C. elegans: testy uczenia się pozytywnego względem butanonu oraz testy krótkotrwałej i długotrwałej pamięci asocjacyjnej

Podsumowanie

W niniejszym opracowaniu opisujemy metody testowania uczenia się warunkowego oraz krótkotrwałej i długotrwałej pamięci asocjacyjnej u C. elegans. Te populacyjne testy wykorzystują zdolność nicieni do chemotaksji w kierunku lotnych substancji zapachowych oraz tworzenie pozytywnych skojarzeń poprzez parowanie pożywienia z chemoatraktantem, jakim jest butanon. Zwiększenie liczby okresów warunkowania indukuje pamięć długotrwałą.

Streszczenie

Pamięć doświadczeń i nabytych informacji jest kluczowa dla organizmów w podejmowaniu decyzji sprzyjających ich przetrwaniu. C. elegans porusza się w swoim środowisku dzięki specyficznej dla neuronów detekcji pożywienia i zapachów chemicznych^{1, 2}, a także potrafi powiązać stany odżywcze z zapachami chemicznymi³, temperaturą⁴ oraz patogennością źródła pożywienia⁵.

W niniejszej pracy opisujemy testy uczenia się asocjacyjnego oraz krótkoterminowej i długoterminowej pamięci asocjacyjnej u C. elegans. Zmodyfikowaliśmy paradygmat uczenia się zapachowego o charakterze awersyjnym⁶, aby zamiast tego wywołać reakcję pozytywną; test polega na zagłodzeniu około 400 nicieni, a następnie karmieniu ich w obecności lotnego chemoatraktanta, butanonu, wykrywanego przez neurony AWC, w stężeniu wywołującym niski indeks chemotaktyczny (podobnie jak u Toroyamy et al.⁷). Standardowy test chemotaksji populacyjnej1 służy do oceny atrakcyjności substancji zapachowej dla nicieni bezpośrednio lub od kilku minut do kilku godzin po warunkowaniu.

Po uwarunkowaniu chemotaksja zwierząt typu dzikiego w stronę butanonu wzrasta o około 0,6 jednostki indeksu chemotaksji, co stanowi ich „indeks uczenia się”. Uczenie asocjacyjne jest zależne od obecności zarówno pokarmu, jak i butanonu podczas treningu. Parowanie pokarmu z butanonem w jednym okresie uwarunkowania („trening skumulowany”) prowadzi do powstania krótkotrwałej pamięci asocjacyjnej, która utrzymuje się przez około 2 godziny. Wielokrotne okresy uwarunkowania z przerwami odpoczynkowymi pomiędzy nimi („trening rozłożony w czasie”) skutkują powstaniem długotrwałej pamięci asocjacyjnej (<40 godzin) i jest procesem zależnym od białka CREB (cAMP Response Element Binding protein),⁶ czynnika transkrypcyjnego niezbędnego do tworzenia pamięci długotrwałej u wielu gatunków.⁸

Nasz protokół obejmuje również metody analizy obrazu w celu szybkiego i dokładnego wyznaczenia indeksów chemotaksji. Obrazy zwierząt na płytkach do testów chemotaksji o wysokim kontraście są rejestrowane i analizowane przez oprogramowanie do liczenia nicieni w środowisku MatLab. Oprogramowanie koryguje nierównomierne tło, stosując morfologiczną transformację top-hat.⁹ Następnie wykorzystuje się metodę Otsu do wyznaczenia progu oddzielającego nicienie od tła.¹⁰ Bardzo małe cząsteczki są usuwane automatycznie, a większe obszary niebędące nicieniami (krawędzie płytki lub otwory w agarze) są usuwane poprzez ręczny wybór. Oprogramowanie szacuje następnie rozmiar pojedynczego nicienia, pomijając obszary przekraczające określoną maksymalną wielkość i przyjmując medianę rozmiaru pozostałych obszarów. Liczbę nicieni szacuje się następnie poprzez podzielenie całkowitego obszaru zidentyfikowanego jako zajęty przez nicienie przez szacowany rozmiar pojedynczego nicienia.

Stwierdziliśmy, że uczenie się oraz pamięć krótkotrwała i długotrwała mogą być odróżnione i że procesy te dzielą podobne kluczowe cząsteczki z organizmami wyższymi.^6,8 Nasze testy pozwalają na szybką weryfikację nowych genów kandydatów lub cząsteczek wpływających na uczenie się oraz pamięć krótkotrwałą lub długotrwałą u C. elegans, które są istotne w obrębie wielu gatunków.

Protokół

Te testy uczenia asocjacyjnego i pamięci u C. elegans wymagają wcześniejszego przygotowania. Sugerowany harmonogram przygotowań przedstawiono na osi czasu w Rysunku 1A. Należy również pamiętać, że pamięć nicieni może zostać zaburzona przez pobudzenie fizyczne (gwałtowne pipetowanie, wirowanie, mieszanie w wirówce), a naiwna chemotaksja może zostać zakłócona przez nadmierne zapachy (perfumy itp.) w otoczeniu.

