Rejestracje postsynaptyczne w dendrytach aferentnych kontaktujących się z wewnętrznymi komórkami rzęskowymi ślimaka: monitorowanie uwalniania wielopęcherzykowego w synapsie wstążkowej

Podsumowanie

Rejestracje metodą patch-clamp w konfiguracji whole-cell z dendrytów włókien nerwu słuchowego w obrębie synaps wstążkowych komórek rzęskowych wewnętrznych w ślimaku ssaków.

Streszczenie

Synapsa aferentna między wewnętrzną komórką rzęskową (IHC) a włóknem nerwu słuchowego stanowi miejsce dostępne elektrofizjologicznie do rejestracji aktywności postsynaptycznej pojedynczej synapsy wstążkowej ^1-4. Synapsy wstążkowe komórek sensorycznych uwalniają neurotransmiter w sposób ciągły, a szybkość tego procesu jest modulowana w odpowiedzi na stopniowe zmiany potencjału błony IHC ⁵. Wykazano, że synapsy wstążkowe funkcjonują poprzez uwalnianie wielopęcherzykowe, w którym wiele pęcherzyków może zostać uwolnionych jednocześnie, wywołując pobudzające prądy postsynaptyczne (EPSCs) o różnych amplitudach ^{1, 4, 6-11}. Ani rola presynaptycznej wstążki, ani mechanizm leżący u podstaw uwalniania wielopęcherzykowego nie są obecnie dobrze poznane.

Komórki wewnętrzne (IHC) są unerwione przez 10–20 włókien nerwu słuchowego, przy czym każde włókno kontaktuje się z IHC za pomocą jednego niezmielinizowanego zakończenia, tworząc pojedynczą synapsę wstążkową. Mały rozmiar guzków aferentnych kontaktujących się z IHC (około 1 μm średnicy) umożliwia wykonywanie pomiarów z wyjątkową rozdzielczością czasową. Ponadto technikę tę można dostosować do jednoczesnej rejestracji z komórek przed- i postsynaptycznych, co pozwala na bezpośrednie badanie funkcji przenoszenia w synapsie ². Metoda ta stanowi zatem narzędzie do badania podstawowych aspektów neurotransmisji, od uwalniania wielopęcherzykowego po nieuchwytną funkcję wstążki w komórkach sensorycznych.

Protokół

1. Roztwory

1. Roztwory można przygotować z wyprzedzeniem. Roztwory zewnątrzkomórkowe można przechowywać w 4°C do jednego miesiąca. Alikwoty roztworu wewnętrznego można przechowywać w zamrożeniu (-20°C). Przed rozpoczęciem eksperymentów należy upewnić się, że roztwory osiągnęły temperaturę pokojową.
2. Roztwór do sekcji i roztwór do rejestracji zewnątrzkomórkowej (mM): 5,8 KCl; 144 NaCl; 0,9 MgCl2₂; 1,3 CaCl2₂; 0,7 NaH₂PO₄; 5,6 glukozy; 10 HEPES; 1 pirogronianu sodu, pH 7,4 (NaOH), 300 mOsm. Do IHC Ca²⁺ w celu izolacji prądu roztwór zewnątrzkomórkowy można zmodyfikować w następujący sposób: 5,8 KCl; 114 NaCl; 0,9 MgCl₂; 1,3 CaCl2₂; 0,7 NaH₂PO₄; 5,6 glukozy; 10 HEPES; 30 TEA Cl; pH 7,4 (NaOH); 300 mOsm.
3. 1-2 μM do roztworu zewnątrzkomórkowego można dodać tetrodotoksynę (TTX), aby zablokować napięciowo zależne kanały sodowe i wyizolować pobudzające prądy lub potencjały postsynaptyczne (EPSCs lub EPSPs).
4. Roztwór do rejestracji wewnątrzkomórkowej (mM): 20 KCl; 110 metanosulfonian potasu; 5 MgCl2₂; 0,1 CaCl2₂; 5 EGTA; 5 HEPES; 5 Na₂ATP; 0,3 Na₂GTP; 5 Na₂fosfokreatyna; pH 7,2 (KOH), 290 mOsm; lub 135 KCl; 3,5 MgCl2₂; 0,1 CaCl2₂; 5 EGTA; 5 HEPES; 4 Na₂ATP; 0,2 Na₂GTP; pH 7,2 (KOH), 290 mOsm. Roztwór wewnątrzkomórkowy do IHC Ca²⁺ bieżąca izolacja: 135 CsMeSO3; 13 TEA Cl; 3,5 MgCl₂; 2,5 Na₂ATP; 1 EGTA; pH 7,2 (CsOH); 290 mOsm. Roztwór ten zablokowałby znaczną ilość znacznie większych K⁺ przewodności, z pominięciem Ca²⁺ pozostały prąd

