Artykuł metodologiczny

Izolacja i hodowla komórek ze strefy nefrogennej embrionalnej nerki myszy

17.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/2555

⸱

22 kwietnia 2011

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Medicine, Maine Medical Center Research Institute, 2Molecular Medicine and Gene Therapy, Lund University Hospital

W tym artykule

Podsumowanie

W niniejszym raporcie opisujemy metodę izolacji i hodowli niszy komórek progenitorowych z embrionalnej nerki myszy, która może być wykorzystana do badania szlaków sygnalizacyjnych regulujących komórki macierzyste/progenitorowe rozwijającej się nerki. Hodowane komórki są bardzo podatne na traktowanie małymi cząsteczkami i białkami rekombinowanymi, a co istotne, również na transdukcję wirusową, co umożliwia efektywną manipulację badanymi szlakami.

Streszczenie

Rozwój zarodkowy nerki był przedmiotem szerokich badań, zarówno jako model oddziaływań nabłonkowo-mezenchymalnych w organogenezie, jak i w celu lepszego zrozumienia przyczyn wrodzonych chorób nerek. W ostatnim czasie, w rozwijającej się dziedzinie medycyny regeneracyjnej, badano możliwość kierowania naiwnych embrionalnych komórek macierzystych w stronę losów nefrogenezy. Badania genetyczne u myszy pozwoliły zidentyfikować kilka szlaków niezbędnych do rozwoju nerek, a niedawno opracowano ogólny katalog transkrypcji genów w tym narządzie. http://www.gudmap.org/dostarczając licznych potencjalnych regulatorów kluczowych funkcji rozwojowych. Organogenezę nerki gryzoni można badać w kulturze organów; w wielu raportach podejście to wykorzystywano do analizy skutków aplikacji kandydackich białek lub wyciszenia ekspresji kandydackich genów przy użyciu siRNA lub morfolino. Jednakże przydatność kultury organów w badaniu sygnalizacji regulującej różnicowanie w przeciwieństwie do odnawiania komórek macierzystych/progenitorowych w rozwijającej się nerce jest ograniczona, ponieważ hodowane organy zawierają zwartą macierz pozakomórkową, która ogranicza dyfuzję makrocząsteczek i cząsteczek wirusowych. Aby zbadać zdarzenia sygnalizacji komórkowej wpływające na niszę komórek macierzystych/progenitorowych w nerce, opracowaliśmy system pierwotnych komórek, który odtwarza strefę nefrogenną lub niszę komórek progenitorowych rozwijającej się nerki. ex vivo w izolacji od nabłonkowego induktora różnicowania. Dzięki ograniczonemu trawieniu enzymatycznemu komórki strefy nefrogenezy mogą zostać selektywnie uwolnione z rozwijających się nerek w stadium E17,5. Po filtracji komórki te mogą być hodowane w formie nieregularnej warstwy jednowarstwowej w zoptymalizowanych warunkach. Analiza genów markerowych wykazuje, że hodowle te zawierają rozkład typów komórek charakterystyczny dla strefy nefrogenezy. in vivooraz aby utrzymywały odpowiednią ekspresję genów markerowych podczas okresu hodowli. Komórki te są bardzo podatne na działanie małych cząsteczek i białek rekombinowanych, a co istotne, również na transdukcję wirusową, co znacznie ułatwia badanie efektów regulatorów kandydackich komórek macierzystych/progenitorowych. Podstawowe parametry biologii komórki, takie jak proliferacja i śmierć komórek, a także zmiany w ekspresji markerów molekularnych charakterystycznych dla komórek macierzystych/progenitorowych nefronów in vivo mogą zostać z sukcesem wykorzystane jako wyniki eksperymentalne. Trwająca w naszym laboratorium praca z wykorzystaniem tej nowej techniki hodowli komórek pierwotnych ma na celu odkrycie podstawowych mechanizmów rządzących regulacją odnawiania się w stosunku do różnicowania w komórkach macierzystych/progenitorowych nefronów.

