W niniejszym opracowaniu opisujemy metody testowania uczenia się warunkowego oraz krótkotrwałej i długotrwałej pamięci asocjacyjnej u C. elegans. Te populacyjne testy wykorzystują zdolność nicieni do chemotaksji w kierunku lotnych substancji zapachowych oraz tworzenie pozytywnych skojarzeń poprzez parowanie pożywienia z chemoatraktantem, jakim jest butanon. Zwiększenie liczby okresów warunkowania indukuje pamięć długotrwałą.
Artykuł metodologiczny
C. elegans: testy uczenia się pozytywnego względem butanonu oraz testy krótkotrwałej i długotrwałej pamięci asocjacyjnej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Pamięć doświadczeń i nabytych informacji jest kluczowa dla organizmów w podejmowaniu decyzji sprzyjających ich przetrwaniu. C. elegans porusza się w swoim środowisku dzięki specyficznej dla neuronów detekcji pożywienia i zapachów chemicznych1, 2, a także potrafi powiązać stany odżywcze z zapachami chemicznymi3, temperaturą4 oraz patogennością źródła pożywienia5.
W niniejszej pracy opisujemy testy uczenia się asocjacyjnego oraz krótkoterminowej i długoterminowej pamięci asocjacyjnej u C. elegans. Zmodyfikowaliśmy paradygmat uczenia się zapachowego o charakterze awersyjnym6, aby zamiast tego wywołać reakcję pozytywną; test polega na zagłodzeniu około 400 nicieni, a następnie karmieniu ich w obecności lotnego chemoatraktanta, butanonu, wykrywanego przez neurony AWC, w stężeniu wywołującym niski indeks chemotaktyczny (podobnie jak u Toroyamy et al.7). Standardowy test chemotaksji populacyjnej1 służy do oceny atrakcyjności substancji zapachowej dla nicieni bezpośrednio lub od kilku minut do kilku godzin po warunkowaniu.
Po uwarunkowaniu chemotaksja zwierząt typu dzikiego w stronę butanonu wzrasta o około 0,6 jednostki indeksu chemotaksji, co stanowi ich „indeks uczenia się”. Uczenie asocjacyjne jest zależne od obecności zarówno pokarmu, jak i butanonu podczas treningu. Parowanie pokarmu z butanonem w jednym okresie uwarunkowania („trening skumulowany”) prowadzi do powstania krótkotrwałej pamięci asocjacyjnej, która utrzymuje się przez około 2 godziny. Wielokrotne okresy uwarunkowania z przerwami odpoczynkowymi pomiędzy nimi („trening rozłożony w czasie”) skutkują powstaniem długotrwałej pamięci asocjacyjnej (<40 godzin) i jest procesem zależnym od białka CREB (cAMP Response Element Binding protein),6 czynnika transkrypcyjnego niezbędnego do tworzenia pamięci długotrwałej u wielu gatunków.8
Nasz protokół obejmuje również metody analizy obrazu w celu szybkiego i dokładnego wyznaczenia indeksów chemotaksji. Obrazy zwierząt na płytkach do testów chemotaksji o wysokim kontraście są rejestrowane i analizowane przez oprogramowanie do liczenia nicieni w środowisku MatLab. Oprogramowanie koryguje nierównomierne tło, stosując morfologiczną transformację top-hat.9 Następnie wykorzystuje się metodę Otsu do wyznaczenia progu oddzielającego nicienie od tła.10 Bardzo małe cząsteczki są usuwane automatycznie, a większe obszary niebędące nicieniami (krawędzie płytki lub otwory w agarze) są usuwane poprzez ręczny wybór. Oprogramowanie szacuje następnie rozmiar pojedynczego nicienia, pomijając obszary przekraczające określoną maksymalną wielkość i przyjmując medianę rozmiaru pozostałych obszarów. Liczbę nicieni szacuje się następnie poprzez podzielenie całkowitego obszaru zidentyfikowanego jako zajęty przez nicienie przez szacowany rozmiar pojedynczego nicienia.
Stwierdziliśmy, że uczenie się oraz pamięć krótkotrwała i długotrwała mogą być odróżnione i że procesy te dzielą podobne kluczowe cząsteczki z organizmami wyższymi.6,8 Nasze testy pozwalają na szybką weryfikację nowych genów kandydatów lub cząsteczek wpływających na uczenie się oraz pamięć krótkotrwałą lub długotrwałą u C. elegans, które są istotne w obrębie wielu gatunków.
Protokół
Te testy uczenia asocjacyjnego i pamięci u C. elegans wymagają wcześniejszego przygotowania. Sugerowany harmonogram przygotowań przedstawiono na osi czasu na rysunku 1A. Należy również pamiętać, że pamięć nicieni może zostać zaburzona przez wstrząsy mechaniczne (gwałtowne pipetowanie, wirowanie, mieszanie w wirówce), a naiwna chemotaksja może zostać zakłócona przez nadmiar zapachów (perfumy itp.) w otoczeniu.
1. Przygotowanie zwierząt do analizy
- Hodować nicienie na płytkach z pożywką wysokorosnącą (HGM) o średnicy 100 mm (przepis znajduje się w sekcji 7.1) zaszczepionych 1 mL E. coli szczepu OP50, stosując standardowe metody.11
- Przeprowadzić traktowanie podchlorynem co najmniej dwóch gęsto zasiedlonych płytek HGM z dorosłymi nicieniami w stadium grawidnym, aby uzyskać dużą zsynchronizowaną populację jaj.