2. Przygotowanie uchwytów dla wypreparowanej tkanki

1. Zmodyfikowane szkiełka nakrywkowe, używane do stabilizacji preparatu podczas pomiarów, mogą być również przygotowane z wyprzedzeniem.
2. Nanieś kroplę Sylgard (Dow Corning, Midland, MI) w pobliżu krawędzi okrągłego szkiełka nakrywkowego (8-12 mm). Umieść grubszy koniec cienkiej szpilki entomologicznej (FST, nr kat. 26002-10) na szkiełku. Mocno dociśnij szpilkę do szkła pęsetą i przytrzymaj w pobliżu rozgrzanej cewki, aby utwardzić Sylgard.

3. Wykonywanie elektrod

1. Przygotowuj elektrody na bieżąco w każdym dniu eksperymentalnym i przechowuj je w szczelnym pojemniku. Wykonaj od dziesięciu do dwudziestu elektrod na każdą serię preparatów.
2. Wybierz szkło do elektrod; stosujemy kapilary z borokrzemianu o średnicy 1 mm (1B100F-4 z WPI, Sarasota, FL).
3. Opracuj program w wielostopniowej wyciągaczkach, aby uzyskać elektrody o średnicy końcówki około 2-3 μm (~ 6 MΩ w opisanych powyżej roztworach). Stosujemy poziomą wyciągaczkę wielostopniową Sutter P-87 lub pionową wyciągaczkę Narishige PC-10.
4. Ostrożnie pokryj trzonek elektrody Sylgardem tak blisko końcówki, jak to możliwe. Zmniejsza to pojemność pipety i minimalizuje szumy rejestracji.
5. Wypoleruj elektrody ogniowo przy użyciu mikrokowadła z podgrzewanym włóknem, takim jak dostępne w WPI. Wypolerowane ogniowo elektrody powinny mieć zewnętrzną średnicę końcówki około 1 μm (10-15 MΩ w opisanych powyżej roztworach). Grubość ścianki pipety wynosi około 1/3 μm. Średnica zewnętrzna powinna odpowiadać wielkości Bouton afferentnego, który ma zostać poddany patch-clampowi.
6. W przypadku jednoczesnych rejestracji: pipetę IHC należy wykonać w ten sam sposób (to samo szkło, ten sam program wyciągania), z tą różnicą, że polerowanie ogniowe powinno pozostawić większą średnicę końcówki, wynoszącą ~ 3 μm (6 - 8 MΩ).

4. Przygotowanie eksperymentu

1. Napełnić komory połączone z grawitacyjnym systemem perfuzji roztworem zewnątrzkomórkowym oraz roztworami testowymi zawierającymi interesujące leki lub toksyny.
2. Ustawić perfuzję tak, aby objętość kąpieli wynosiła około 2 mL, i prowadzić stałą perfuzję z przepływem rzędu 1.5 mL min-1.
3. Jeśli podczas eksperymentu z wykorzystaniem lokalnego systemu perfuzji mają być stosowane różne roztwory, napełnić zbiorniki odpowiednimi roztworami. Przepuścić roztwory przez system i upewnić się, że nie ma w nim pęcherzyków powietrza.