1. Przygotowanie zwierząt do analizy

1. Hodować nicienie na płytkach z wysokim podłożem wzrostowym (HGM) o średnicy 100 mm (przepis znajduje się w sekcji 7.1) zaszczepionych 1 mL E. coli szczep OP50, stosując standardowe metody.¹¹
2. Poddać działaniu podchlorynu co najmniej dwie gęsto zasiedlone płytki HGM z dorosłymi nicieniami w stadium gravidnym, aby uzyskać dużą, zsynchronizowaną populację jaj.
   Uwaga: Aby uzyskać najlepsze wyniki, należy poddać działaniu wybielacza pierwsze pokolenie w celu uzyskania wysoko zsynchronizowanej populacji, a następnie poddać działaniu wybielacza drugie pokolenie w drugim dniu stadium dorosłego, aby uzyskać jaja do następnego etapu.
3. Równomiernie rozdzielić jaja na 3-4 płytki HGM zaszczepione 1 mL E. coli szczep OP50 dla każdej płytki poddanej działaniu podchlorynu.
   Uwaga: Ważne jest, aby nicienie były hodowane z obfitą ilością świeżej pożywki, ponieważ głodzenie może wpłynąć na wyniki testów węchowych.
4. Inkubować nicienie w temperaturze 20oC przez około 72 godziny, czyli czas potrzebny na osiągnięcie przez zwierzęta stadium młodego dorosłego.

2. Wstępne głodzenie (prekondycjonowanie)

1. Ponownie sprawdź płytki HGM z młodymi osobnikami dorosłymi, aby upewnić się, że nicienie nadal mają pod dostatkiem pożywienia oraz że liczba nicieni jest wystarczająca do przeprowadzenia analizy (≥ 200 nicieni na płytkę analityczną).
2. Zmyj nicienie z płytek HGM buforem M9¹¹ do stożkowej probówki 15 mL. Aby zminimalizować stres podczas płukania, delikatnie nanieś bufor M9, wlewając kilka mililitrów na płytkę HGM, a następnie delikatnie zakręć płytką, aby uwolnić nicienie z lepkich bakterii OP50. Następnie przechyl płytkę, pobierz mieszaninę buforu M9 i nicieni z narożnika płytki za pomocą pipety P1000 i przenieś nicienie do stożkowej probówki 15 mL. Jeśli na płytce pozostały jeszcze nicienie, powtórz ten krok 1-2 razy.
   Uwaga: Gwałtowne płukanie powoduje odrywanie się bakterii z płytki, które mogą przedostać się do probówki wraz z nicieniami. Bakterii tych nie da się usunąć, co może zakłócić wyniki analizy. NIE pipetuj nicieni o ściankę probówki, ponieważ może to uszkodzić zwierzęta i wpłynąć na wyniki analiz.
3. Pozostaw nicienie do osadzenia się pod wpływem grawitacji (NIE wirować). Usuń nadosad nadciśnieniowo i przemyj co najmniej 3-4 mL buforu M9. Powtórz czynność 2 razy, aby w sumie przeprowadzić 3 płukania.
   Uwaga: Wirowanie podczas płukania spowoduje osadzenie wszelkich pozostałych bakterii wraz z populacją nicieni, co może zakłócić analizy. Zamiast tego, podczas kolejnych płukań delikatnie dodawaj bufor M9, wlewając go bezpośrednio do stożkowej probówki 15 mL. Nicienie osadzone na dnie probówki powinny wymieszać się z buforem M9 po jego dodaniu. Jeśli nicienie pozostaną osadzone, delikatnie odwróć probówkę, aby je wymieszać.
4. Po trzecim płukaniu wykorzystaj część populacji nicieni do analiz naiwnej chemotaksji (Sekcja 5).
   Uwaga: Kluczowe jest sprawne przeprowadzenie wszystkich etapów płukania, ponieważ nicienie zaczną głodować, jeśli będą zbyt długo przebywać w buforze M9, co może zwiększyć naiwną chemotaksję w kierunku butanonu.
5. Dodaj 3-4 mL buforu M9 do stożkowej probówki 15 mL i pozostaw nicienie do głodzenia w buforze M9 w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę (Rysunek 1B, C).

3. Trening pamięci asocjacyjnej krótkotrwałej (skumulowany)

Schemat badania krótkotrwałej pamięci asocjacyjnej przedstawiono na rysunku 1B.