Uwaga: Aby uzyskać najlepsze wyniki, należy poddać działaniu wybielacza pierwsze pokolenie w celu uzyskania silnie zsynchronizowanej populacji, a następnie poddać działaniu wybielacza drugie pokolenie w drugim dniu stadium dorosłego (Day 2 adults), aby uzyskać jaja do kolejnego kroku. - Równomiernie rozdzielić jaja na 3-4 płytki HGM zaszczepione 1 mL E. coli OP50 dla każdej płytki poddanej traktowaniu podchlorynem.
Uwaga: Ważne jest, aby nicienie były hodowane z obfitym dostępem do świeżej pożywki, ponieważ głodzenie może wpłynąć na wyniki testów węchowych. - Inkubować nicienie w temperaturze 20oC przez około 72 godziny, czyli przez czas potrzebny zwierzętom do osiągnięcia stadium młodych osobników dorosłych.
2. Głodzenie wstępne (prekondycjonowanie)
- Ponownie sprawdź płytki HGM z młodymi osobnikami dorosłymi, aby upewnić się, że nicienie wciąż mają pod dostatkiem pożywienia oraz że liczba nicieni jest wystarczająca do przeprowadzenia testu (≥ 200 nicieni na płytkę testową).
- Zmyj nicienie z płytek HGM buforem M911 do stożkowej probówki 15 mL. Aby zminimalizować stres podczas płukania, delikatnie nanieś bufor M9, wlewając kilka mililitrów na płytkę HGM, a następnie ostrożnie zakręć płytką, aby uwolnić nicienie z lepkich bakterii OP50. Następnie przechyl płytkę, pobierz mieszaninę buforu M9 i nicieni z narożnika płytki za pomocą pipety P1000 i przenieś nicienie do stożkowej probówki 15 mL. Jeśli na płytce wciąż znajdują się nicienie, powtórz ten krok 1-2 razy.
Uwaga: Gwałtowne płukanie powoduje odrywanie się bakterii od płytki, które mogą przedostać się do probówki z nicieniami. Bakterii tych nie da się usunąć, a mogą one zakłócać wyniki testów. NIE pipetuj nicieni o ściankę probówki, ponieważ może to uszkodzić organizmy i wpłynąć na wyniki testów. - Pozostaw nicienie do osiadania pod wpływem grawitacji (NIE wiruj). Usuń nadosad prawie za pomocą odsysacza i przemyj co najmniej 3-4 mL buforu M9. Powtórz czynność 2 razy, aby łącznie przeprowadzić 3 płukania.
Uwaga: Wirowanie podczas płukania spowoduje opadanie wszelkich pozostałych bakterii do populacji nicieni, co może zakłócić wyniki testów. Zamiast tego, podczas kolejnych płukań delikatnie dodawaj bufor M9, wlewając go bezpośrednio do stożkowej probówki 15 mL. Nicienie osiadłe na dnie probówki powinny wymieszać się z buforem M9 po jego dodaniu. Jeśli nicienie pozostaną osiadłe, delikatnie odwróć probówkę, aby je wymieszać. - Po trzecim płukaniu wykorzystaj część populacji nicieni do naiwnych testów chemotaksji (Sekcja 5).
Uwaga: Kluczowe jest sprawne działanie na wszystkich etapach płukania, ponieważ nicienie zaczną głodować, jeśli pozostaną zbyt długo w buforze M9, co może nasilić naiwną chemotaksję w kierunku butanonu. - Dodaj 3-4 mL buforu M9 do stożkowej probówki 15 mL i pozostaw nicienie do głodzenia w buforze M9 w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę (Rysunek 1B, C).
3. Trening pamięci asocjacyjnej krótkotrwałej (skumulowanej)
Schemat badania krótkotrwałej pamięci asocjacyjnej przedstawiono na rysunku 1B.
- Po zakończeniu okresu głodzenia w buforze M9 (Sekcja 2), nanieś smugą 2 μL 10% butononu (w 95% EtOH) na wewnętrzną stronę pokrywek płytek z pożywką dla nicieni NGM11 o średnicy 60 mm, na które zaszczepiono 500 μL E. coli OP50.
Uwaga: Dobrą populacją startową dla testów pamięci krótkotrwałej i długotrwałej jest ≥ 500 μL nicieni. Na każdy genotyp wymaganych jest kilka płytek warunkujących, aby utrzymać całą populację podczas treningu. Podczas pracy z substancjami lotnymi otwieraj pokrywki płytek tylko wtedy, gdy jest to konieczne, pozostawiając je zamknięte w pozostałym czasie. - Usuń nadsącz z buforu M9 z 15 mL probówki stożkowej z głodzącymi się nicieniami za pomocą odsysania próżniowego i za pomocą pipety P1000 przenieś 100-200 μL nicieni na płytki warunkujące.
Uwaga: Staraj się usunąć jak najwięcej cieczy M9, aby nicienie mogły szybko dotrzeć do źródła pokarmu OP50 po przeniesieniu na płytki warunkujące. Nicienie przylegają do wnętrza końcówki pipety i można je zachować, pipetując mniejsze objętości. - Inkubuj płytki warunkujące w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę (Rysunek 1B).
