Tu opisujemy metody testowania uczenia się asocjacyjnego u C. elegans oraz krótko- i długoterminowej pamięci asocjacyjnej. Te testy populacyjne wykorzystują zdolności robaków do chemotaksii w kierunku lotnych substancji zapachowych i tworzenia pozytywnych skojarzeń podczas parowania jedzenia z chemoatraktantem butanonem. Zwiększenie liczby okresów kondycjonowania indukuje długoterminową pamięć.
Artykuł metodologiczny
C. elegans Testy uczenia się dotyczące butanonu, krótkoterminowej i długoterminowej pamięci asocjacyjnej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Pamięć doświadczeń i nabytej informacji jest krytyczna dla organizmów, aby podejmować decyzje, które pomagają im przetrwać. C. elegans porusza się po środowisku poprzez neuronowo specyficzne wykrywanie pokarmu i chemicznych zapachów1, 2, i może kojarzyć stany pokarmowe z chemicznymi zapachami3, temperaturą4 i patogennością źródła pokarmu5.
Opisujemy tu testy uczenia się asocjacyjnego C. elegans oraz krótko- i długotrwałej pamięci asocjacyjnej. Zmodyfikowaliśmy paradygmat awersyjnego uczenia się węchowego6, aby zamiast tego wywołać pozytywną reakcję; test polega na głodowaniu ~400 robaków, a następnie karmieniu ich w obecności ulatniającego się chemoatraktantowu butanone, wykrywanego przez neurony AWC w stężeniu, które wywołuje niski wskaźnik chemotaksji (podobny do Toroyama et al.7). Standardowy test chemotaksji populacyjnej1 sprawdza przyciąganie robaków do zapachu natychmiast lub od kilku minut do godzin po kondycjonowaniu.
Po kondycjonowaniu, chemotaksja do butanone zwierząt dziko żyjących wzrasta o ~0,6 jednostek Indeksu Chemotaksji, czyli jego "Indeks Uczenia". Uczenie się asocjacyjne zależy od obecności zarówno pokarmu, jak i butanone podczas treningu. Połączenie pokarmu i butanone na jeden okres kondycjonowania ("kondycjonowanie masowe") produkuje krótkoterminową pamięć asocjacyjną, która trwa ~2 godziny. Wielokrotne okresy kondycjonowania z okresami odpoczynku między nimi ("kondycjonowanie rozłożone") daje długoterminową pamięć asocjacyjną (mniej niż 40 godzin) i zależy od białka wiązania elementu odpowiedzi na cAMP (CREB)6, czyli czynnika transkrypcyjnego wymaganego dla długoterminowej pamięci w różnych gatunkach.8
Nasz protokół obejmuje również metody analizy obrazów dla szybkiej i dokładnej determinacji indeksów chemotaksji. Wysoko kontrastowe zdjęcia zwierząt na płytkach do testów chemotaksji są uchwytywane i analizowane przez oprogramowanie do liczenia robaków w MatLab. Oprogramowanie koryguje nierównomierny tło za pomocą transformacji morfologicznej tophat9. Następnie metoda Otsue jest używana do określenia progu, aby oddzielić robaki od tła10. Bardzo małe cząstki są automatycznie usuwane, a większe obszary niebędące robakami (krawędzie płytek lub wycięcia w agarze) są usuwane przez ręczną selekcję. Oprogramowanie następnie oszacowuje rozmiar pojedynczego robaka, ignorując obszary, które przekraczają określony maksymalny rozmiar i biorąc medianę rozmiaru pozostałych obszarów. Liczba robaków jest następnie oszacowana przez podzielenie całkowitej powierzchni zidentyfikowanej jako zajętej przez robaki przez oszacowany rozmiar pojedynczego robaka.
Znaleźliśmy, że uczenie się oraz krótko- i długoterminowa pamięć mogą być rozróżnione i że te procesy dzielą podobne kluczowe cząsteczki z wyższymi organizmami.6,8 Nasze testy mogą szybko sprawdzać nowe kandydatów genów lub cząsteczek, które wpływają na uczenie się i krótko- lub długoterminową pamięć w C. elegans, które są istotne dla różnych gatunków.