Protokół

1. Przygotowanie odczynników do trawienia nerki

  1. Do ekstrakcji komórek strefy nefrogenniej (NZCs) z 8 nerek E17.5 będzie potrzebne 1,5 ml roztworu 0,25 % Kolagenazy A (m/v) i 1 % Pankreatyny (m/v). Ponieważ Pankreatyna rozpuszcza się w temperaturze pokojowej w ciągu około 2 godzin, przed eksperymentem należy przygotować wystarczającą ilość roztworu trawiennego dla największej przewidywanej liczby nerek embrionalnych. Roztwór trawienny przygotowuje się, dodając najpierw 25 mg Kolagenazy A do 10 ml buforu fosforanowego Dulbecco (DPBS) w przezroczystej, sterylnej probówce wirówkowej o pojemności 15 ml. Krytyczne jest, aby DPBS NIE zawierał wapnia ani magnezu, ponieważ zakłóci to trawienie enzymatyczne. Roztwór należy mieszać na nutatorze przez 10 minut do rozpuszczenia Kolagenazy A. Do roztworu rozpuszczonej Kolagenazy A należy dodać 100 mg Pankreatyny i mieszać na nutatorze przez co najmniej 2 godziny. Alternatywnie, roztwór trawienny Kolagenazy A/Pankreatyny można mieszać na nutatorze przez noc w temperaturze 4° C. Zaleca się noszenie maseczki, ponieważ Kolagenaza A i Pankreatyna łatwo rozprzestrzeniają się w powietrzu podczas ważenia i mogą podrażniać drogi nosowe.
  2. Przygotować 5 % roztwór płodowej surowicy bydlęcej (FBS) (v/v) w zbuforowanym roztworze soli Hanksa (HBSS). Wymieszać przez odwracanie. Konieczny będzie 1 ml roztworu dla każdej probówki zawierającej 8 nerek.
  3. Przygotować pożywkę hodowlaną, uzupełniając bezzurowicową pożywkę dla keratynocytów o 1 % glutaminy (v/v) oraz 1 % Penicyliny-Streptomycyny (PenStrep) (v/v).
  4. Sterylne polistyrenowe płytki hodowlane z płaskim dnem (96, 48, 24 lub 6-dołkowe) pokryć roztworem ludzkiej fibronektyny w stężeniu 5 mg na cm2 powierzchni wzrostu. 5 mg proszku fibronektyny resuspenderuje się w 5 ml sterylnej H2O. Roztwór ten rozcieńcza się 1:25 w sterylnym DPBS bez wapnia i magnezu, a następnie dodaje się 250 ml do każdego dołka płytki 24-dołkowej. Płytki inkubuje się z roztworem fibronektyny w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę, a następnie przez 1 godzinę w temperaturze 4° C. Alternatywnie płytki można inkubować przez noc w temperaturze 4° C. Przed dodaniem pożywki/komórek roztwór należy odessać w komorze z laminarnym przepływem powietrza.

2. Disekcja nerek i usuwanie torebek (wykonana w temperaturze pokojowej)

  1. W dniu E17.5 uśmierć matkę zgodnie z procedurą zatwierdzoną przez lokalną Komisję Etyki ds. Doświadczeń na Zwierzętach (IACUC), wyjmij macicę i umieść ją w szalce Petriego zawierającej DPBS z wapniem i magnezem. Pod mikroskopem sekcyjnym, używając pęset zegarmistrzowskich, wyjmij każdy embrion z macicy i dokonaj dekapitacji każdego z nich. Po wyjęciu całego miotu z macicy, przenieś embriony do czystej szalki Petriego zawierającej ilość DPBS z wapniem i magnezem wystarczającą do całkowitego przykrycia embrionów, pozostawiając w poprzednim naczyniu jak najwięcej krwi i resztek tkanek.
  2. Za pomocą pęsety wykonaj nacięcie okalające w ścianie brzusznej embrionu na poziomie pępka. Następnie połóż embrion na plecach, unieruchom go w okolicach barków jedną pęsetą i za pomocą drugiej pęsety usuń narządy wewnętrzne, od płuc aż do pęcherza. Z doświadczeniem można to wykonać jednym ruchem. Nerki powinny pozostać przyczepione do tylnej części masy narządów. Jeśli nerki nie pozostaną przyczepione do usuniętych narządów, można je ostrożnie wypreparować ze grzbietowej ściany ciała. Nerki uszkodzone podczas tego procesu sekcji należy odrzucić, ponieważ zanieczyszczą one końcową kulturę niewłaściwymi typami komórek.
  3. Delikatnie oddziel nerki od reszty narządów, dbając o to, aby nerki pozostały ze sobą połączone. Przytrzymaj tkankę między nerkami jedną pęsetą i chwyć nadnercze przyczepione do jednej z nerek drugą pęsetą. Nadnercze powinno być przytwierdzone do torebki nerki. Delikatnie odwarstw nadnercze i torebkę z zewnętrznej strony nerki, podobnie jak przy obieraniu banana. Zachowaj ostrożność, aby nie rozciąć nerki na pół podczas obierania i upewnij się, że nie uszkodziłeś tkanki nerki pod torebką. Ostrożnie usuń pozostałą część torebki oraz moczowód, jeśli nadal jest przyczepiony. Powtórz czynność z drugą nerką.
  4. Użyj uciętej pipety transferowej, aby umieścić nerki w 5 ml polistyrenowej probówce z HBSS. Powtórz kroki 2.2-2.4 dla każdego embrionu. Nerki można łączyć po 8 sztuk na probówkę. Z doświadczeniem sekcja i usuwanie torebki zajmą 2-3 minuty na jeden embrion.