- Zmyj nicienie z płytek za pomocą ~1 mL buforu M9 do 15 mL probówki stożkowej. Pozostaw nicienie do osadzenia grawitacyjnego. Przemyj ponownie 1-2 razy, aż bufor M9 w probówce będzie klarowny.
Uwaga: Stosuj łagodne metody mycia opisane w Sekcji 2. Można użyć tej samej 15 mL probówki stożkowej, co w Sekcji 2. - Po ostatnim myciu usuń nadsącz z buforu M9 za pomocą odsysania próżniowego i wykorzystaj część populacji nicieni do testów chemotaksji (Sekcja 5), aby sprawdzić 1x (masowe) uczenie się asocjacyjne związku pokarm-butonon bezpośrednio po warunkowaniu (punkt czasowy 0 minut).
Indeks uczenia się (LI) = CI0 hr - CINaive. - Przenieś pozostałą populację nicieni na płytki NGM o średnicy 60 mm zaszczepione 500 μL OP50 (płytki utrzymujące). Ponownie nanieś 100-200 μL nicieni na płytkę, aby zapewnić wystarczającą ilość bakterii do utrzymania populacji.
Uwaga: Liczba płytek utrzymujących użytych na genotyp jest co najmniej równa liczbie punktów czasowych pamięci asocjacyjnej krótkotrwałej, które mają zostać przetestowane. - Inkubuj płytki powarunkujące przez 0,5, 1 lub 2 godziny (punkty czasowe pamięci asocjacyjnej krótkotrwałej) w temperaturze pokojowej (Rysunek 1B).
Uwaga: Krótkotrwała pamięć asocjacyjna u zwierząt typu dzikiego kończy się do 2 godzin po treningu. Punkty czasowe mogą wymagać dostosowania dla różnych genotypów lub warunków. - Aby przetestować krótkotrwałą pamięć asocjacyjną związku pokarm-butonon, po każdym punkcie czasowym delikatnie zmyj nicienie z płytek do 15 mL probówki stożkowej i ponownie 1-2 razy buforem M9. Wykorzystaj nicienie do testów chemotaksji (Sekcja 5). Indeks uczenia się (LI) = CITime point - CINaive.
Uwaga: Stosuj łagodne metody mycia opisane w Sekcji 2. Dla każdego punktu czasowego utylizuj wszelkie nadmiarowe nicienie, które nie zostały wykorzystane w testach chemotaksji.
4. Trening długotrwałej pamięci asocjacyjnej (rozłożony w czasie)
Schemat badania pamięci asocjacyjnej długotrwałej przedstawiono na Rysunku 1C.
- Należy postępować zgodnie z krokami 3.1-3.2 w Sekcji 3.
- Inkubować płytki kondycjonujące w temperaturze pokojowej przez 30 minut (Rysunek 1C).
- Należy postępować zgodnie z krokiem 3.4 w Sekcji 3.
Uwaga: Aby zmieścić się w 30-minutowym przedziale czasowym, można rozpocząć wszystkie płukania podczas treningu w ~25 minucie. - Po ostatnim płukaniu usunąć nadsącz M9 za pomocą odsysacza i przenieść nicienie na niezasiane płytki NGM 60 mm.
Uwaga: Na tym etapie nie jest wymagane użycie wielu płytek na genotyp, ponieważ nicienie są poddawane głodzeniu. - Głodzić na płytkach NGM 60 mm w temperaturze pokojowej przez 30 minut (Rysunek 1C).
- Wypłukać nicienie buforem M9 do stożkowej probówki 15 mL. Pozostawić nicienie do osadzenia grawitacyjnego (NIE wirować).
Uwaga: Choć na tym etapie w buforze nie powinno być bakterii, wirowanie może być zabiegiem potencjalnie szkodliwym dla nicieni i może zaburzyć formowanie pamięci długotrwałej. - Powtórzyć kroki 4.1-4.6 kilkakrotnie, aż do czasu wykonania łącznie 7 bloków kondycjonujących i 6 bloków głodzenia (Rysunek 1C). (Zob. Tabelę 1 w celu zapoznania się z przykładowym harmonogramem czasowym).
- Ostrożnie wypłukać nicienie z płytek do stożkowej probówki 15 mL, a następnie ponownie 1-2 razy buforem M9.
- Po ostatnim płukaniu wykorzystać część populacji nicieni do testów chemotaksji (Sekcja 5), aby sprawdzić 7-krotne (rozłożone w czasie) uczenie się asocjacyjne związku pokarm-butanon bezpośrednio po kondycjonowaniu (punkt czasowy 0 h). Indeks Uczenia się (LI) = CI0 hr - CINaive.
- Przenieść pozostałą populację nicieni na płytki HGM 100 mm zasiane 1 mL OP50 (płytki podtrzymujące). Ponownie nanieść 100-200 μL nicieni na płytkę, aby zapewnić wystarczającą ilość bakterii do utrzymania populacji.
Uwaga: Liczba płytek podtrzymujących użytych na genotyp jest co najmniej równa liczbie punktów czasowych testowanych pod kątem długotrwałej pamięci asocjacyjnej. Płytki NGM 100 mm mogą być również używane jako płytki pokondycjonujące, jednak należy bardzo uważać, aby ilość OP50 była wystarczająca do utrzymania populacji nicieni przez co najmniej 16 godzin. - Inkubować płytki pokondycjonujące przez 16, 24 i 40 godzin (punkty czasowe dla długotrwałej pamięci asocjacyjnej) w 20oC (Rysunek 1C).