1. Po zakończeniu okresu głodzenia w buforze M9 (Sekcja 2), nanieś smugą 2 μL 10% butanonu (w 95% EtOH) na wewnętrzną stronę pokrywek płytek z pożywką NGM (nematode growth media)¹¹ o średnicy 60 mm, na które zaszczepiono 500 μL E. coli OP50.
   Uwaga: Dobrą populacją startową do testów pamięci krótkotrwałej i długotrwałej jest ≥ 500 μL nicieni. Na każdy genotyp wymaganych jest wiele płytek warunkujących, aby utrzymać całą populację podczas treningu. Podczas pracy z substancjami lotnymi otwieraj pokrywki płytek tylko wtedy, gdy jest to konieczne, pozostawiając je zamknięte w pozostałym czasie.
2. Usuń nadsącz z buforu M9 z probówki stożkowej 15 mL zawierającej głodzone nicienie za pomocą odsysacza i użyj pipety P1000, aby przenieść 100-200 μL nicieni na płytki warunkujące.
   Uwaga: Staraj się usunąć jak najwięcej cieczy M9, aby nicienie mogły szybko dotrzeć do źródła pożywienia OP50 po przeniesieniu na płytki warunkujące. Nicienie przyklejają się do wnętrza końcówki pipety i można je zachować, pipetując mniejsze objętości.
3. Inkubuj płytki warunkujące w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę (Rysunek 1B).
4. Zmyj nicienie z płytek za pomocą ~1 mL buforu M9 do probówki stożkowej 15 mL. Pozostaw nicienie do osadzenia grawitacyjnego. Powtórz płukanie 1-2 razy, aż bufor M9 w probówce będzie klarowny.
   Uwaga: Stosuj łagodne metody płukania opisane w Sekcji 2. Można użyć tej samej probówki stożkowej 15 mL z Sekcji 2.
5. Po ostatnim płukaniu usuń nadsącz z buforu M9 za pomocą odsysacza i wykorzystaj część populacji nicieni do testów chemotaksji (Sekcja 5), aby sprawdzić 1x (masowe) uczenie się asocjacyjne powiązania pożywienie-butanon bezpośrednio po warunkowaniu (punkt czasowy 0 minut).
   Wskaźnik uczenia się (LI) = CI_{0 hr} - CI_Naive.
6. Przenieś pozostałą populację nicieni na płytki NGM 60 mm zaszczepione 500 μL OP50 (płytki podtrzymujące). Ponownie nanieś 100-200 μL nicieni na płytkę, aby zapewnić wystarczającą ilość bakterii do utrzymania populacji.
   Uwaga: Liczba płytek podtrzymujących używanych dla każdego genotypu musi być co najmniej równa liczbie badanych punktów czasowych pamięci asocjacyjnej krótkotrwałej.
7. Inkubuj płytki po warunkowaniu przez 0,5, 1 lub 2 godziny (punkty czasowe pamięci asocjacyjnej krótkotrwałej) w temperaturze pokojowej (Rysunek 1B).
   Uwaga: Krótkotrwała pamięć asocjacyjna u zwierząt typu dzikiego kończy się do 2 godzin po treningu. Punkty czasowe mogą wymagać dostosowania dla różnych genotypów lub warunków.
8. Aby przetestować krótkotrwałą pamięć asocjacyjną powiązania pożywienie-butanon, po każdym punkcie czasowym ostrożnie zmyj nicienie z płytek do probówki stożkowej 15 mL i ponownie 1-2 razy buforem M9. Wykorzystaj nicienie do testów chemotaksji (Sekcja 5). Wskaźnik uczenia się (LI) = CI_{Time point} - CI_Naive.
   Uwaga: Stosuj łagodne metody płukania opisane w Sekcji 2. Dla każdego punktu czasowego usuń wszelkie nadmiarowe nicienie, które nie zostały wykorzystane w testach chemotaksji.

4. Trening długotrwałej pamięci asocjacyjnej (metoda odstępów)

Schemat badania długotrwałej pamięci asocjacyjnej przedstawiono na rysunku 1C.

1. Należy wykonać kroki 3.1-3.2 opisane w sekcji 3.
2. Inkubować płytki warunkujące w temperaturze pokojowej przez 30 minut (Ryc. 1C).
3. Należy wykonać krok 3.4 opisany w sekcji 3.
   Uwaga: Aby zmieścić się w 30-minutowym przedziale czasowym, można rozpocząć wszystkie płukania podczas treningu w ~25 minucie.
4. Po ostatnim płukaniu usunąć nadsącz M9 za pomocą odsysania próżniowego i przenieść nicienie na nieobsiane płytki NGM 60 mm.
   Uwaga: Na tym etapie nie jest wymagane stosowanie wielu płytek na genotyp, ponieważ nicienie są poddawane głodzeniu.
5. Głodzić na płytkach NGM 60 mm w temperaturze pokojowej przez 30 minut (Ryc. 1C).
6. Wypłukać nicienie buforem M9 do stożkowej probówki 15 mL. Pozostawić nicienie do osadzenia siłą grawitacji (NIE wirować).
   Uwaga: Chociaż na tym etapie w buforze nie powinno być bakterii, wirowanie może być szkodliwe dla nicieni i może zakłócić formowanie się pamięci długotrwałej.
7. Powtarzać kroki 4.1-4.6 kilkukrotnie, aż do momentu ukończenia łącznie 7 bloków warunkowania i 6 bloków głodzenia (Ryc. 1C). (Reprezentatywny harmonogram czasowy znajduje się w tabeli 1).
8. Delikatnie wypłukać nicienie z płytek do stożkowej probówki 15 mL, a następnie ponownie 1-2 razy buforem M9.
9. Po ostatnim płukaniu wykorzystać część populacji nicieni do testów chemotaksji (sekcja 5), aby sprawdzić 7-krotne (rozłożone w czasie) uczenie się asocjacyjne związku pokarm-butanon bezpośrednio po warunkowaniu (punkt czasowy 0 h). Indeks uczenia się (LI) = CI_{0 hr} - CI_Naive.
10. Przenieść pozostałą populację nicieni na płytki HGM 100 mm obsiane 1 mL OP50 (płytki podtrzymujące). Ponownie nanieść 100-200 μL nicieni na płytkę, aby zapewnić wystarczającą ilość bakterii do utrzymania populacji.
    Uwaga: Liczba płytek podtrzymujących użytych na genotyp jest co najmniej równa liczbie punktów czasowych pamięci asocjacyjnej długotrwałej, które mają zostać przetestowane. Jako płytki powarunkujące można również stosować płytki NGM 100 mm, jednak należy bardzo dbać o to, aby ilość OP50 była wystarczająca do utrzymania populacji nicieni przez co najmniej 16 godzin.
11. Inkubować płytki powarunkujące przez 16, 24 i 40 godzin (punkty czasowe pamięci asocjacyjnej długotrwałej) w temperaturze 20oC (Ryc. 1C).
    Uwaga: Pamięć asocjacyjna długotrwała u zwierząt typu dzikiego kończy się do 40 h po treningu. Punkty czasowe mogą wymagać dostosowania do różnych genotypów lub warunków.
12. Aby przetestować pamięć asocjacyjną długotrwałą związku pokarm-butanon, po każdym punkcie czasowym delikatnie wypłukać nicienie z płytek do stożkowej probówki 15 mL, a następnie ponownie 1-2 razy buforem M9. Wykorzystać nicienie do testów chemotaksji (sekcja 5). Indeks uczenia się (LI) = CI_{Time point} - CI_Naive.
    Uwaga: Należy stosować delikatne metody płukania opisane w sekcji 2. Dla każdego punktu czasowego należy usunąć wszelkie nadmiarowe nicienie niewykorzystane w testach chemotaksji.