5. Disekcja i przygotowanie próbek

1. Załączony film ilustruje sekcję narządu Cortiego u szczurów w wieku trzech tygodni (Sprague Dawley, Charles River), co jest trudniejsze niż w przypadku wcześniejszych etapów postnatalnych. Zalety i wady rejestracji u szczurów w różnym wieku zostaną omówione w dyskusji.
2. Głęboko znieczul szczura poprzez inhalację izofluranem. Gdy odruchy wycofania ustaną, a odruchy rogówkowe będą silnie zniesione, dokonaj dekapitacji. Procedury te zostały zatwierdzone przez Johns Hopkins University Animal Care and Use Committee.
3. Usuń pysk i skórę z odciętej głowy. Przeciąć głowę na pół i usunąć mózg, aby odsłonić kości skroniowe.
4. Usuń obie kości skroniowe i umieść je w czystych naczyniach sekcyjnych zawierających standardowy roztwór zewnątrzkomórkowy.
5. Usuń kość otaczającą kość skroniową, aby odsłonić ślimaka. Mocno przytrzymaj kość skroniową u podstawy pęsetą. Zidentyfikuj okno okrągłe i owalne. Zorientuj ślimaka tak, aby okno owalne i strona spiralna ślimaka były skierowane ku górze, a następnie usuń nadmiar kości wokół ślimaka.
6. Usuń kość otaczającą ślimaka, aby odsłonić nabłonek sensoryczny, dbając o ochronę zwoju szczytowego, który zostanie wykorzystany w eksperymencie. Użyj drugiej pary cienkich pęset, aby odłupać kość bezpośrednio ze ślimaka, zaczynając od obszaru, który jest bardziej przezroczysty niż reszta kości. W tym miejscu kość jest cieńsza i łatwiejsza do usunięcia. Kontynuuj usuwanie kości z okolic zwoju szczytowego.
7. Użyj nożyczek mikrosekcyjnych, aby przeciąć modiolus pod zwojem szczytowym. Następnie oddziel zwój szczytowy od niższych zwojów ślimaka.
8. W razie potrzeby ponownie użyj nożyczek mikrosekcyjnych, aby upewnić się, że zwój szczytowy został całkowicie odcięty. Należy uważać, aby nie uszkodzić zwoju szczytowego; nie wolno go ciągnąć ani rozciągać. Użyj cienkiej pęsety, aby delikatnie oddzielić zwój szczytowy od reszty ślimaka.
9. Usuń pozostałą kość z obu stron zwoju szczytowego.
10. Ostrożnie usuń stria vascularis, błyszczący pas tkanki znajdujący się na zewnątrz obszaru komórek rzęskowych (Schemat 1). Upewnij się, że nie usuniesz sensorycznych komórek rzęskowych, które mogą łatwo oddzielić się wraz ze stria vascularis.
11. Użyj cienkiej pęsety, aby oddzielić błonę otoklinową, błyszczącą, półprzezroczystą błonę znajdującą się nad sensorycznymi komórkami rzęskowymi.
12. Teraz przytnij nadmiar tkanki i kości oraz spłaszcz preparat pęsetą. Jest to konieczne, aby tkankę można było równomiernie umieścić pod pinuem.
13. Umieść preparat pod pinuem przymocowanym do szkiełka nakrywkowego (przygotowanego wcześniej), dbając o to, aby pin znajdował się z dala od komórek rzęskowych.
14. Użyj pęsety, aby przenieść szkiełko nakrywkowe do komory rejestracyjnej. Podczas przenoszenia szkiełka upewnij się, że tkanka ślimaka jest całkowicie przykryta kroplą roztworu zewnątrzkomórkowego. Mocno dociśnij szkiełko nakrywkowe do szklanego dna komory, aby upewnić się, że nie przesunie się ono podczas rejestracji.
15. Natychmiast rozpocznij perfuzję roztworem zewnątrzkomórkowym, aby zapewnić lepszą przeżywalność preparatu.

