Ocena roli odporności gospodarza w infekcji grzybiczej z wykorzystaniem modelu danio pręgowanego

Streszczenie

Źródło: Luukinen, H. i in. Modelowanie gruźlicy u dorosłych danio zakażonych Mycobacterium marinum . J. Vis. Exp. (2018).

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały przeanalizowane przez lokalny instytucjonalny komitet ds. opieki nad zwierzętami oraz komisję weterynaryjną JoVE.

1. Eksperymentalne zakażenie M. marinum z iniekcją dootrzewnowej

1. Pipetą nałóż kroplę rozcieńczonego roztworu bakteryjnego o pojemności 5 μL na kawałek folii parafilmowej i wciągnij ją do igły insulinowej o pojemności 30 G.
2. Do eksperymentu użyj dzikich ryb w wieku 5–8 miesięcy oraz mutantów rag1−/−hu1999. Znieczulaj dorosłe danio pręgowane w wodzie akwarium z esterem etylowo-esterowym o stężeniu 0,02% kwasu 3-aminobenzoowego (pH 7,0). Ustaw rybę brzuszną stroną do góry, w szczelinę na wilgotnym, piankowym plastiku.
   UWAGA: Ryby mutantne rag-/- nie są w stanie przejść somatycznej rekombinacji i produkować funkcjonalnych komórek T i B.
3. Wstrzyknij igłę między płetwy miednicy pod kątem około 45°. Trzymaj igłę otwartą do góry, aby obserwować, czy całe otwarcie znajduje się wewnątrz jamy brzusznej. Powoli wstrzykuj zawiesinę bakteryjną i ostrożnie usuń igłę.
   UWAGA: Jeśli czerwony smug wycieka z ryby po wstrzyknięciu, wyklucz rybę z eksperymentu.
4. Bezpośrednio po wstrzyknięciu przenieś rybę do zbiornika regeneracyjnego ze świeżą wodą.
5. Pobieraj próbki zawiesiny bakteryjnej na płytkach 7H10 co 15 minut z używanej bakterii aliquot i inkubuj bakterię w temperaturze 29 °C przez 5 dni, a następnie weryfikuj dawkę infekcji, licząc kolonie na płytkach.
6. Regularnie sprawdzaj stan zdrowia ryb i usypiaj każdą rybę z objawami infekcji z stężeniem ponad 0,02% esteru etylo-esteru 3-aminobenzoenowego (pH 7,0).
   UWAGA: Około 7% dorosłych danio zakażonych 34 ±15 CFU oraz 30% danio zakażonych 2029 ± 709 CFU będzie miało objawy do 8 tygodnia19. Objawy mogą obejmować nieprawidłowe pływanie, brak reakcji na dotyk, dyszenie, obrzęk lub widoczne wychudzanie.
7. Utrzymuj danio według wspólnych standardów

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Mycobacterium marinum	Kolekcja Amerykańskiej Kultury Typowej	ATCC 927
Agar Middlebrock 7H10	BD, Thermo Fisher Scientific	11799042
Wzbogacanie OADC w Middlebrock	BD, Thermo Fisher Scientific	11718173
Middlebrock 7H9 medium	BD, Thermo Fisher Scientific	11753473
Wzbogacanie ADC w Middlebrock	BD, Thermo Fisher Scientific	11718173
Tabletki soli fizjologicznej z buforem fosforanem (PBS)	Sigma-Aldrich	P4417-50TAB
Czerwień fenolowa	Sigma-Aldrich	P3532
Wskazówka 27 G	Henke Sass Wolf	4710004020
1 mL strzykawki	Henke Sass Wolf	4010.200V0
Igła insulinowa Omnican 100 30 G	Braun	9151133
Etylester 3-aminobenzoenowy (pH 7,0)	Sigma-Aldrich	A5040