5. Test chemotaksji

1. Przygotuj płytki do testu chemotaksji. Oznacz spód niezasiane szalki NGM o średnicy 100 mm z plamkami na dnie i po każdej stronie szalki (rycina 2A).
   Uwaga: Aby uzyskać statystycznie istotne wyniki, należy przeprowadzić co najmniej 3 powtórzenia dla każdego genotypu.
2. Miejsce 1 μL 1 M NaN₃ w miejscu z substancją zapachową oraz w punkcie kontrolnym (Ryc. 2B).
   Uwaga: Nie należy nanosić tego środka paraliżującego na płytki wcześniej niż 15 minut przed rozpoczęciem analizy, w przeciwnym razie NaN₃ będą dyfundować poza plamki, a zwierzęta zostaną sparaliżowane przed dotarciem do plamek z substancją zapachową lub kontrolnych. Należy uważać, aby nie przebić agaru podczas aplikowania NaN₃ ponieważ dżdżownice będą zagryzać się w miejscach nakłuć.
3. Podczas gdy nicienie osadzają się w probówce stożkowej po kilku przemyciach buforem M9 (Sekcja 2), nanieś 1 μNanieś po 1 µL 95% EtOH oraz 10% butanonu (patrz sekcja 7.2) w odpowiednich miejscach na oznakowanej płytce testowej (rycina 2C), na wcześniej naniosiony NaN3.
   Uwaga: Odczynniki chemiczne należy nanieść przed dodaniem nicieni (rozdział 5.4). Należy odnotować, w których miejscach naniesiono EtOH lub butanon. Podczas pracy z tymi lotnymi substancjami należy zachować ostrożność i otwierać pokrywy szalek tylko wtedy, gdy jest to konieczne, a w pozostałym czasie utrzymywać je zamknięte.
4. Usuń z probówki z osadzonymi nicieniami jak największą ilość buforu M9. Używając pipety P20 z przyciętym końcem (patrz sekcja 7.3), nanieś 3 x 5 μPrzenieś robaki w stadium L (200–400 osobników) do punktu początkowego oznaczonej płytki do testów (Rysunek 2D).
   Uwaga: Pozostałe nicienie należy pozostawić w stożkowej probówce 15 ml do wykorzystania w testach głodzenia wstępnego oraz testach pamięci (rozdziały 2-4). Nicienie przyklejają się do wnętrza końcówek pipet, dlatego przenoszenie ich na płytkę w mniejszych ilościach pozwala zachować populację nicieni i ogranicza ilość cieczy uwalnianej wraz z nimi na płytkę testową.
5. Skręć róg chusteczki KimWipe w mały czubek i użyj go do odsączenia nadmiaru buforu M9. Spowoduje to uwolnienie nicieni na płytkę do analizy (rycina 2E).
   Uwaga: Należy uważać, aby nie przebić agaru chusteczką KimWipe, w przeciwnym razie nicienie mogą zakopać się w miejscu startu. Na tym etapie część nicieni może zostać utracona, ponieważ zostaną wciągnięte w chusteczkę KimWipe wraz z buforem M9 podczas osuszania. W przypadku wykorzystania obrazowania i analizy do zliczania nicieni (Rozdział 6), należy przenieść płytki na stanowisko obrazowania przed zwolnieniem nicieni z miejsca startu. Obraz nicieni w miejscu startu bezpośrednio po ich zwolnieniu pozwoli określić całkowitą liczbę zwierząt na płytce testowej.
6. Inkubować płytkę do testu chemotaksji przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
7. Należy policzyć liczbę nicieni w punkcie początkowym oraz w plamach z EtOH i butanonem (rycina 2), a także całkowitą liczbę nicieni na płytce testowej.
   Uwaga: Zazwyczaj nicienie sparaliżowane przez NaN₃ znajdą się w promieniu około 1 cm od plam i będą ustawione w liniach prostych, przy czym wiele zwierząt będzie stłoczonych obok siebie. W przypadku użycia oprogramowania do obrazowania i analizy w celu policzenia nicieni (Sekcja 6), należy wykonać zdjęcia punktu startowego oraz plam z EtOH i butanonem. Zdjęcie całkowitej liczby nicieni powinno zostać wykonane w Sekcji 5.5. Nicienie można również policzyć ręcznie.
8. Oblicz „wskaźnik chemotaksji” (CI). CI = ([(n_Butanon)-(n_EtOH)]/[(Suma-n_Pochodzenie)].