Protokół
Te C. elegans testy nauki skojarzeniowego i pamięci wymagają wstępnej przygotowania. Sugerowany harmonogram przygotowania przedstawiono na rysunku 1A. Należy również pamiętać, że pamięć robaków może zostać zaburzona przez fizyczne wstrząsy (bruszące pipetowanie, wirowanie, wirowanie), a naiwna chemotaksja może być zakłócona przez nadmierny zapach (perfumy itp.) w środowisku.
1. Przygotowanie zwierząt do badania
- Uprawiaj robaki na 100 mm wysokich płytkach z pożywką do wzrostu (HGM) (patrz sekcja 7.1 w celu uzyskania receptury) zasiata z 1 mL OP50 E. coli metodami standardowymi.11
- Poddawaj co najmniej dwie gęsto zasiedlone płytki HGM pełnych dorosłych robaków na traktowanie hipochlorytem w celu uzyskania dużej zsynchronizowanej populacji jajeczek.
Uwaga: Aby uzyskać najlepsze plony, wybielaj pierwsze pokolenie, aby uzyskać wysoce zsynchronizowaną populację, a następnie wybielaj drugą generację jako dorosłe osobniki w dniu 2, aby uzyskać jajka na kolejny krok. - Równomiernie podziel jajka na 3-4 płytki HGM zasiate z 1 mL OP50 E. coli na każdą płytkę poddaną działaniu hipochlorytu.
Uwaga: Ważne jest, aby robaki były uprawiane z dużą ilością świeżego pokarmu, ponieważ głód może wpłynąć na wynik testów węchowych. - Inkubacja robaków w temperaturze 20oC przez około 72 godziny, czyli czas potrzebny na osiągnięcie przez zwierzęta młodej fazy dorosłej.
2. Pre-warunkowanie Głód
- Dwukrotnie sprawdź płytki HGM z młodymi dorosłymi, aby się upewnić, że robaki mają jeszcze dużo pokarmu i że jest wystarczająco dużo robaków na badanie (≥ 200 robaków na płytkę badawczą).
- Zmyj robaki z płytek HGM do rurkowego pojemnika o pojemności 15 mL za pomocą buforu M911. Aby zmniejszyć wstrząsy podczas płukania, delikatnie nałóż bufor M9 poprzez nalania kilku mililitrów na płytkę HGM i delikatnego obrotu płytką, aby uwolnić robaki z lepkich bakterii OP50. Następnie przechyl płytkę, podnieś mieszankę buforu M9/robaków z rogu płytki za pomocą pipetmana P1000 i przenieś robaki do rurkowego pojemnika o pojemności 15 mL. Jeśli robaki nadal pozostają na płytce, powtórz ten krok 1-2 razy.
Uwaga: Bruszące mycie ściąga bakterie z płytki, które mogą dostać się do rurkowego pojemnika z robakami. Nie można się ich pozbyć i mogą one zakłócić badania. NIE używaj pipety do pipetowania robaków na ściankę rurki, ponieważ może to uszkodzić robaki i zakłócić badania. - Pozwól robakom osiadać siłą grawitacji (NIE wyśrodkowuj). Usuń nadstan buforu za pomocą odkurzacza i przepłucz co najmniej 3-4 mL buforu M9. Powtórz 2 razy, aby uzyskać łącznie 3 płukanki.
Uwaga: Wyśrodkowywanie podczas płukania odbije w dół wszelkie pozostałe bakterie do populacji robaków, co może zakłócić badania. Zamiast tego delikatnie dodaj bufor M9 do kolejnych płukanek, wlewając go bezpośrednio do rurkowego pojemnika o pojemności 15 mL. Robaki osadzone na dnie rurkowego pojemnika powinny zostać wymieszane z buforem M9 po jego dodaniu. Jeśli robaki pozostały osadzone, delikatnie odwróć rurkowy pojemnik, aby je wymieszać. - Po trzecim płukaniu użyj części populacji robaków do testów naiwnej chemotaksji (sekcja 5).