3. Trawienie enzymatyczne nerek (wszystkie etapy w temperaturze pokojowej, chyba że zaznaczono inaczej)

  1. Usunąć roztwór HBSS z probówek 5 ml zawierających nerki za pomocą pipetora, uważając, aby nie dotknąć nerek. Natychmiast dodać 1,5 ml roztworu trawiącego Collagenase A/Pancreatin do probówki 5 ml z nerkami przed przejściem do kolejnej próbki. Powtórzyć czynność dla każdej probówki z nerkami.
  2. Umieścić probówki z trawionymi nerkami w enzymie na nutatorze w podgrzanym do 37° C inkubatorze na 15 minut. Na 2 minuty przed zakończeniem trawienia dodać 3 μl DNase (1 U/ml) do nowej probówki polistyrenowej 5 ml dla każdego prowadzonego trawienia.
  3. Szybko wyjąć próbki z inkubatora, dodać 75 μl FBS i odwrócić probówki 3 razy w celu wymieszania. Pozostawić na blacie na 2 minuty.
  4. Przenieść 1,4 ml zawiesiny komórkowej do probówki polistyrenowej 5 ml zawierającej DNase (1 U/ml), pozostawiając pozostałe 0,2 ml zawiesiny komórkowej i nerki. Pozostawione 0,2 ml roztworu będzie zawierać zanieczyszczenia, takie jak macierz zewnątrzkomórkowa.
  5. Mieszać zawiesinę komórkową z DNase na nutatorze w podgrzanym do 37° C inkubatorze przez 10 minut.
  6. Szybko wyjąć zawiesiny komórkowe z inkubatora i przenieść każdą z nich do probówki Eppendorf 1,5 ml. Wirować zawiesiny komórkowe w mikrowirówce przy 325 g przez 5 minut.
  7. Usunąć nadosad z osadu komórkowego i resuspendować osad w 1 ml 5% FBS/HBSS, pipetując w górę i w dół 5-6 razy. Zamknąć każdą probkę przed przejściem do kolejnej próbki.
  8. Wirować zawiesiny komórkowe w mikrowirówce przy 325 g przez 5 minut.
  9. Usunąć nadosad i dodać 0,5 ml pożywki Keratinocyte serum free medium (KSFM) z dodatkami do każdej probówki, a następnie zamknąć probówkę przed przejściem do kolejnej próbki. Po dodaniu pożywki do wszystkich probówek, delikatnie resuspendować każdy osad komórkowy, pipetując w górę i w dół 5-6 razy mikropipetą 1 ml. Połączyć wszystkie zawiesiny komórkowe w nowej probówce polistyrenowej 5 ml.
  10. Przemyć dwie nakrętki z sitkiem komórkowym 40 mikronów, umieszczone na probówce polistyrenowej 5 ml z okrągłym dnem, za pomocą KSFM dla każdej próbki. Przepuścić zawiesiny komórkowe przez pierwszą nakrętkę z sitkiem, przenosząc je mikropipetą 1 ml. Unikać dotykania filtra końcówką pipety. Zebrać przefiltrowany płyn i powtórzyć filtrację przez drugą nakrętkę z sitkiem. Zdjąć nakrętkę z sitkiem i zastąpić ją nową nakrętką z typowej probówki polistyrenowej 5 ml.
  11. Policzyć komórki za pomocą hemocytometru lub innego urządzenia do liczenia komórek i przenieść je do dołków płytki hodowlanej pokrytej fibronektyną z gęstością 100 000-200 000 komórek na cm2, rozcieńczając w razie potrzeby pożywką KSFM z dodatkami. Zazwyczaj uzyskuje się około 4,5x106 komórek z miotu 10 embrionów.
  12. Inkubować komórki w inkubatorze z wilgotnym powietrzem w temperaturze 37° C i 5% CO2.
  13. Pozostawić komórki do regeneracji i przytwierdzenia w pożywce na 2-4 godziny przed stymulacją dodatkowymi odczynnikami. Stymulować komórki badanym związkiem przez okres od 1 do 48 godzin. Oczyścić RNA do analizy PCR za pomocą zestawu Qiagen RNeasy Micro Kit zgodnie z instrukcją producenta lub postępować zgodnie z poniższymi instrukcjami w celu fluorescencyjnego immunobarwienia komórek.