6. Liczenie nicieni za pomocą analizy obrazu

1. Wykonaj wysokokontrastowe czarno-białe zdjęcia nicieni na płytkach do testu chemotaksji (Rysunek 3A, opis konfiguracji kamery znajduje się w sekcji 7.4). Aby obliczyć indeks chemotaksji, na koniec testu wymagane są zdjęcia punktów z butanonem, EtOH oraz punktu startowego na płytce do testu chemotaksji, a także całkowita liczba nicieni (zdjęcie nicieni w punkcie startowym bezpośrednio po ich uwolnieniu z buforu M9 na początku testu, sekcja 5.5).
   Uwaga: Zdjęcia płytek do testu chemotaksji obejmujące promień około 2 cm wokół każdego punktu zazwyczaj pozwalają zarejestrować wszystkie zwierzęta w każdym z tych punktów.
2. Upewnij się, że pliki dla wszystkich prób z jednego punktu czasowego (np. Naive, 0 hr itd.) znajdują się w jednym, odpowiednio nazwanym folderze.
3. Pliki dla każdej płytki do chemotaksji muszą być nazwane w następujący sposób: but#.png (punkt butanonu, próba #), ori#.png (punkt startowy, próba #), eth#.png (punkt etanolu, próba #), tot#.png (łącznie, próba #). (Na przykład, jeśli dla danego punktu czasowego przeprowadzono dwie próby, w tym samym folderze będą znajdować się następujące pliki: but1.png, but2.png, eth1.png, eth2.png, ori1.png, ori2.png, tot1.png, tot2.png)
4. Otwórz program Matlab (patrz sekcja 7.5).
5. W linii „Current Directory” na górze okna Matlab przejrzyj foldery i wybierz folder „count_worms_v0.5.3” (pliki M dostępne jako informacje uzupełniające).
6. W „Command Window” wpisz „count_worms_directory().” Naciśnij Enter.
   Uwaga: Domyślny rozmiar nicienia dla tej komendy wynosi od min 10 do max 80 pikseli. Aby dostosować te wartości w zależności od konkretnego genotypu lub stadium rozwojowego, wpisz „count_worms_directory ('minsize',10,'maxsize', 80)” i odpowiednio zmień liczbę pikseli.
7. Po wyświetleniu prośby wybierz folder z obrazami do analizy.
   Uwaga: W jednym czasie można analizować tylko jeden folder obrazów.
8. Każdy obraz w analizowanym folderze zostanie wyświetlony z już ustawionym progiem i zaznaczonymi cząstkami (Rysunek 3A). Przeciągnij narzędzie prostokąta nad zaznaczone cząstki, które nie są nicieniami, aby je usunąć. Po zakończeniu obróbki obrazu naciśnij klawisz Esc.
9. Po sprawdzeniu wszystkich obrazów w folderze w oknie Command Window pojawią się 4 kolumny: (1) nazwa obrazu (np. but1); (2) zawsze „[1];” (3) średnia wielkość pikseli dla jednego nicienia obliczona przez program dla danego obrazu; oraz (4) liczba nicieni obliczona dla tego obrazu.
10. Po zakończeniu działania programu w folderze z analizowanymi obrazami zostaną zapisane dwa pliki .csv (można je otwierać jako arkusze Excel). Plik „worm_counts_stats” zawiera kolumny wynikowe widoczne w oknie Command Window (sekcja 6.9). Plik „worm_counts_summary” zawiera 5 kolumn: (1) numer próby; liczbę nicieni w (2) punkcie but, (3) eth oraz (4) ori; oraz (5) całkowitą liczbę nicieni.