6. Rejestracja

1. Zlokalizuj preparat za pomocą okularów mikroskopu, korzystając z obiektywów DIC 10x i 40x z imersją w wodzie. Zorientuj preparat tak, aby elektrody rejestrujące mogły zbliżyć się do IHC prostopadle do ich ściany bocznej.
2. Jeśli preparat jest zwinięty, co ogranicza widoczność regionu podstawnego IHC, użyj elektrody rejestrującej, aby docisnąć zewnętrzną krawędź preparatu do szkiełka nakrywkowego, uważając, aby nie uciskać samych IHC.
3. * W przypadku młodych szczurów na tym etapie grubą warstwę komórek podporowych nad komórkami rzęskowymi można usunąć za pomocą pipety czyszczącej (o średnicy końcówki ok. 10-20 μm), aby uzyskać dostęp do komórek sensorycznych ^{1, 12}.
4. Użyj monitora, aby ocenić, czy tkanka jest zdrowa. Zastosowanie soczewki o powiększeniu 4X pomiędzy mikroskopem a kamerą NC70 Newvicon dodatkowo powiększa obraz i rzutuje na monitor obszar o wielkości około 4800 μm². Komórki rzęskowe powinny być wydłużone z nienaruszonymi wiązkami rzęsek. Gdy tkanka ulega degradacji, komórki rzęskowe pęcznieją, stają się bardziej przezroczyste i ziarniste.
5. Zlokalizuj boutony aferentne wokół podstawy IHC. Boutony są sferyczne lub elipsoidalne, mają około 1 μm średnicy, są jasne i mają błyszczący wygląd. Większość boutonów znajduje się poniżej poziomu jądra. Gdy tkanka jest niezdrowa, boutony pęcznieją do około 4 razy normalnej wielkości i stają się przezroczyste zamiast błyszczące.
6. Napełnij elektrodę rejestrującą roztworem wewnątrzkomórkowym, przyłóż nadciśnienie i za pomocą mikromanipulatora wprowadź elektrodę do preparatu.
7. Wykonaj nacięcie w preparacie na poziomie podstawy IHC za pomocą elektrody. Wprowadź elektrodę pomiędzy cienką warstwę komórek podporowych a IHC, używając nadciśnienia, aby wypracować drogę dostępu do obszaru u podstawy IHC. Ten krok jest kluczowy dla dotarcia do boutonu aferentnego i uniknięcia rejestracji z komórek podporowych, które ciasno otaczają zakończenia aferentne.
8. Ostrożnie wyjmij elektrodę i zastąp ją nowo napełnioną elektrodą.
9. Używając nadciśnienia w celu utrzymania czystości końcówki elektrody, wprowadź elektrodę przez otwór dostępowy do błony IHC. Nadciśnienie powinno pomóc w omijaniu komórek podporowych otaczających IHC.
10. Przesuń elektrodę wokół sąsiednich komórek podporowych w kierunku boutonu aferentnego (jak pokazano na towarzyszącym filmie. Alternatywnym podejściem jest zbliżenie się do boutonu aferentnego poprzez przesuwanie wzdłuż błony IHC, aż końcówka elektrody dotknie boutonu). Upewnij się, że końcówka elektrody znajduje się bezpośrednio przed boutonem aferentnym (ze względu na nadciśnienie w pipecie wciąż istnieje niewielka przerwa między boutonem a elektrodą). Boutony stawiają większy opór przesuwaniu pipety niż komórki podporowe i błona IHC; mogą być one „wyczute” przez eksperymentatora.
11. Przesuwaj pipetę w górę i w dół oraz dociskaj, aby upewnić się, że bouton się porusza. Wskazuje to, że końcówka pipety i bouton znajdują się w tej samej płaszczyźnie Z.
12. Przy elektrodzie dociśniętej do boutonu aferentnego jednocześnie zwolnij nadciśnienie i przyłóż ssanie, aby utworzyć uszczelnienie GΩ. Tworzenie uszczelnienia GΩ na boutonie aferentnym jest podobne do tego na komórce rzęskowej. Tworzenie uszczelnienia może być szybkie lub może zachodzić powoli.
13. Zastosuj delikatne impulsy ssania, aby przerwać błonę wewnątrz elektrody i przejść do konfiguracji rejestracji whole-cell.
14. Jeśli zapatchowana komórka jest boutonem aferentnym, na testowym impulsie prostokątnym monitorowanym podczas tworzenia uszczelnienia pojawią się niewielkie przejściowe prądy pojemnościowe (patrz Rysunek 1). Oszacowaliśmy pojemność zakończenia aferentnego na 0,4 - 1,8 pF (patrz ^{3, 4}). Jeśli zapatchowana komórka jest IHC, przejściowe prądy będą od 3 do 5 razy większe, w zależności od rezystancji dostępu.
15. Aby potwierdzić, że komórka jest boutonem aferentnym, przeprowadź protokół z hiperpolaryzującymi i depolaryzującymi skokami napięcia. Relacje prądowo-napięciowe (IV) dla włókien aferentnych i IHC (często błędnie patchowanych przy próbie dotarcia do boutonu aferentnego) są charakterystyczne dla poszczególnych typów komórek i przedstawione są na Rysunku 2.
16. Monitoruj potencjał błonowy; dla włókna aferentnego wynosi on zazwyczaj od -60 do -65 mV.
17. Jeśli komórka nie jest boutonem aferentnym, wyjmij elektrodę i powtórz kroki 8 - 13 z nowo napełnioną elektrodą. Używaj nowej elektrody do każdej próby.
18. Monitoruj rezystancję szeregową podczas całej rejestracji, stosując skoki napięcia, aby upewnić się, że uszczelnienie się nie zamyka. Jeśli rezystancja szeregowa wzrośnie, pomocne może być zastosowanie delikatnych impulsów ssania lub lekkie cofnięcie elektrody. Rezystancje szeregowe wynoszą zazwyczaj około 30 MΩ. Podczas analizy aktywności synaptycznej odrzucamy rejestracje z rezystancjami szeregowymi większymi niż 50 MΩ.
19. Można teraz rejestrować aktywność synaptyczną (patrz Rysunek 3). Włókno aferentne wykazuje albo aktywność spontaniczną, albo komórka rzęskowa musi zostać zdepolaryzowana, aby aktywować uwalnianie neurotransmitera. Zastosowanie roztworu zewnątrzkomórkowego z wyższym stężeniem potasu (na przykład 40 mM) zdepolaryzuje komórkę rzęskową i często aktywuje lub zwiększy częstotliwość uwalniania neurotransmitera.
20. W przypadku jednoczesnych rejestracji z IHC i boutonów aferentnych ², procedurę należy zmodyfikować w następujący sposób: Wykonaj kroki od 1 do 5. Napełnij pipetę do IHC odpowiednim roztworem wewnątrzkomórkowym do izolacji prądu Ca²⁺ i postępuj zgodnie z instrukcją w punkcie 6. Pozostaw pipetę do rejestracji IHC w „pozycji oczekiwania” blisko IHC, z której ma być prowadzona rejestracja. Kontynuuj kroki 6 - 14 dla rejestracji aferentnej. Gdy pipeta aferentna znajdzie się w konfiguracji whole-cell, kontynuuj pracę z pipetą IHC. Przesuń drugą pipetę w stronę ściany bocznej odpowiadającej IHC, stale utrzymując nadciśnienie. Pod wpływem ciśnienia w ścianie bocznej IHC powinno pojawić się wgłębienie i należy upewnić się, że komórki podporowe są od niej oddzielone. Kroki 12 - 13 można zastosować również dla IHC. Jak wskazano w punkcie 14, w porównaniu do włókna aferentnego, większe przejściowe prądy pojemnościowe są znakiem rozpoznawczym rejestracji z IHC, obok charakterystycznej relacji IV. Po ustanowieniu jednoczesnych rejestracji należy odczekać pewien czas (3 - 5 min, w zależności od rezystancji szeregowej), aby roztwory wewnątrzkomórkowe wniknęły do IHC. Doprowadzi to do powstania większych prądów Ca²⁺ wskutek zwiększonej blokady znacznie większych przewodnictw K⁺.
21. W celu przeprowadzenia zewnątrzkomórkowych rejestracji z luźnym uszczelnieniem (loose-seal), w kroku 12, zamiast tworzyć uszczelnienie GΩ, utwórz luźne uszczelnienie o rezystancji od około 30 do 50 MΩ na boutonie aferentnym. Można to osiągnąć, stosując słabsze ssanie podczas zwalniania nadciśnienia. Przykład zewnątrzkomórkowej rejestracji z boutonu aferentnego szczura P21 znajduje się na Rysunku 5.