4. Przygotowanie odczynników do fiksacji komórek i immunobarwienia

  1. Przygotuj 4% PFA: Rozpuść 4% paraformaldehyd w PBS (v/v) w temperaturze 55° C przy regularnym mieszaniu. Przed użyciem schłodź do temperatury pokojowej. Roztwór ten jest toksyczny i należy go utylizować w wyznaczonych pojemnikach na odpady.
  2. Przygotuj roztwór do permeabilizacji, dodając Triton X-100 do PBS w celu uzyskania stężenia 0,3% (v/v).
  3. Przygotuj 5% roztwór blokujący w PBS z surowicą pochodzącą od gatunku, u którego wytworzono przeciwciało wtórne. Na przykład, jeśli wykrywasz przeciwciało królicze przeciwko docelowemu antygenowi za pomocą osiołkowego przeciwciała anty-króliczego Alexa Fluor 568, przygotuj roztwór blokujący zawierający 5% surowicy osła. Przechowuj w temperaturze 4° C.
  4. Przygotuj roztwór przeciwciała pierwszorzędowego, dodając odpowiednie stężenie przeciwciała do 5% roztworu blokującego.
  5. Przygotuj roztwór przeciwciała wtórnego bezpośrednio przed użyciem. Dodaj przeciwciało sprzężone z fluorophorem w stężeniu zalecanym przez producenta wraz z barwnikiem jądrowym DAPI oraz innymi markerami organelli, takimi jak faloidyna, do 5% roztworu blokującego. W przypadku konieczności przechowywania, trzymaj roztwór w ciemności w temperaturze 4° C do momentu użycia.
  6. Przygotuj 50% roztwór glicerolu/PBS (v/v) do przechowywania komórek poddanych immunobarwieniu. Alternatywnie można zastosować Vectashield.