7. Uwagi dotyczące materiałów

1. Aby przygotować płytki z pożywką do wzrostu o wysokiej zawartości składników (HGM) (Sekcja 1): Rozpuścić 3 g NaCl, 20 g Bactopeptone oraz 30 g Bacto-agar w 700 mL wody destylowanej. Uzupełnić objętość do 1 L wodą destylowaną. Po autoklawowaniu schłodzić agar do 65oC i dodać 4 mL cholesterolu 5 mg/mL w etanolu, po 1 mL 1 M CaCl₂ i 1 M MgSO₄ oraz 25 mL 1 M KPO₄ (pH = 6.0).
2. Stosuje się 95% EtOH, ponieważ EtOH o wyższym stężeniu ma tendencję do zawierania zanieczyszczeń z procesu oczyszczania, które mogą wpływać na wyniki. Zaleca się przygotowywanie świeżego roztworu roboczego 10% butononu (w 95% EtOH) co kilka serii analiz.
3. W końcówkach P20 należy odciąć kilka milimetrów, aby utworzyć otwór wystarczająco duży, by nicienie mogły przez niego przejść bez uszkodzeń. Końcówki P1000 posiadają otwory wystarczająco duże dla nicieni.
4. Stacja obrazowania płytek do testu chemotaksji (Rysunek 3B) w laboratorium Murphy'ego zawiera kamerę Firewire z obiektywem o zmiennym powiększeniu zamocowanym na wysięgniku. Podstawę statywu stanowi podświetlenie od tyłu, umieszczone pod specjalną platformą obrazującą z szklanym blatem (Rysunek 3C), co umożliwia oświetlenie płytek do testu chemotaksji od dołu. Do przechwytywania obrazów wykorzystywane jest oprogramowanie „Measurement and Automation” (National Instruments). Materiały użyte do konfiguracji tej stacji obrazowania są podobne do wcześniej opublikowanych¹² i znajdują się w Tabeli specyficznych odczynników i sprzętu.

8. Reprezentatywne wyniki:

Typowy naiwny indeks chemotaksji (CI) dla nicieni typu dzikiego w przypadku 10% butononu wynosi około 0,2 (Rysunek 4A).⁶ Trening skumulowany (1x) lub rozłożony w czasie (7x) zazwyczaj zwiększa indeks chemotaksji do 0,7-0,8 w czasie 0 (Rysunek 4A, C-D), co daje indeks uczenia się (LI = CI po treningu - CI naiwny) wynoszący ~0,6.⁶ Uczenie się zachodzące podczas treningu skumulowanego lub rozłożonego w czasie jest bardzo trwałe. LI mniejszy niż 0,5 pojawia się zazwyczaj w przypadku problemów z naiwnym testem chemotaksji, gdy zwierzęta wykazują naiwny CI równy 0,3 lub wyższy. Zwykle dzieje się tak, ponieważ nicienie głodują lub są zbyt gęsto rozmieszczone na płytkach hodowlanych pomiędzy wybielaniem a rozpoczęciem testu, albo nicienie zbyt długo pozostają w buforze M9 pomiędzy płukaniami i zaczynają głodować; zapachy środowiskowe mogą również zwiększyć naiwny CI. Głodne nicienie mają znacznie wyższy naiwny CI dla 10% butononu (Rysunek 4B).⁶ Stwierdziliśmy, że problemy z naiwną chemotaksją są zazwyczaj rozwiązywane poprzez poprawę opieki nad nicieniami i sposobu ich hodowli.

Czas trwania pamięci w tych testach to czas, po którym indeks chemotaksji bezpośrednio po treningu powraca do poziomów charakterystycznych dla osobników naiwnych, gdy indeks uczenia się = 0. U zwierząt typu dzikiego krótkotrwała pamięć asocjacyjna zazwyczaj zaczyna zanikać po 1 godzinie od treningu skumulowanego, trwa około 2 godzin i jest niezależna od czynnika transkrypcyjnego CREB (Rycina 4C).⁶ Długotrwała pamięć asocjacyjna zazwyczaj nie zaczyna znacząco zanikać aż do 16 godzin po treningu rozłożonym w czasie, trwa do 40 godzin i jest zależna od CREB (Rycina 4D).⁶ Długotrwała pamięć asocjacyjna może nie osiągnąć pełnego potencjału w kilku przypadkach: (1) nicienie nie mają wystarczającej ilości E. coli OP50 podczas 30-minutowych okresów warunkowania; (2) bakterie pozostają w buforze M9 podczas okresów głodzenia; lub (3) nicienie zostają uszkodzone podczas testu (np. poprzez pipetowanie nicieni o ściankę probówki).

Wyniki są zazwyczaj istotne statystycznie, gdy dla każdego genotypu w każdym punkcie czasowym przeprowadza się 4 lub więcej prób testu chemotaksji. Wykonanie sześciu powtórzeń na genotyp zazwyczaj daje bardzo istotne wyniki, nie stając się przy tym zbyt obciążające; jednak osoby początkujące mogą chcieć zacząć od zaledwie trzech powtórzeń. Zazwyczaj praca z 2-3 genotypami lub warunkami jednocześnie jest komfortowa dla osób doświadczonych w przeprowadzaniu tych testów uczenia się i pamięci.

Ręczne liczenie nicieni na płytkach do testów chemotaksji jest bardzo czasochłonne, może wprowadzać zmienność między eksperymentami lub osobami pracującymi w laboratorium, a także może prowadzić do błędów systematycznych podczas analizy i interpretacji danych. Liczenie nicieni za pomocą analizy obrazu (Sekcja 6) standaryzuje gromadzenie i analizę danych w całym laboratorium i średnio skraca czas analizy danych dla doświadczonych członków zespołu do 1/5 czasu wymaganego przy liczeniu ręcznym. Porównując indeksy chemotaksji obliczone na podstawie ręcznego liczenia nicieni z tymi wyznaczonymi przez oprogramowanie Count_worms, stwierdzono średni błąd na poziomie 3,07 (± 1,19)%.