Uwaga: Długotrwała pamięć asocjacyjna u zwierząt typu dzikiego wygasa do 40 h po treningu. Punkty czasowe mogą wymagać dostosowania dla różnych genotypów lub warunków. - Aby sprawdzić długotrwałą pamięć asocjacyjną związku pokarm-butanon, po każdym punkcie czasowym ostrożnie wypłukać nicienie z płytek do stożkowej probówki 15 mL i ponownie 1-2 razy buforem M9. Wykorzystać nicienie do testów chemotaksji (Sekcja 5). Indeks Uczenia się (LI) = CITime point - CINaive.
Uwaga: Stosować łagodne metody płukania opisane w Sekcji 2. Dla każdego punktu czasowego usunąć wszelkie nadmiarowe nicienie, które nie zostały wykorzystane w testach chemotaksji.
5. Test chemotaksji
- Przygotuj płytki do testu chemotaksji. Oznacz spód niezasiane szalki NGM 100 mm z naniesionymi kropkami na dnie i po obu stronach szalki (Rysunek 2A).
Uwaga: Aby uzyskać statystycznie istotne wyniki, należy przeprowadzić co najmniej 3 powtórzenia dla każdego genotypu. - Plama 1 μL 1 M NaN3 w miejscu z substancją zapachową oraz w miejscu kontrolnym (Rysunek 2B).
Uwaga: Nie nanosić tego środka paraliżującego na płytki wcześniej niż 15 minut przed rozpoczęciem analizy, w przeciwnym razie NaN3 będą dyfundować z plamek, a zwierzęta zostaną sparaliżowane przed dotarciem do plamek z substancją zapachową lub kontrolnych. Należy uważać, aby nie przebić agaru podczas nakładania NaN3 ponieważ dżdżownice będą wgryzać się w miejsca nakłucia. - Podczas gdy nicienie osadzają się w probówce stożkowej po kilkukrotnym przemyciu buforem M9 (sekcja 2), nanieś 1 μL po 95% EtOH i 10% butanonu (patrz sekcja 7.2) w odpowiednich miejscach na oznakowanej płytce testowej (rycina 2C), na powierzchnię wcześniej naniesionego NaN3.
Uwaga: Odczynniki chemiczne należy nanieść przed dodaniem nicieni (rozdział 5.4). Należy odnotować, w którym miejscu znajduje się EtOH lub butanon. Podczas pracy z tymi lotnymi związkami chemicznymi należy otwierać pokrywy szalek tylko wtedy, gdy jest to konieczne, a w pozostałym czasie trzymać je zamknięte. - Usunąć z probówki z osadzonymi nicieniami jak najwięcej buforu M9. Do naniesienia 3X użyć pipety P20 z przyciętym końcem (patrz sekcja 7.3). 5 μL robaki (200–400 osobników) do punktu początkowego oznakowanej płytki testowej (rycina 2D).
Uwaga: Pozostałe nicienie należy pozostawić w stożkowatej probówce o pojemności 15 ml do wykorzystania w testach głodzenia wstępnego (Pre-conditioning Starve) oraz testach pamięci (sekcje 2–4). Nicienie przywierają do wnętrza końcówek pipet, dlatego przenoszenie ich na płytkę w mniejszych ilościach pozwala zachować populację nicieni i ogranicza ilość cieczy uwalnianej wraz z nimi na płytkę testową. - Skręć róg chusteczki KimWipe w ostry czubek i użyj go do odsączenia nadmiaru buforu M9. Spowoduje to uwolnienie nicieni na płytkę do analizy (rycina 2E).
Uwaga: Należy uważać, aby nie przebić agaru chusteczką KimWipe, w przeciwnym razie nicie mogą zakopać się w miejscu startu. Na tym etapie część zwierząt może zostać utracona, gdyż podczas osuszania zostaną one wciągnięte wraz z buforem M9 do chusteczki KimWipe. W przypadku wykorzystania obrazowania i analizy do liczenia zwierząt (Sekcja 6), należy przenieść płytki do stacji obrazowania przed uwolnieniem nicieni z miejsca startu. Obraz zwierząt w miejscu startu bezpośrednio po ich uwolnieniu pozwoli określić całkowitą liczbę osobników na płytce testowej. - Inkubować płytkę do testu chemotaksji przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
- Należy policzyć liczbę nicieni w punkcie startowym oraz w miejscach aplikacji EtOH i butanonu (rycina 2), a także całkowitą liczbę nicieni na płytce testowej.
Uwaga: Zazwyczaj nicienie sparaliżowane przez NaN3 znajdą się w promieniu około 1 cm od plamek i będą ustawione w liniach prostych, z wieloma zwierzętami zgrupowanymi jeden nad drugim. W przypadku użycia oprogramowania do obrazowania i analizy w celu zliczenia nicieni (Sekcja 6), należy wykonać zdjęcia plamek punktu startowego, EtOH oraz butanonu. Zdjęcie całkowitej liczby nicieni powinno zostać wykonane w Sekcji 5.5. Nicienie można również zliczyć ręcznie. - Oblicz „wskaźnik chemotaksji” (CI). CI = ([(nButanon)-(nEtOH)]/[(Suma-nPochodzenie)].
