nagrywania z komórek nośnych, które szczelnie otaczają zakończenia aferentne.
8. Ostrożnie wyjmij elektrodę i zastąp ją świeżo napełnioną elektrodą.
9. Używając nadciśnienia w celu utrzymania czystej końcówki elektrody, przeprowadź elektrodę przez otwór dostępowy do membrany IHC. Dodatnie ciśnienie powinno pomóc w poruszaniu się wokół komórek nośnych otaczających IHC.
10. Przesuń elektrodę wokół sąsiednich ogniw nośnych w kierunku doprowadzającego boutonu (jak pokazano na załączonym filmie. Alternatywnym podejściem jest zbliżenie się do butonu aferentnego poprzez przesuwanie się wzdłuż membrany IHC, aż końcówka elektrody dotknie bulionu). Upewnij się, że końcówka elektrody znajduje się bezpośrednio przed doprowadzającym butonem (nadal istnieje niewielka przerwa między elektrodą a elektrodą ze względu na nadciśnienie na pipecie). Nieuleczalne opony stawiają większy opór ruchowi pipety niż ogniwa nośne i membrana IHC; Mogą być "wyczuwalne" przez eksperymentatora.
11. Przesuwaj pipetę w górę i w dół i dociśnij, aby upewnić się, że bouton się porusza. Oznacza to, że końcówka pipety i buton znajdują się w tej samej płaszczyźnie Z.
12. Trzymając elektrodę dociśniętą do doprowadzającego bultonu, jednocześnie zwolnij nadciśnienie i zastosuj ssanie, aby utworzyć uszczelnienie GΩ. Tworzenie się pieczęci GΩ na aferentnym butonie jest podobne do tworzenia się na komórce rzęsastej. Tworzenie się pieczęci może być szybkie lub może następować powoli.
13. Zastosuj delikatne impulsy ssania, aby rozerwać membranę w elektrodzie i wejść do konfiguracji zapisu całego ogniwa.
14. Jeśli załatane ogniwo jest doprowadzającym bulionem, małe pojemnościowe stany nieustalone pojawią się na impulsie kwadratu testowego monitorowanym podczas tworzenia uszczelnienia (patrz rysunek 1). Oszacowaliśmy pojemność końcówki aferentnej na 0,4 - 1,8 pF (patrz ^{3, 4}). Jeśli załatane ogniwo jest IHC, stany nieustalone będą rzędu 3-5 razy większe w zależności od oporu dostępu.
15. Aby potwierdzić, że ogniwo jest doprowadzającym bultonem, uruchom protokół z hiperpolaryzującymi i depolaryzującymi krokami napięcia. Relacje napięcia prądu (IV) dla światłowodów doprowadzających i IHC (często błędnie łatane podczas dążenia do doprowadzającego bultonu) są charakterystyczne dla poszczególnych typów ogniw i są pokazane na rysunku 2.
16. Monitoruj potencjał błony; dla światłowodu doprowadzającego jest to zwykle około -60 do -65 mV.
17. Jeśli ogniwo nie jest doprowadzającym bultonem, wyjmij elektrodę i powtórz kroki 8 - 13 ze świeżo napełnioną elektrodą. Używaj nowej elektrody przy każdej próbie.
18. Monitoruj rezystancję szeregową podczas całego nagrania, stosując kroki napięcia, aby upewnić się, że uszczelka się nie zamyka. Jeśli rezystancja szeregowa wzrasta, pomocne może być zastosowanie delikatnych impulsów ssania lub lekkie przesunięcie elektrody do tyłu. Rezystancje szeregowe wynoszą zwykle około 30 MΩ. Analizując aktywność synaptyczną, odrzucamy nagrania o rezystancjach szeregowych większych niż 50 MΩ.
19. Teraz można rejestrować aktywność synaptyczną (patrz rysunek 3). Albo włókno doprowadzające wykazuje spontaniczną aktywność, albo komórka rzęsata musi zostać zdepolaryzowana, aby aktywować uwalnianie przekaźnika. Zastosowanie roztworu zewnątrzkomórkowego o wyższym stężeniu potasu (na przykład 40 mM) spowoduje depolaryzację komórki rzęsatej i często aktywuje lub zwiększa szybkość uwalniania przekaźnika.
20. W przypadku jednoczesnych zapisów IHC i aferentnych boutonów ² procedurę należy zmodyfikować w następujący sposób: Przejdź przez kroki od 1 do 5. Napełnij pipetę IHC odpowiednim roztworem wewnątrzkomórkowym w celu odizolowania prądu Ca²⁺ i postępuj zgodnie z zaleceniami w punkcie 6. Pozostaw pipetę do zapisu IHC w "pozycji oczekującej" w pobliżu IHC, z którego ma być prowadzony zapis. Kontynuuj kroki od 6 do 14 dla nagrywania aferentnego. Gdy pipeta aferentna znajdzie się w konfiguracji pełnej komórki, kontynuuj korzystanie z pipety IHC. Manewruj drugą pipetą w kierunku bocznej ścianki odpowiedniego IHC, zawsze utrzymując dodatnie ciśnienie. IHC powinien wykazywać wgłębienie na ścianie bocznej za pomocą nacisku i należy upewnić się, że komórki nośne są od niego oddzielone. Kroki 12 - 13 można również zastosować do IHC. Jak wskazano w 14, w porównaniu z włóknem aferentnym, znakiem rozpoznawczym nagrania IHC, oprócz charakterystycznej relacji IV, są większe pojemnościowe stany nieustalone. Po ustanowieniu jednoczesnych zapisów należy pozostawić pewien czas (3 - 5 minut, w zależności od oporu serii) na wprowadzenie roztworów wewnątrzkomórkowych do IHC. Spowoduje to większe prądy Ca²⁺ ze względu na rosnący blok znacznie większych przewodności K⁺.
21. W celu wykonania luźnych nagrań zewnątrzkomórkowych, na etapie 12, zamiast wykonywać uszczelnienie GΩ, wykonaj luźne uszczelnienie o wartości około 30 do 50 MΩ na doprowadzającym bultonie. Można to osiągnąć poprzez zastosowanie mniejszego ssania przy jednoczesnym uwolnieniu nadciśnienia. Patrz rysunek 5, aby zapoznać się z przykładem zewnątrzkomórkowego zapisu z bulionu doprowadzającego szczura P21.