Dzień 1
Czas	Krok
9:00	1 h głodzenia w buforze M9 Rozpoczęcie naiwnego testu chemotaksji
10:00	Warunek nr 1 (płytki NGM 60 mm z pożywką i butononem), 30 min Zakończenie naiwnego testu chemotaksji
10:30	Głodzenie nr 1 (płytki NGM 60 mm), 30 min
11:00	Warunek nr 2, 30 min
11:30	Głodzenie nr 2, 30 min
12:00	Warunek nr 3, 30 min
12:30	Głodzenie nr 3, 30 min
1:00	Warunek nr 4, 30 min
1:30	Głodzenie nr 4, 30 min
2:00	Warunek nr 5, 30 min
2:30	Głodzenie nr 5, 30 min
3:00	Warunek nr 6, 30 min
3:30	Głodzenie nr 6, 30 min
4:00	Warunek nr 7, 30 min
4:30	Rozpoczęcie 0-godzinnego testu chemotaksji Przeniesienie pozostałych nicieni na płytki podtrzymujące na 16–40 h
5:30	Zakończenie 0-godzinnego testu chemotaksji
Dzień 2
Czas	Krok
8:30	Rozpoczęcie 16-godzinnego testu chemotaksji
9:30	Zakończenie 16-godzinnego testu chemotaksji

Tabela 1. Reprezentatywny harmonogram testu długotrwałej pamięci asocjacyjnej. W tym przykładzie test rozpoczyna się w Dniu 1 o godzinie 9:00 od 1-godzinnego głodzenia. 30-minutowe okresy warunkowania i głodzenia następują naprzemiennie, aż do momentu siedmiokrotnego uwarunkowania nicieni. Testy chemotaksji są przeprowadzane na początku (naiwne) i na końcu (0 hr) treningu. Całkowity czas trwania od początku do końca wynosi 8,5 godziny. Nicienie na płytkach przechowawczych są testowane pod kątem chemotaksji do butanonu począwszy od Dnia 2, od 16 do 40 godzin po treningu.

Rysunek 1. Schemat badania pamięci asocjacyjnej krótkotrwałej i długotrwałej. (A) Zalecany harmonogram przygotowań poprzedzających dzień wykonania testów. (B) Badanie pamięci asocjacyjnej krótkotrwałej: Głodzone nicienie są warunkowane przez 1 godzinę, a następnie natychmiast testowane pod kątem jednorazowej nauki (0 min.) za pomocą testów chemotaksji lub przenoszone na płytki utrzymujące z pożywką na 0,5, 1 lub 2 godziny po warunkowaniu. (C) Badanie pamięci asocjacyjnej długotrwałej: Głodzone zwierzęta przechodzą 7 bloków treningowych warunkowania/głodzenia przed testem na naukę lub LTAM 16–40 godzin po treningu.

Rycina 2. Układ testu chemotaksji. (A) Schemat płytki do testu chemotaksji. Małe kropki nanosi się na płytkę za pomocą linijki lub innego urządzenia prowadzącego, aby zaznaczyć punkt startowy (dół) oraz miejsca na butanon i EtOH (lewa i prawa strona) na płytce. (B) Do punktów butanonu i EtOH dodaje się 1 μL NaN₃. (C) Do punktów po lewej lub prawej stronie płytki dodaje się po 1 μL 10% butanonu oraz 95% EtOH. (D) Do punktu startowego na płytce dodaje się 200-400 nicieni zawieszonych w buforze M9. (E) Chusteczkę KimWipe skręconą w szpic wykorzystuje się do wchłonięcia buforu M9 i zwolnienia nicieni na płytkę testową.

Rysunek 3. Liczenie nicieni za pomocą analizy obrazu. (A) Przykład okna wyboru cząstek obrazu w programie „count_worms_v0.5.3”. Program otwiera oryginalny, wysokokontrastowy obraz czarno-biały (po lewej), a następnie automatycznie wyświetla okno z obrazem po zastosowaniu progu (środek). Narzędzie prostokąta można wykorzystać do zaznaczenia i usunięcia niepożądanych „cząstek” niebędących nicieniami, takich jak oznaczenia płytki testowej (1), krawędzie płytki (2) lub nakłucia agaru (3). (B) Zdjęcie stacji obrazowania do testów chemotaksji w laboratorium Murphy’ego. Płytki z testami chemotaksji są oświetlone od dołu, aby uzyskać wysokokontrastowe obrazy niezbędne do analizy. (C) Schemat niestandardowej platformy obrazowania wykorzystywanej w stacji obrazowania chemotaksji.