6. Liczenie nicieni za pomocą analizy obrazu
- Wykonaj wysokokontrastowe obrazy czarno-białe nicieni na płytkach do testu chemotaksji (Rysunek 3A, opis konfiguracji kamery znajduje się w sekcji 7.4). W celu obliczenia indeksu chemotaksji wymagane są obrazy punktów z butanonem, EtOH i punktu startowego (origin) na płytce do testu chemotaksji po zakończeniu badania, a także całkowita liczba nicieni (zdjęcie nicieni w punkcie startowym bezpośrednio po ich uwolnieniu z buforu M9 na początku badania, sekcja 5.5).
Uwaga: Obrazy płytek do testu chemotaksji obejmujące promień około 2 cm wokół każdego punktu zazwyczaj pozwalają uchwycić wszystkie zwierzęta w każdym z punktów. - Upewnij się, że pliki dla wszystkich prób jednego punktu czasowego (np. Naive, 0 hr itd.) znajdują się w jednym, odpowiednio nazwanym folderze.
- Pliki dla każdej płytki do chemotaksji muszą być nazwane w następujący sposób: but#.png (punkt butanonu, próba #), ori#.png (punkt startowy, próba #), eth#.png (punkt etanolu, próba #), tot#.png (suma, próba #). (Na przykład, jeśli dla danego punktu czasowego przeprowadzono dwie próby, w tym samym folderze znajdą się następujące pliki: but1.png, but2.png, eth1.png, eth2.png, ori1.png, ori2.png, tot1.png, tot2.png)
- Otwórz program Matlab (patrz sekcja 7.5).
- W wierszu „Current Directory” u góry okna programu Matlab przejrzyj foldery i wybierz folder „count_worms_v0.5.3” (pliki M dostępne jako informacje uzupełniające).
- W „Command Window” wpisz „count_worms_directory()”. Naciśnij Enter.
Uwaga: Domyślny rozmiar nicienia dla tej komendy to min 10, max 80 pikseli. Aby dostosować te wartości w zależności od konkretnego genotypu lub stadium rozwojowego, wpisz „count_worms_directory ('minsize',10,'maxsize', 80)” i zmień liczbę pikseli w stosowny sposób. - Po wyświetleniu prośby wybierz folder z obrazami do analizy.
Uwaga: W jednym czasie można analizować tylko jeden folder z obrazami. - Każdy obraz w analizowanym folderze pojawi się z już ustawionym progiem i zaznaczonymi cząsteczkami (Rysunek 3A). Przeciągnij narzędzie prostokąta nad zaznaczone cząsteczki, które nie są nicieniami, aby je usunąć. Po zakończeniu pracy z obrazem naciśnij klawisz Esc.
- Po sprawdzeniu wszystkich obrazów w folderze, w Command Window pojawi się 4 kolumny: (1) nazwa obrazu (np. but1); (2) zawsze „[1]”; (3) średnia wielkość pikseli jednego nicienia obliczona przez program dla danego obrazu; oraz (4) obliczona liczba nicieni na obrazie.
- Po uruchomieniu programu, w folderze z analizowanymi obrazami zostaną zapisane dwa pliki .csv (które można otworzyć w arkuszach Excel). Plik „worm_counts_stats” zawiera kolumny wynikowe widoczne w Command Window (sekcja 6.9). Plik „worm_counts_summary” zawiera 5 kolumn: (1) numer próby; liczbę nicieni w (2) punkcie but, (3) eth i (4) ori; oraz (5) całkowitą liczbę nicieni.
7. Uwagi dotyczące materiałów
- Aby przygotować płytki z wysokiej gęstości pożywką wzrostową (HGM) (Sekcja 1): Rozpuścić 3 g NaCl, 20 g Bactopeptone oraz 30 g Bacto-agar w 700 mL wody destylowanej. Dopełnić objętość do 1 L wodą destylowaną. Po autoklawowaniu schłodzić agar do 65oC i dodać 4 mL cholesterolu o stężeniu 5 mg/mL w etanolu, po 1 mL 1 M CaCl2 i 1 M MgSO4 oraz 25 mL 1 M KPO4 (pH = 6.0).
- Stosuje się 95% EtOH, ponieważ EtOH o wyższym stężeniu ma tendencję do zawierania zanieczyszczeń z procesu oczyszczania, które mogą wpływać na wyniki. Zaleca się przygotowywanie świeżego roztworu stokowego 10% butanonu (w 95% EtOH) co kilka powtórzeń testu.
- Z końcówek P20 należy odciąć kilka milimetrów, aby stworzyć otwór wystarczająco duży, by nicienie mogły przez niego przejść bez uszkodzenia. Końcówki P1000 mają już otwory wystarczająco duże dla nicieni.
- Stacja obrazowania płytek do testu chemotaksji (Rycina 3B) w laboratorium Murphy’ego zawiera kamerę Firewire z soczewką o zmiennym powiększeniu zamocowaną na wysięgniku. Podświetlenie tylne znajduje się u podstawy statywu, pod niestandardową platformą obrazującą ze szklanym blatem (Rycina 3C), co umożliwia oświetlanie płytek do testu chemotaksji od dołu. Do przechwytywania obrazów używane jest oprogramowanie „Measurement and Automation” (National Instruments). Materiały do konfiguracji tej stacji obrazowania są podobne do wcześniej opublikowanych,12 i można je znaleźć w Tabeli specyficznych odczynników i sprzętu.