Uwaga: Ważne jest, aby pracować dość szybko na wszystkich krokach płukania, ponieważ robaki zaczną głodować, jeśli długo siedzą w buforze M9, co może zwiększyć naiwną chemotaksję w kierunku butanonu. - Dodaj 3-4 mL buforu M9 do rurkowego pojemnika o pojemności 15 mL, pozwól robakom głodować w buforze M9 w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę (rysunek 1B, C).
3. Szybka pamięć skojarzeniowa (zgrupowana) Trening
Zobacz rysunek 1B, aby zobaczyć przepływ badania pamięci skojarzeniowej krótkotrwałej.
- Na końcu okresu głodu w buforze M9 (sekcja 2), rozprowadź 2 μL 10% butanonu (w 95% EtOH) na wewnętrznej stronie pokryw 60 mm płytek z pożywką do wzrostu nematod (NGM)11 zasiate z 500 μL OP50 E. coli.
Uwaga: Dobra początkowa populacja na potrzeby testów pamięci krótkotrwałej i długotrwałej to ≥ 500 μL robaków. Potrzeba wielu płytek do kondycjonowania na każdy genotyp, aby wspierać całą populację podczas treningu. Podczas pracy z lotnymi chemikaliami, otwieraj pokrywy płytek tylko wtedy, gdy jest to konieczne, pozostawiając je zamknięte w innych przypadkach. - Usuń nadstan buforu M9 z rurkowego pojemnika o pojemności 15 mL z głodujących robaków za pomocą odkurzacza i użyj pipetmana P1000, aby umieścić
Dyskusja
Przedstawione tutaj testy uczenia się i pamięci skojarzeniowej u C. elegans rozróżniają procesy masowego uczenia się, uczenia się rozproszonego, krótkotrwałej pamięci i długotrwałej pamięci. Testy te opierają się na zdolnościach robaków do wyczuwania pokarmu i zapachów chemicznych w ich środowisku1,2 oraz tworzenia pozytywnych skojarzeń między nimi6. Dlatego testy te są bardzo wrażliwe na głód w początkowej populacji zwierząt i należy zachować szczególną ostrożność, aby robaki były dobrze odżywione przed i po treningu. Pojedynczy trening masowy przynosi krótkotrwałą pamięć skojarzeniową. Zwiększona liczba okresów kondycjonowania i paradygmat treningu rozproszonego są krytyczne dla osiągnięcia długotrwałej pamięci skojarzeniowej u C. elegans, jak i u innych organizmów6,8. Być może ten test można zmodyfikować, aby wytworzyć długotrwałą pamięć skojarzeń między różnymi warunkami warunkowanymi i niewarunkowanymi.
Nasze testy uczenia się i pamięci skojarzeniowej mogą być wykorzystane do porównania zdolności uczenia się i pamięci u typu dzikiego z zwierzętami starzejącymi się lub genetycznie mutantycznymi. Na przykład, podczas gdy zarówno skojarzeniowe uczenie się, jak i zdolności długotrwałej skojarzeniowej pamięci maleją u starzejących się robaków typu dzikiego, uczenie się utrzymuje się dłużej wraz z wiekiem u zwierząt z obniżonym sygnałowym insulinowym, a uczenie się i pamięć utrzymują się dłużej wraz z wiekiem u zwierząt poddanych ograniczeniom kalorycznym6. Testy te są również dostępne do leczenia RNAi lub manipulacji farmakologicznej u C. elegans. Na przykład, leczenie robaków RNAi daf-2 poprawia krótkotrwałą i długotrwałą pamięć skojarzeniową; odwrotnie, blokowanie transkrypcji genów i syntezy białek lekami (odpowiednio aktynomycyna D i cykloheksymid) podczas treningu rozproszonego zakłóca tworzenie długotrwałej pamięci6.