7. Rozwiązywanie problemów

1. Jeśli możliwe jest utworzenie uszczelnienia, ale nie udaje się przejść z rejestracji typu cell-attached do whole-cell, średnica wewnętrzna pipety może być zbyt mała.
2. Jeśli nie udaje się utworzyć szczelnego uszczelnienia, średnica wewnętrzna pipety może być zbyt duża, co może prowadzić do zassania całego Boutona do elektrody.
3. Jeśli wszystkie zdarzenia synaptyczne są małe i jednorodne, rejestracja może mieć charakter zewnątrzkomórkowy względem włókna doprowadzającego. Należy sprawdzić odwrócenie polaryzacji zdarzeń przy dodatnich potencjałach błonowych; wewnątrzkomórkowo rejestrowane EPSCs odwracają się przy potencjałach dodatnich.
4. Jeśli podczas patchowania zakończeń włókien doprowadzających oporności szeregowe są stale wysokie, należy spróbować przesunąć pipetę do tyłu przed próbą przejścia do konfiguracji whole-cell. Pomaga to zapobiec zapychaniu się pipety i wysokiej oporności dostępu.
5. Pozycję pipety należy korygować zdecydowanie. Można przesuwać elektrodę, aby zredukować wysoką oporność szeregową lub udrożnić pipetę, nie tracąc przy tym uszczelnienia na włóknie doprowadzającym. Podczas jednoczesnego ustanawiania rejestracji IHC jest zazwyczaj „popychana” w stronę Boutona. Pozycję pipety włókna doprowadzającego można odpowiednio skorygować.