8. Reprezentatywne wyniki:
Typowy naiwny indeks chemotaksji (CI) dla nicieni typu dzikiego w odpowiedzi na 10% butanonu wynosi około 0,2 (Rycina 4A).6 Trening skumulowany (1x) lub rozłożony w czasie (7x) zazwyczaj zwiększa indeks chemotaksji do 0,7-0,8 w czasie 0 (Rycina 4A, C-D), co daje indeks uczenia się (LI = CI po treningu - CI naiwny) na poziomie ~0,6.6 Uczenie się zachodzące podczas treningu skumulowanego lub rozłożonego w czasie jest bardzo trwałe. LI poniżej 0,5 zazwyczaj pojawia się w przypadku problemów z testem naiwnej chemotaksji, gdy zwierzęta wykazują naiwny CI wynoszący 0,3 lub więcej. Zazwyczaj dzieje się tak, ponieważ nicienie głodują lub są zbyt gęsto rozmieszczone na płytkach hodowlanych pomiędzy wybielaniem a rozpoczęciem testu, albo zbyt długo przebywają w buforze M9 pomiędzy płukaniem, co prowadzi do głodzenia; zapachy środowiskowe mogą również zwiększać naiwny CI. Głodzone nicienie mają znacznie wyższy naiwny CI dla 10% butanonu (Rycina 4B).6 Stwierdziliśmy, że problemy z naiwną chemotaksją są zazwyczaj rozwiązywane poprzez poprawę opieki nad nicieniami i warunków ich hodowli.
Czas trwania pamięci w tych analizach to czas potrzebny na powrót indeksu chemotaksji bezpośrednio po treningu do poziomów naiwnych, gdy indeks uczenia się = 0. U zwierząt typu dzikiego krótkotrwała pamięć asocjacyjna zazwyczaj zaczyna zanikać po 1 godzinie od treningu masowego, trwa około 2 godzin i jest niezależna od czynnika transkrypcyjnego CREB (Rysunek 4C).6 Długotrwała pamięć asocjacyjna zazwyczaj nie zaczyna znacząco zanikać aż do 16 godzin po treningu rozłożonym w czasie, trwa do 40 godzin i jest zależna od CREB (Rysunek 4D).6 Długotrwała pamięć asocjacyjna może nie osiągnąć pełnego potencjału w kilku przypadkach: (1) nicienie nie mają wystarczającej ilości E. coli OP50 podczas 30-minutowych okresów warunkowania; (2) bakterie pozostają w buforze M9 podczas okresów głodówki; lub (3) nicienie zostają uszkodzone podczas analizy (np. nicienie są pipetowane o ściankę probówki).
Wyniki są zazwyczaj istotne statystycznie, gdy dla każdego genotypu w danym punkcie czasowym przeprowadzono 4 lub więcej prób testu chemotaksji. Wykonanie sześciu powtórzeń na genotyp zazwyczaj daje bardzo istotne wyniki, nie sprawiając przy tym zbyt dużych trudności w obsłudze; jednak osoby początkujące mogą chcieć zacząć od zaledwie trzech powtórzeń. Zazwyczaj praca z 2-3 genotypami lub warunkami jednocześnie jest komfortowa dla osób doświadczonych w przeprowadzaniu tych testów uczenia się i pamięci.
Ręczne liczenie nicieni na płytkach do testów chemotaksji jest bardzo czasochłonne, może wprowadzać zmienność między poszczególnymi eksperymentami lub osobami pracującymi w laboratorium, a także może prowadzić do błędów podczas analizy i interpretacji danych. Liczenie nicieni za pomocą analizy obrazu (Sekcja 6) standaryzuje gromadzenie i analizę danych w całym laboratorium i średnio skraca czas analizy danych dla doświadczonych pracowników do 1/5 czasu wymaganego przy liczeniu ręcznym. Porównując wskaźniki chemotaksji obliczone na podstawie ręcznego liczenia nicieni z tymi wyznaczonymi przez oprogramowanie Count_worms, odnotowaliśmy średni błąd na poziomie 3,07 (± 1,19)%.
| Dzień 1 | |
| Czas | Krok |
| 9:00 | 1 godz. głodzenia w buforze M9 Rozpoczęcie testu chemotaksji naiwnej |
| 10:00 | Warunek nr 1 (szalki NGM 60 mm z pożywką i butanonem), 30 min Zakończenie testu chemotaksji naiwnej |
| 10:30 | Głodzenie #1 (płytki NGM 60 mm), 30 min |
| 11:00 | Warunek nr 2, 30 min |
| 11:30 | Głodzenie #2, 30 min |
| 12:00 | Warunek nr 3, 30 min |
| 12:30 | Głodzenie #3, 30 min |
| 1:00 | Warunek nr 4, 30 min |
| 1:30 | Głodzenie #4, 30 min |
| 2:00 | Warunek nr 5, 30 min |
| 2:30 | Głodzenie #5, 30 min |
| 3:00 | Warunek nr 6, 30 min |
| 3:30 | Głodzenie #6, 30 min |
| 4:00 | Warunek nr 7, 30 min |
| 4:30 | Rozpoczęcie testu chemotaksji w punkcie 0 h Przenieść pozostałe nicienie na płytki utrzymujące na 16–40 h |
| 5:30 | Zakończenie testu chemotaksji w punkcie 0 h |
| Dzień 2 | |
| Czas | Krok |
| 8:30 | Rozpocznij 16-godzinny test chemotaksji |
| 9:30 | Zakończenie 16-godzinnego testu chemotaksji |
Tabela 1. Reprezentatywny harmonogram testu długotrwałej pamięci asocjacyjnej. W tym przykładzie test rozpoczyna się w dniu 1. o godzinie 9:00 od 1-godzinnego głodzenia. 30-minutowe okresy kondycjonowania i głodzenia występują naprzemiennie, aż do momentu siedmiokrotnego ukondycjonowania nicieni. Testy chemotaksji są przeprowadzane na początku (grupa naiwna) i na końcu (0 hr) treningu. Całkowity czas trwania od rozpoczęcia do zakończenia wynosi 8,5 godziny. Nicienie na płytkach przechowawczych są testowane pod kątem chemotaksji do butanonu począwszy od dnia 2., od 16 do 40 godzin po treningu.