7. Rozwiązywanie problemów

1. Jeśli można utworzyć plomby uszczelniające, ale nie można osiągnąć przejścia od zapisu z podłączoną do całej komórki, wewnętrzna średnica pipety może być zbyt wąska.
2. Jeśli nie można utworzyć szczelnych uszczelnień, wewnętrzna średnica pipety może być zbyt duża i cały batuton może zostać zassany do elektrody.
3. Jeśli wszystkie zdarzenia synaptyczne są małe i jednolite, zapis może być zewnątrzkomórkowy w stosunku do aferentnego. Test na odwrócenie zdarzeń przy dodatnich potencjałach błonowych; Wewnątrzkomórkowo zarejestrowane EPSC odwrócą się przy dodatnich potencjałach.
4. Jeśli rezystancje szeregowe są stale wysokie podczas łatania końcówek aferentnych, spróbuj przesunąć pipetę do tyłu przed próbą przebicia się do całej konfiguracji celi. Pomaga to zapobiegać zatykaniu się pipet i zapewnia wysoki opór dostępu.
5. Nieustraszenie prawidłowe położenie pipety. Możliwe jest przesunięcie elektrody w celu zmniejszenia wysokiej rezystancji szeregowej lub zapychania pipety bez "gubienia" uszczelki na aferencie. Podczas jednoczesnego ustanawiania nagrania, IHC jest zwykle "popychany" w kierunku bulionu. Pozycję pipety aferentnej można odpowiednio skorygować.

