Model przepływu równoległego z płytkami in vitro do badania przyczepności bakteryjnej na biopsji tkanki

Streszczenie

Źródło: Ditkowski, B. i in. Model in vitro systemu perfuzji z równoległymi płytkami do badania przyczepności bakterii do tkanek przeszczepów. J. Vis. Exp. (2019).

Ten film pokazuje metodę wykorzystania komory przepływu z równoległymi płytami do perfuzji bakterii znakowanych fluorescencją na tkankach przeszczepów naczyń, umożliwiając kontrolowaną analizę adhezji bakteryjnej i wczesnej patogenezy w warunkach przepływu ścinającego.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały przeanalizowane i zatwierdzone przez odpowiedni komitet ds. etyki zwierząt.1. Eksperymenty perfuzji in vitro z wykorzystaniem komory przepływu z równoległymi płytkami

1. Biopsje tkanek o średnicy 10 mm i tej samej grubości zamontuj w systemie komory przepływowej, z wewnętrzną powierzchnią skierowaną do góry, aby zetknąć się z zawiesiną bakteryjną.
   UWAGA: Ta sama grubość tkanki na różnych przeszczepach gwarantuje, że w kanale osiąga się tę samą wysokość tkanki, umożliwiając przepływ laminarny we wszystkich warunkach. Wszystkie elementy komory przepływowej przedstawiono i opisano na Rysunku 1.
   1. Aby rozpocząć procedurę, umieść okrągły kawałek tkanki między szkiełkiem mikroskopu z okrągłą perforacją o średnicy 8 mm a gumową uszczelką.
      UWAGA: Szkiełko mikroskopu posiada ultracienką warstwę dolną, umożliwiającą generowanie otworu o średnicy 8 mm. Wraz z gumową folią utrwala tkankę, umożliwiając bezpośredni kontakt między próbką a płynącym ośrodkiem, a także zapobiega przemieszczeniu biopsji podczas eksperymentu. Powierzchnia badanych tkanek, która jest wystawiona na przepływ (mniejsza średnica), nie może być manipulowana przez kleszcze.
      1. Włóż uchwyt z chusteczką do folii uszczelki, która jest osadzona w dolnej metalowej ramie komory.
      2. Przymocuj górną metalową ramę z odpowiednią uszczelką do dolnej części komory za pomocą wcześniej włożonego uchwytu na chusteczkę. Następnie zamontuj całą komorę za pomocą ośmiu śrub i nakrętek. Upewnij się, że wysokość komory jest zawsze taka sama w przeszczepach.
         UWAGA: Wysokość komory powinna być ustalana zawsze po dokręceniu śrub. Użyj zacisku lub linijki.
2. Komorę przepływową połącz z pompą perystaltyczną, a zbiornik płynu z rurkami.
3. Przekręć tkanki zawiesinami 10⁷ CFU/mL (zweryfikowane przez CFU (jednostka formowania kolonii) i powiązane z pomiarami OD₆₀₀ (gęstość optyczna) fluorescencyjnie znakowanych bakterii w PBS (sól buforowana fosforanowa) z naprężeniem ścinającym 3 dyne/^{cm 2} (jednostka ciśnienia dyne na centymetr kwadratowy) za pomocą pompy perystaltycznej (przepływ 4 mL/min) przez 1 godzinę, używając zbiornika bakteryjnego 400 mL (projekt wewnętrzny, Rysunek 1) poddawane w temperaturze 37 °C przy użyciu termostatu płytowego (Tabela materiałów).
4. Recyrkuluj w ciągłym czasie 100 mL zawiesiny bakteryjnej w tym samym zbiorniku zbiorczym.
5. Po przelaniu rozłóż komorę, aby uwolnić przeszczep i dwukrotnie przepłucz fragment tkanki 4 mL PBS w 12-dołkowej płycie, używając laboratoryjnego wstrząsania oczodołowego przez 3 minuty każda. Następnie wyciął wewnętrzną część przeszczepu za pomocą ciosteru do biopsji skóry o mniejszej średnicy.
6. Każdą biopsję tkanki należy umieścić w osobnej probówce o pojemności 14 mL zawierającej 1 ml bezpłodnego NaCl o stężeniu 0,9%. Oznacz tubę jako #1.
7. Odłącz bakterie od tkanki za pomocą kąpieli sonikacyjnej przez 10 minut (amplituda = 100% i częstotliwość = 45 kHz).
   UWAGA: Pełne odłączenie bakterii od przeszczepów tkanek należy ocenić po inkubacji plastr przez noc w temperaturze 37 °C w płynnym medium TSB (trypt sojowy), a następnie pomiarach OD₆₀₀ w porównaniu z plastrami kontrolnymi traktowanymi roztworem wolnym od bakterii.

Wyniki

Rysunek 1: Zdjęcie nowo opracowanego systemu komór przepływowych (projekt wewnętrzny). A. Komora przepływowa (1) zamontowała zestaw przepływów o wymiarach LxWxH: 125 mm x 55 mm x 18 mm (śruby w połączeniu z nakrętkami śrubowymi trzymają czę...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Plaster na osierdzie bydła (BP), Elastyczny osierdziec okręgowy	Synovis Surgical Innovations, USA	PC-0404SN
Żyły żyjne bydła (BJV)	Contegra conduit; Medtronic Inc, USA	M333105D001
Homograft krioprezerwowany CH	Europejski Bank Homograftu (EHB)	-
Acu-Punch	Acuderm Inc, USA	P850 (8 mm); P1050 (10 mm)
Albumina ludzka	Flexbumin; Baxter, Belgia	BE171464LOT:16G12C
Tryptyczny bulion sojowy (TSB)	Fluka, Steinheim, Niemcy	22092-500G
Bulion do infuzji serca (BHI)	Fluka	53286-500G
Sól fizjologiczna buforowana fosforanowo (PBS).	Gibco	14190-094
5(6)-karboksyfluoresceina N-hydroksukcynimidowe ester (CF)	Sigma-Aldrich, Niemcy	21878-100MG-F
Pompa perystaltyczna (MODEL ISM444B)	Ismatec BVP-Z Standard; Cole Parmer, Wertheim, Niemcy	631942-2
Kąpiel sonikowania	Ultradźwiękowa myjka VWR; VWR, Radnor, Pensylwania	142-6044	230V/50-60Hz 60VA; HF45kHz, 30W
ProLong Gold Antifade Mountant	Invitrogen od ThermoFisher	P36930
Arium Pro VF - ultraczysta woda - H2O MilliQ	Millipore	87206462
Mikroskopowe preparaty – komory do hodowli tkanek (1-dołek)	Sarstedt	94.6140.102
1-dołek na Lumox odłączany	Sarstedt	94.6150.101
Stal nierdzewna – ostrza chirurgiczne	Swann-Morton	311
Tygon silikonowa rurka, średnica 1/8" x 1/4" średnica	Cole-Parmer	EW-95702-06	Zakres temperatur: –80 do 200°C Teryliz: Z tlenkiem etylenu, napromieniowaniem gamma lub autoklawem przez 30 minut, ciśnienie 15 psi
Rurka PharMed BPT	Saint-Gobain	AY242012	Autoklawowa 30 minut w 121°C
Rury Tygon LMT-55	Saint Gobain Performance Plastics™	15312022
Termostat	BMG BIOMEDIZINTECHNIK	300-0042	230V, 90VA, 50Hz