Rycina 1. Schemat badania krótkotrwałej i długotrwałej pamięci asocjacyjnej. (A) Zalecany harmonogram przygotowań poprzedzających dzień wykonania badań. (B) Badanie krótkotrwałej pamięci asocjacyjnej: Głodzone nicienie są warunkowane przez 1 h, a następnie poddawane natychmiastowemu testowi uczenia się 1x (0 min.) za pomocą testów chemotaksji lub przenoszone na płytki przechowawcze z pożywką na 0,5, 1 lub 2 h po warunkowaniu. (C) Badanie długotrwałej pamięci asocjacyjnej: Głodzone zwierzęta przechodzą 7 bloków treningowych warunkowania/głodzenia przed testem uczenia się lub LTAM od 16 do 40 h po treningu.
Rysunek 2. Układ testu chemotaksji. (A) Schemat płytki do testu chemotaksji. Za pomocą linijki lub innego urządzenia prowadzącego nanosi się na płytkę małe punkty, aby zaznaczyć punkt startowy (dół) oraz miejsca na butanon i EtOH (lewa i prawa strona). (B) Do punktów z butanonem i EtOH dodaje się 1 μL NaN3. (C) Na punkty po lewej lub prawej stronie płytki nanosi się po 1 μL 10% butanonu i 95% EtOH. (D) Do punktu startowego na płytce nanosi się 200-400 nicieni zawieszonych w buforze M9. (E) Chusteczkę KimWipe zwiniętą w szpic stosuje się do wchłonięcia buforu M9 i uwolnienia nicieni na płytkę testową.
Rysunek 3. Liczenie nicieni za pomocą analizy obrazu. (A) Przykład okna wyboru cząstek obrazu w programie „count_worms_v0.5.3”. Program otwiera oryginalny, wysokokontrastowy obraz czarno-biały (po lewej), a następnie automatycznie wyświetla okno z obrazem po progowaniu (środek). Narzędzie prostokąta może być użyte do zaznaczenia i usunięcia niepożądanych „cząstek” niebędących nicieniami, takich jak oznaczenia płytki testowej (1), krawędzie płytki (2) lub nakłucia agaru (3). (B) Zdjęcie stacji obrazowania do testów chemotaksji w laboratorium Murphy'ego. Płytki do testów chemotaksji są oświetlone od dołu, aby uzyskać wysokokontrastowe obrazy niezbędne do analizy. (C) Schemat specjalnie wykonanej platformy obrazowania stosowanej w stacji obrazowania chemotaksji.
Rysunek 4. Typowe wyniki uczenia asocjacyjnego i pamięci. (A) Naiwny indeks chemotaksji nicieni typu dzikiego w kierunku 10% butanonu wzrasta po treningu masowym (1x). Wyuczona asocjacja wymaga sparowania pokarmu (OP50 E. coli) oraz butanon. Liczby nad słupkami reprezentują „indeks uczenia się” (LI = CI_Trenowany - CINaiwny). (B) Naiwny chemotaksis typu dzikiego w kierunku 10% butanonu ulega znacznemu zwiększeniu, gdy nicienie są głodzone przez 16 godzin. Panele A-D zostały zaadaptowane z Kauffman i wsp., 2010.6 (C) Krótkotrwała pamięć asocjacyjna typu dzikiego utrzymuje się przez około 2 godziny i jest niezależna od czynnika transkrypcyjnego CREB. (D) Długotrwała pamięć asocjacyjna typu dzikiego utrzymuje się przez około 40 godzin i jest zależna od CREB.
Informacje uzupełniające
Dyskusja
Przedstawione tutaj testy uczenia asocjacyjnego i pamięci węchowej u C. elegans pozwalają rozróżnić procesy uczenia skumulowanego, uczenia rozproszonego, pamięci krótkotrwałej oraz pamięci długotrwałej. Testy te opierają się na zdolności nicieni do wykrywania pożywienia i zapachów chemicznych w ich środowisku1,2 oraz tworzenia pozytywnych skojarzeń między nimi.6 W związku z tym testy są bardzo wrażliwe na głodowanie w początkowej populacji zwierząt, dlatego należy zachować szczególną ostrożność, aby zapewnić odpowiednie odżywienie nicieni przed i po treningu. Pojedynczy trening skumulowany prowadzi do powstania krótkotrwałej pamięci asocjacyjnej. Zwiększona liczba okresów warunkowania oraz paradygmat uczenia rozproszonego są kluczowe dla osiągnięcia długotrwałej pamięci asocjacyjnej u C. elegans, podobnie jak u innych organizmów.6,8 Być może test ten można zmodyfikować w celu wywołania długotrwałych wspomnień asocjacji między różnymi bodźcami warunkowanymi i bezwarunkowymi.