Długotrwała pamięć jest procesem kluczowy dla przetrwania wszystkich zwierząt, i wydaje się, że dużą część maszyny molekularnej zaangażowanej w pamięć skojarzeniową Pawłowa zachowano od robaków po ssaki6. Zdolność do rozróżniania i testowania skojarzeniowego uczenia się, krótkotrwałej i długotrwałej pamięci za pomocą tych testów węchowych sprawia, że C. elegans jest doskonałym systemem do dalszego badania pamięci i może dostarczyć wglądu w procesy neurodegeneracyjne prowadzące do utraty uczenia się i pamięci u ludzi.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Dziękujemy W. Ryu za porady dotyczące naszego początkowego ustawienia obrazu, Z. Gitai za sugestię użycia ImageJ13 do zliczania robaków i J. Ashraf za pomoc w Google SketchUp. CTM jest stypendystą Pew w dziedzinie nauk biomedycznych, stypendystą McKnight i stypendystą Keck.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Sodium Azide | Fisher Scientific | S227 | Prepare 1 M concentration in distilled water |
| Ethyl Alcohol 190 Proof | Pharmco-AAPER | DSP-CT-18 | >95% Ethanol may have impurities that interfere with chemotaxis assays |
| 2-Butanone 99+% | Acros Organics | 14967-0010 | |
| Basler IEEE-1394/FireWire Area Scan CMOS Camera | Edmund Scientific | NT56-683 | |
| InfiniMite Video Lens – Alpha Industrial | Edmund Scientific | NT56-202 | |
| Dolan-Jenner MI-150 Fiber Optic Illuminator | Edmund Scientific | NT55-718 | |
| 8” x 8” Backlight | Schott AG | A08927 | |
| Standard Boom Stand | Edmund Scientific | NT54-120 | |
| 3/4” Post Adaptor for Boom Stands | Edmund Scientific | NT54-124 | |
| Standard Fixed 1/4-20 Mounting Plate | Edmund Scientific | NT54-122 |
Bibliografia
- Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans. Cell. 74, 515-515 (1993).
- Ward, S. Chemotaxis by the nematode Caenorhabditis elegans: identification of attractants and analysis of the response by use of mutants. Proc Natl Acad Sci U S A. 70, 817-817 (1973).
- Bono, M. d. e., Maricq, A. V. Neuronal substrates of complex behaviors in C. elegans. Annu Rev Neurosci. 28, 451-451 (2005).
- Mori, I. Genetics of chemotaxis and thermotaxis in the nematode Caenorhabditis elegans. Annu Rev Genet. 33, 399-399 (1999).
- Zhang, Y., Lu, H., Bargmann, C. I. Pathogenic bacteria induce aversive olfactory learning in Caenorhabditis elegans. Nature. 438, 179-179 (2005).
- Kauffman, A. L. Insulin signaling and dietary restriction differentially influence the decline of learning and memory with age. PLoS Biol. 8, e1000372-e1000372 (2010).
- Torayama, I., Ishihara, T., Katsura, I. Caenorhabditis elegans integrates the signals of butanone and food to enhance chemotaxis to butanone. J Neurosci. 27, 741-741 (2007).
- Silva, A. J., Kogan, J. H., Frankland, P. W., Kida, S. CREB and memory. Annu Rev Neurosci. 21, 127-127 (1998).
- Meyer, F. Iterative image transformations for an automatic screening of cervical smears. J Histochem Cytochem. 27, 128-128 (1979).
- Otsu, N. A Threshold Selection Method from Gray-Level Histograms. IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. 9, 62-62 (1979).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-71 (1974).
- Stephens, G. J., Johnson-Kerner, B., Bialek, W., Ryu, W. S. Dimensionality and dynamics in the behavior of C. elegans. PLoS Comput Biol. 4, e1000028-e1000028 (2008).
- Abramoff, M. a. g. e. l. h. a. e. s., Ram, P. J., J, S. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11, 36-36 (2004).
Przedruki i uprawnienia
Przeglądaj więcej artykułów
C. Eleganspozytywne uczenie się butanonukrótkotrwała pamięćdługotrwała pamięćtesty pamięci asocjacyjnejparadygmat uczenia się węchowego odrażającegoneuron AWC wyczuwający lotny chemoatraktant butanonwskaźnik chemotaksjitest chemotaksji populacjiwskaźnik uczenia sięparowanie jedzenia i butanonuintensywne treningirozłożone treningielement odpowiedzi na CAMP