8. Reprezentatywne wyniki

Rysunek 1. A-B. Typowe stany nieustalone rejestrowane ze światłowodu doprowadzającego (A) i IHC (B) w odpowiedzi na polecenie napięcia hiperpolaryzacyjnego 10 mV z napięcia podtrzymującego -94 mV. Ze względu na wąską średnicę pipety i wysoką rezystancję dostępu, zapis IHC (B) nie jest optymalny dla zapisu IHC całej komórki. Nagranie jest pokazane tutaj tylko w celu zilustrowania różnicy między pojemnościowymi stanami nieustalonymi z IHC a włóknami doprowadzającymi. Może to pomóc w rozróżnieniu typów komórek podczas tworzenia konfiguracji całej komórki. Pojemnościowe stany nieustalone całych komórek z IHC są rzędu 5 razy większe pod względem amplitudy niż te z włókien doprowadzających. C-D. Stany nieustalone z A i B pokazane w rozszerzonej skali czasowej. C. Zanik odpowiedzi aferentnej można dopasować do dwóch wykładników. Pojemność końcówki aferentnej oszacowano na podstawie składowej szybkiej.

Rysunek 2. IV relacje z aferentnego boutonu (A) i IHC (B). Zależności IV są rejestrowane od potencjału podtrzymania -84 mV z krokami napięcia od -124 mV do + 36 mV w krokach co 10 mV (napięcia znamionowe). Napięcia są pokazane po prawej stronie niektórych ścieżek. Zapisy te przeprowadzono przy 5,8 mM zewnątrzkomórkowym KCl w temperaturze pokojowej. Skala dla obu: 500 pA, 200 ms.
A. Relacje IV z włókna doprowadzającego w 19. dniu po urodzeniu. EPSC są obecne podczas większości kroków napięcia; EPSC odwracają wartość dodatnią do +6 mV. To nagranie zostało przeprowadzone w obecności TTX w celu zablokowania prądów bramkowanych napięciem Na⁺. Zwróć uwagę na powoli aktywujący się prąd wewnętrzny przy napięciach hiperpolaryzacyjnych (I_h). Prąd ten nie występuje w IHC ani ogniwach nośnych i stanowi dobrą wskazówkę, że zarejestrowana komórka jest włóknem doprowadzającym (patrz ³). B. IV relacje z P19 IHC. Ze względu na wąską średnicę pipety i wysoką rezystancję dostępu, zapis nie jest optymalny do charakteryzowania prądów IHC, a prądy są mniejsze niż oczekiwano. Zapis jest pokazany tutaj tylko w celu zademonstrowania relacji IV IHC i światłowodów doprowadzających można wyraźnie rozróżnić, gdy próbuje się zarejestrować światłowód doprowadzający. Zwróć uwagę na szybko aktywujące się prądy zewnętrzne K⁺ przy potencjałach dodatnich (strzałka), po których następują opóźnione prądy prostownika K^{+ 13}.

Rysunek 3. Przykładowe prądy synaptyczne zarejestrowane z włókna doprowadzającego w 21 dniu po urodzeniu w obecności 40 mM zewnątrzkomórkowego K⁺ w celu zwiększenia szybkości uwalniania z IHC. Temperatura pokojowa, z TTX zastosowanym do blokowania prądów Na⁺ bramkowanych napięciem. A. Skala 200 pA, 5 ms, zwróć uwagę na zmienny rozmiar i kształt EPSC. Szczegółowy opis charakterystyki EPSC znajduje się w ^{punkcie 4}. B. Dwa EPSC oznaczone w A (#: wielofazowe, o: jednofazowe) pokazane w rozszerzonej skali: Skala 100 pA, 1 ms.