Nasze testy uczenia się asocjacyjnego i pamięci mogą być wykorzystane do porównania zdolności uczenia się i pamięci zwierząt typu dzikiego z osobnikami starzejącymi się lub mutantami genetycznymi. Na przykład, podczas gdy zarówno zdolność uczenia się asocjacyjnego, jak i długotrwała pamięć asocjacyjna spadają wraz z wiekiem u nicieni typu dzikiego, uczenie się jest zachowane dłużej u zwierząt z osłabionym sygnalizowaniem insulinowym, a uczenie się i pamięć są zachowane dłużej u zwierząt poddanych restrykcji kalorycznej.6 Testy te są również odpowiednie do stosowania RNAi lub manipulacji farmakologicznych u C. elegans. Przykładowo, traktowanie nicieni RNAi przeciwko daf-2 poprawia krótkotrwałą i długotrwałą pamięć asocjacyjną; przeciwnie, blokowanie transkrypcji genów i syntezy białek za pomocą leków (odpowiednio aktynomycyny D i cykloheksymidu) podczas treningu z odstępami czasowymi zaburza formowanie pamięci długotrwałej.6
Pamięć długotrwała jest procesem kluczowym dla przetrwania wszystkich zwierząt i wydaje się, że znaczna część mechanizmów molekularnych zaangażowanych w pamięć asocjacji pawłowowskiej jest zachowana od nicieni po ssaki.6 Zdolność do rozróżniania i testowania uczenia się asocjacyjnego oraz pamięci krótkoterminowej i długoterminowej przy użyciu tych testów olfaktorycznych sprawia, że C. elegans jest doskonałym systemem do dalszych badań nad pamięcią i może dostarczyć wiedzy na temat procesów neurodegeneracyjnych prowadzących do utraty zdolności uczenia się i pamięci u ludzi.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Dziękujemy W. Ryu za porady dotyczące początkowej konfiguracji obrazowania, Z. Gitai za sugestię użycia programu ImageJ13 do liczenia nicieni oraz J. Ashraf za pomoc przy korzystaniu z Google SketchUp. CTM jest stypendystą Pew Scholar w dziedzinie nauk biomedycznych, stypendystą McKnight Scholar oraz stypendystą Keck Scholar.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Azydek sodu | Fisher Scientific | S227 | Przygotować stężenie 1 M w wodzie destylowanej |
| Alkohol etylowy 190 Proof | Pharmco-AAPER | DSP-CT-18 | >95% etanolu może zawierać zanieczyszczenia zakłócające testy chemotaksji |
| 2-butanony 99+% | Acros Organics | 14967-0010 | |
| Kamera CMOS do skanowania obszarów Basler IEEE-1394/FireWire | Edmund Scientific | NT56-683 | |
| Obiektyw wideo InfiniMite – Alpha Industrial | Edmund Scientific | NT56-202 | |
| Oświetlacz światłowodowy Dolan-Jenner MI-150 | Edmund Scientific | NT55-718 | |
| Podświetlenie 8” x 8” | Schott AG | A08927 | |
| Standardowy statyw wysięgnikowy | Edmund Scientific | NT54-120 | |
| Adapter słupa 3/4” do statywów wysięgnikowych | Edmund Scientific | NT54-124 | |
| Standardowa stała płyta montażowa 1/4-20 | Edmund Scientific | NT54-122 |
Bibliografia
- Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans. Cell. 74, 515-515 (1993).
- Ward, S. Chemotaxis by the nematode Caenorhabditis elegans: identification of attractants and analysis of the response by use of mutants. Proc Natl Acad Sci U S A. 70, 817-817 (1973).
- Bono, M. de, Maricq, A. V. Neuronal substrates of complex behaviors in C. elegans. Annu Rev Neurosci. 28, 451-451 (2005).
- Mori, I. Genetics of chemotaxis and thermotaxis in the nematode Caenorhabditis elegans. Annu Rev Genet. 33, 399-399 (1999).
- Zhang, Y., Lu, H., Bargmann, C. I. Pathogenic bacteria induce aversive olfactory learning in Caenorhabditis elegans. Nature. 438, 179-179 (2005).
- Kauffman, A. L. Insulin signaling and dietary restriction differentially influence the decline of learning and memory with age. PLoS Biol. 8, e1000372-e1000372 (2010).
- Torayama, I., Ishihara, T., Katsura, I. Caenorhabditis elegans integrates the signals of butanone and food to enhance chemotaxis to butanone. J Neurosci. 27, 741-741 (2007).
- Silva, A. J., Kogan, J. H., Frankland, P. W., Kida, S. CREB and memory. Annu Rev Neurosci. 21, 127-127 (1998).
- Meyer, F. Iterative image transformations for an automatic screening of cervical smears. J Histochem Cytochem. 27, 128-128 (1979).
- Otsu, N. A Threshold Selection Method from Gray-Level Histograms. IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. 9, 62-62 (1979).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-71 (1974).
- Stephens, G. J., Johnson-Kerner, B., Bialek, W., Ryu, W. S. Dimensionality and dynamics in the behavior of C. elegans. PLoS Comput Biol. 4, e1000028-e1000028 (2008).
- Abramoff, M. agelhaes, Ram, P. J., J, S. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11, 36-36 (2004).
Przedruki i uprawnienia