Rysunek 4. Typowe wyniki uczenia się asocjacyjnego i pamięci. (A) Wskaźnik chemotaksji naiwnych nicieni typu dzikiego w kierunku 10% butanonu wzrasta po treningu masowym (1x). Wyuczona asocjacja wymaga sparowania pokarmu (OP50 E. coli) z butanonem. Liczby nad słupkami reprezentują „wskaźnik uczenia się” (LI = CITrained - CI_Naive). (B) Chemotaksja naiwnych nicieni typu dzikiego w kierunku 10% butanonu jest znacznie zwiększona, gdy nicienie są głodzone przez 16 godzin. Panele A-D zostały zaadaptowane z Kauffman et al., 2010.⁶ (C) Krótkotrwała pamięć asocjacyjna typu dzikiego trwa około 2 godzin i jest niezależna od czynnika transkrypcyjnego CREB. (D) Długotrwała pamięć asocjacyjna typu dzikiego trwa około 40 godzin i jest zależna od CREB.

Informacje uzupełniające

• Kliknij tutaj, aby pobrać plik „imoverlay.m”.
• Kliknij tutaj, aby pobrać plik „count_worms_image.m”.
• Kliknij tutaj, aby pobrać plik „count_worms_directory.m”.
• Kliknij tutaj, aby pobrać plik „cellwrite.m”.

Dyskusja

Przedstawione tutaj testy uczenia asocjacyjnego i pamięci węchowej u C. elegans pozwalają rozróżnić procesy uczenia skumulowanego, uczenia rozproszonego, pamięci krótkotrwałej oraz pamięci długotrwałej. Testy te opierają się na zdolności nicieni do wykrywania pożywienia i zapachów chemicznych w ich środowisku^1,2 oraz tworzenia pozytywnych skojarzeń między nimi.⁶ W związku z tym testy są bardzo wrażliwe na głodowanie w początkowej populacji zwierząt, dlatego należy zachować szczególną ostrożność, aby zapewnić odpowiednie odżywienie nicieni przed i po treningu. Pojedynczy trening skumulowany prowadzi do powstania krótkotrwałej pamięci asocjacyjnej. Zwiększona liczba okresów warunkowania oraz paradygmat uczenia rozproszonego są kluczowe dla osiągnięcia długotrwałej pamięci asocjacyjnej u C. elegans, podobnie jak u innych organizmów.^6,8 Być może test ten można zmodyfikować w celu wywołania długotrwałych wspomnień asocjacji między różnymi bodźcami warunkowanymi i bezwarunkowymi.

Nasze testy uczenia się asocjacyjnego i pamięci mogą być wykorzystane do porównania zdolności uczenia się i pamięci zwierząt typu dzikiego z osobnikami starzejącymi się lub mutantami genetycznymi. Na przykład, podczas gdy zarówno zdolność uczenia się asocjacyjnego, jak i długotrwała pamięć asocjacyjna spadają wraz z wiekiem u nicieni typu dzikiego, uczenie się jest zachowane dłużej u zwierząt z osłabionym sygnalizowaniem insulinowym, a uczenie się i pamięć są zachowane dłużej u zwierząt poddanych restrykcji kalorycznej.⁶ Testy te są również odpowiednie do stosowania RNAi lub manipulacji farmakologicznych u C. elegans. Przykładowo, traktowanie nicieni RNAi przeciwko daf-2 poprawia krótkotrwałą i długotrwałą pamięć asocjacyjną; przeciwnie, blokowanie transkrypcji genów i syntezy białek za pomocą leków (odpowiednio aktynomycyny D i cykloheksymidu) podczas treningu z odstępami czasowymi zaburza formowanie pamięci długotrwałej.⁶

Pamięć długotrwała jest procesem kluczowym dla przetrwania wszystkich zwierząt i wydaje się, że znaczna część mechanizmów molekularnych zaangażowanych w pamięć asocjacji pawłowowskiej jest zachowana od nicieni po ssaki.⁶ Zdolność do rozróżniania i testowania uczenia się asocjacyjnego oraz pamięci krótkoterminowej i długoterminowej przy użyciu tych testów olfaktorycznych sprawia, że C. elegans jest doskonałym systemem do dalszych badań nad pamięcią i może dostarczyć wiedzy na temat procesów neurodegeneracyjnych prowadzących do utraty zdolności uczenia się i pamięci u ludzi.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Azydek sodu	Fisher Scientific	S227	Przygotować stężenie 1 M w wodzie destylowanej
Alkohol etylowy 190 Proof	Pharmco-AAPER	DSP-CT-18	>95% etanolu może zawierać zanieczyszczenia zakłócające testy chemotaksji
2-butanony 99+%	Acros Organics	14967-0010
Kamera CMOS do skanowania obszarów Basler IEEE-1394/FireWire	Edmund Scientific	NT56-683
Obiektyw wideo InfiniMite – Alpha Industrial	Edmund Scientific	NT56-202
Oświetlacz światłowodowy Dolan-Jenner MI-150	Edmund Scientific	NT55-718
Podświetlenie 8” x 8”	Schott AG	A08927
Standardowy statyw wysięgnikowy	Edmund Scientific	NT54-120
Adapter słupa 3/4” do statywów wysięgnikowych	Edmund Scientific	NT54-124
Standardowa stała płyta montażowa 1/4-20	Edmund Scientific	NT54-122