8. Reprezentatywne wyniki

Rycina 1. A-B. Typowe odpowiedzi przejściowe zarejestrowane z włókna aferentnego (A) i IHC (B) w odpowiedzi na hiperpolaryzujący skok napięcia o wartości 10 mV z napięcia trzymania -94 mV. Ze względu na wąską średnicę pipety i wysoką rezystancję dostępu, rejestracja z IHC (B) jest suboptymalna dla metody whole-cell. Rejestracja ta została przedstawiona tutaj wyłącznie w celu zilustrowania różnicy między odpowiedziami pojemnościowymi z IHC a włóknami aferentnymi. Może to pomóc w rozróżnieniu typów komórek podczas tworzenia konfiguracji whole-cell. Amplituda odpowiedzi pojemnościowych whole-cell z IHC jest około 5 razy większa niż w przypadku włókien aferentnych. C-D. Odpowiedzi przejściowe z A i B przedstawione w powiększonej skali czasowej. C. Zanik odpowiedzi aferentnej można dopasować do dwóch funkcji wykładniczych. Pojemność zakończenia aferentnego oszacowano na podstawie komponenty szybkiej.

Rycina 2. Zależności IV z bouton włókna doprowadzającego (A) oraz z IHC (B). Zależności IV zarejestrowano przy potencjale spoczynkowym -84 mV z krokami napięcia od -124 mV do +36 mV w przyrostach 10 mV (napięcia nominalne). Napięcia są wskazane po prawej stronie niektórych śladów. Pomiary przeprowadzono w obecności 5,8 mM KCl w płynie zewnątrzkomórkowym w temperaturze pokojowej. Skala dla obu wykresów: 500 pA, 200 ms.
A. Zależności IV z włókna doprowadzającego w 19. dniu po urodzeniu. EPSCs występują podczas większości kroków napięcia; potencjał odwrócenia EPSCs wynosi +6 mV. Pomiar ten przeprowadzono w obecności TTX w celu zablokowania napięciowo zależnych prądów Na⁺. Należy zwrócić uwagę na wolno aktywujący się prąd wewnątrzkomórkowy przy napięciach hiperpolaryzujących (I_h). Prąd ten nie występuje w IHC ani w komórkach podporowych i stanowi dobrą wskazówkę, że rejestrowaną komórką jest włókno doprowadzające (patrz ³). B. Zależności IV z P19 IHC. Ze względu na małą średnicę pipety i wysoką rezystancję dostępową, rejestracja jest suboptimalna do charakterystyki prądów IHC, a prądy są mniejsze niż oczekiwano. Rejestrację przedstawiono tutaj jedynie w celu wykazania, że zależności IV dla IHC i włókien doprowadzających można wyraźnie odróżnić w przypadku próby rejestracji z włókna doprowadzającego. Należy zwrócić uwagę na szybko aktywujące się prądy wyjściowe K⁺ przy potencjałach dodatnich (strzałka), po których następują prądy K⁺ opóźnionego prostownika ¹³.

Rysunek 3. Przykładowe prądy synaptyczne zarejestrowane z włókna doprowadzającego w 21. dniu po urodzeniu w obecności 40 mM pozakomórkowego K⁺ w celu zwiększenia szybkości uwalniania z IHC. Temperatura pokojowa, z zastosowaniem TTX w celu zablokowania napięciowo zależnych prądów Na⁺. A. Skala 200 pA, 5 ms, zwrócić uwagę na zmienną wielkość i kształt EPSCs. Szczegółowy opis charakterystyki EPSC znajduje się w ⁴. B. Dwa EPSCs zaznaczone w A (#: wielofazowy, o: jednofazowy) przedstawione w powiększonej skali: Skala 100 pA, 1 ms.