Rysunek 4. Jednoczesne zarejestrowanie IHC i kontakt z aferentnym boutonem w wyciętym narządzie szczura Cortiego, 10 dnia po urodzeniu (patrz również ²). Krok napięcia depolaryzujący IHC prowokuje uwalnianie neuroprzekaźnika i aktywuje EPSC w doprowadzającym bultonie. Górny ślad: Protokół napięciowy dla depolaryzacji IHC. Potencjał trzymania: -79 mV, krok 50 ms do -29 mV. Środkowy ślad: Prądy Ca²⁺ typu L rejestrowane z IHC zazwyczaj wykazują niewielką inaktywację i aktywują się przy ujemnych potencjałach. Ślad dolny: Prądy synaptyczne we włóknie doprowadzającym w odpowiedzi na depolaryzację IHC. Zwróć uwagę na depresję synaptyczną podczas depolaryzacji IHC 50 ms.

Rysunek 5. A. Przykładowy zapis zewnątrzkomórkowy z napadu aferentnego w 21. dniu po urodzeniu. Zarejestrowano to w temperaturze pokojowej, przy 5,8 mM zewnątrzkomórkowym K⁺. To nagranie ma typowy stosunek sygnału do szumu dla nagrania w preparacie od trzytygodniowego szczura. B. Średni kształt fali dla zdarzeń zewnątrzkomórkowych zarejestrowanych z doprowadzającego bultonu P20. Jest to średni przebieg z 10272 zdarzeń.

Schemat 1. Przekrój poprzeczny ślimaka szczura przez jeden obrót, ilustrujący anatomiczny związek między wewnętrznymi i zewnętrznymi komórkami rzęsatymi, zwojami spiralnymi, prążkowiem naczyniowym i błoną tektorialną.

Dyskusja

Krytycznym krokiem w tej procedurze jest preparacja. Jeśli tkanka zostanie rozciągnięta lub uszkodzona podczas sekcji, włókna doprowadzające nie przetrwają. Tkanka młodszych szczurów jest bardziej elastyczna i wybaczająca. Okazuje się, że dni po porodzie od 10 do 11 są najłatwiejsze do przeanalizowania, a eksperymenty mają wyższe wskaźniki sukcesu. Znaczny stopień dojrzewania ślimaka następuje po urodzeniu, a szczury zaczynają słyszeć około ^12-14 dnia po urodzeniu. Dlatego w wieku, w którym rozwarstwienie jest najłatwiejsze, synapsy mogą nie być w pełni dojrzałe ⁴.

Opisana tutaj sekcja dla szczurów jest zasadniczo taka sama dla myszy, główna różnica polega na mniejszym rozmiarze ślimaka myszy. Technika ta pozwala na zbadanie właściwości synaps wstęgowych u myszy zmodyfikowanych transgenicznie ¹⁵. Dalsze modyfikacje tej techniki obejmują: dodanie barwnika fluorescencyjnego do roztworu wewnątrzkomórkowego w celu znakowania włókien ³; sparowane zapisy z presynaptyczną wewnętrzną komórką rzęsatą i postsynaptycznym aferentnym bulionem, co pozwala na określenie funkcji transferu między komórkami pre i postsynaptycznymi ² oraz luźno uszczelnione zapisy zewnątrzkomórkowe w aferentnych boutonach, aby uniknąć utraty integralności komórkowej. Konfiguracja zapisu zewnątrzkomórkowego jest łatwiejsza do osiągnięcia niż konfiguracja całej komórki, a eksperymenty są na ogół trwalsze.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Stół powietrzny	TMC
Gibraltar Stage ze stołem xy	Burleigh
Axioscope FS2 Optyka DIC Zielony filtr	Carl Zeiss, Inc.
Kamera Newvicon z kontrolerem	Dage
Monitor	Dage
Multiclamp 700B (lub podobny)	Urządzenia
Digidata 1322A (lub podobne)	Manipulator urządzeń
MP285	Sutter Instrument Co.
6-kanałowy system aplikacji zaworu do perfuzji miejscowej (używany z ręcznie robionymi pipetami perfuzyjnymi)	Warner Instruments
PC z oprogramowaniem do akwizycji (PClamp)	Molecular Devices
Powyżej znajduje się sprzęt w naszych zestawach elektrofizjologicznych używany do nagrywania z terminali aferentnych.