Rycina 4. Symultaniczna rejestracja komórki włókienek wewnętrznych (IHC) oraz kontaktującego się z nią kolbki włókna doprowadzającego w wyciętym narządzie Cortiego szczura w 10. dniu po urodzeniu (patrz również ²). Skok napięcia depolaryzujący IHC wywołuje uwalnianie neuroprzekaźnika i aktywuje EPSCs w kolbce włókna doprowadzającego. Górny ślad: Protokół napięciowy dla depolaryzacji IHC. Potencjał spoczynkowy: -79 mV, skok do -29 mV przez 50 ms. Środkowy ślad: Prądy Ca²⁺ typu L rejestrowane z IHC zazwyczaj wykazują niewielką inaktywację i aktywują się przy potencjałach ujemnych. Dolny ślad: Prądy synaptyczne w włóknie doprowadzającym w odpowiedzi na depolaryzację IHC. Zwrócić uwagę na depresję synaptyczną podczas 50 ms depolaryzacji IHC.

Rycina 5. A. Przykładowy zapis zewnątrzkomórkowy z kolbki aferentnej w 21. dniu po urodzeniu. Pomiary przeprowadzono w temperaturze pokojowej, przy stężeniu K⁺ w środowisku zewnątrzkomórkowym wynoszącym 5.8 mM. Zapis ten charakteryzuje się typowym stosunkiem sygnału do szumu dla pomiaru w preparacie pochodzącym od szczura w wieku trzech tygodni. B. Średni kształt fali dla zdarzeń zewnątrzkomórkowych zarejestrowanych z kolbki aferentnej P20. Jest to średnia fala z 10272 zdarzeń.

Schemat 1. Przekrój poprzeczny przez jeden obrót ślimaka szczura, ilustrujący relacje anatomiczne między wewnętrznymi i zewnętrznymi komórkami rzęskowymi, zwojami spiralnymi, prążkiem naczyniowym a błoną ototektorialną.

Dyskusja

Kluczowym etapem tej procedury jest sekcja. Jeśli tkanka zostanie rozciągnięta lub uszkodzona podczas sekcji, włókna dośrodkowe nie przetrwają. Tkanka młodszych szczurów jest bardziej elastyczna i mniej podatna na uszkodzenia. Uważamy, że dni postnatalne od 10 do 11 są najłatwiejsze do sekcji, a eksperymenty wykazują wówczas wyższy odsetek sukcesów. Znaczny stopień dojrzewania ślimaka zachodzi po narodzinach, a szczury zaczynają słyszeć około 12 dnia postnatalnego ¹⁴. W związku z tym w wieku, w którym sekcja jest najłatwiejsza, synapsy mogą nie być w pełni dojrzałe ⁴.

Opisana tutaj sekcja szczurów jest w zasadzie taka sama w przypadku myszy, przy czym główną różnicą jest mniejszy rozmiar ślimaka u myszy. Technika ta pozwala na badanie właściwości synaps wstęgowych u myszy modyfikowanych transgenicznie ¹⁵. Dalsze modyfikacje tej techniki obejmują: dodanie barwnika fluorescencyjnego do roztworu wewnątrzkomórkowego w celu znakowania włókien ³; rejestracje sparowane z presynaptyczną komórką włoskową wewnętrzną i postsynaptycznym kolbą aferentną, co pozwala na wyznaczenie funkcji przenoszenia między komórkami pre- i postsynaptycznymi ², oraz pozakomórkowe rejestracje z luźnym uszczelnieniem (loose-seal) na kolbach aferentnych, aby uniknąć utraty integralności komórkowej. Konfiguracja rejestracji pozakomórkowej jest łatwiejsza do uzyskania niż konfiguracja whole-cell, a eksperymenty są zazwyczaj dłużej trwałe.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Stół pneumatyczny	TMC
Stół Gibraltar z przesuwem xy	Burleigh
Mikroskop pionowy Axioscope FS2 z optyką DIC i filtrem zielonym	Carl Zeiss, Inc.
Kamera Newvicon z kontrolerem	Dage
Monitor	Dage
Multiclamp 700B (lub podobny)	Molecular Devices
Digidata 1322A (lub podobny)	Molecular Devices
Manipulator MP285	Sutter Instrument Co.
6-kanałowy system zaworowy do aplikacji lokalnej perfuzji (stosowany z własnoręcznie wykonanymi pipetami perfuzyjnymi)	Warner Instruments
PC z oprogramowaniem do akwizycji danych (PClamp)	Molecular Devices
Powyżej przedstawiono wyposażenie naszych układów elektrofizjologicznych wykorzystywanych do rejestracji z terminali aferentnych.