5. Fiksacja komórek i immunobarwienie

  1. Poniższy protokół został opracowany do fiksacji i barwienia NZC w płytce 24-dołkowej. Podane objętości dotyczą pojedynczego dołka. Odczynniki należy delikatnie pipetować na wszystkich etapach, aby uniknąć odklejenia komórek; nie zaleca się wstrząsania płytki podczas etapów inkubacji.
  2. Delikatnie usunąć medium za pomocą mikropipety 1 ml i dodać 0,5 ml 4% PFA do przytwierdzonych hodowli komórkowych. Inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej, nie poruszając płytką.
  3. Usunąć 4% PFA i dodać 0,5 ml roztworu do permeabilizacji na dołek. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  4. Usunąć roztwór do permeabilizacji i delikatnie przepłukać dwukrotnie, używając 0,5 ml PBS na każde płukanie.
  5. Dodać 0,5 ml roztworu blokującego i inkubować w temperaturze pokojowej przez 60 minut.
  6. Usunąć roztwór blokujący i dodać 0,225 ml roztworu przeciwciał pierwszorzędowych.
  7. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 godziny lub przez noc w temperaturze 4° C.
  8. Usunąć roztwór przeciwciał pierwszorzędowych i delikatnie przepłukać dwukrotnie, używając 0,5 ml PBS na każde płukanie.
  9. Dodać 0,225 ml roztworu przeciwciał wtórnych. Inkubować płytkę w ciemności w temperaturze pokojowej przez 60 minut.
  10. Usunąć roztwór przeciwciał wtórnych i delikatnie przepłukać dwukrotnie, używając 0,5 ml PBS na każde płukanie.
  11. Dodać 0,3 ml roztworu 50% glicerolu/PBS (v/v) lub wystarczającą ilość Vectashield, aby pokryć dno dołka.
  12. Wykonać obrazowanie komórek przy użyciu mikroskopu epifluorescencyjnego lub przechowywać w temperaturze 4° C, owinięte w folię.

6. Reprezentatywne wyniki

figure-protocol-1
Rycina 1. NZCs zostały oczyszczone z embrionów E17.5, wysiane w gęstości 200,000 komórek na cm2 i inkubowane w 37° C przez łącznie 24 godziny. Przed barwieniem immunofluorescencyjnym komórki obrazowano w kontraście fazowym przy użyciu odwróconego mikroskopu Leica DM IRB. (A) Widok w kontraście fazowym (powiększenie 20X) NZCs po 24 godzinach hodowli. (B) Komórki utrwalono i zabarwiono za pomocą królika przeciwciała anty-PAX2 specyficznego dla komórek progenitorowych nefronów (czerwony) oraz wtórnego przeciwciała osioł przeciw-królik koniugowanego z Alexa Fluor 568. Niebieskie jądra komórkowe zostały zabarwione DAPI. (C) Widok w kontraście fazowym (powiększenie 40X) skupiska progenitorów nefronów (w centrum) po 24 godzinach hodowli. (D) Obraz (powiększenie 40X) NZCs wyizolowanych z embrionów LacZ+ szczepu Foxd1LacZ, który wykazuje ekspresję β-galaktozydazy pod kontrolą promotora Foxd1. Foxd1 jest eksprymowany w populacji komórek zrębu w strefie nefrogenezy rozwijającej się nerki. Komórki zabarwiono markerem F-aktyny faloidyną (pierwotny koniugat Oregon green), barwnikiem jądrowym DAPI (niebieski) oraz królika przeciwciałem anty-β-galaktozydaza (wtórne – osioł przeciw-królik Alexa Fluor 568) w celu detekcji komórek zrębu Foxd1+ (czerwony).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W niniejszym protokole opisujemy metodę izolacji i hodowli komórek ze strefy nefrogennej embrionalnej nerki. Jest to rozwinięcie metody opublikowanej pierwotnie w ramach badania wpływu leczenia BMP7 na komórki strefy nefrogennej (Blank et al., 2009). W początkowym badaniu przeprowadzono szereg eksperymentów w celu charakterystyki typów komórek reprezentowanych w populacji NZC. Krótko mówiąc, oczyszczanie NZC z wykorzystaniem reporterów genetycznych dla zrębu korowego (Foxd1+/lacZ) (Hatini

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie zgłoszono konfliktów interesów.

Podziękowania

Praca ta była wspierana przez grant R01 DK078161 z NIDDK (LO), stypendia podoktorskie z American Heart Association (AB), Wenner-Gren Foundations of Sweden oraz Kungliga Fysiografiska Sällskapet w Lund w Szwecji (UB). Dodatkowe wsparcie zapewniły zaplecza rdzeniowe Maine Medical Center Research Institute w zakresie histopatologii, bioinformatyki i FACS (wspierane przez 2P20RR18789-06) oraz zwierzęce zaplecze badawcze MMCRI.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Pinceta zegarmistrzowska nr 5’Roboz Surgical Instruments Co.RS-4905wymagane 2 pary
Kolagenaza ARoche Group10 103 578 001używać maski
Pankreatyna wieprzowaSigma-AldrichP8096używać maski
DPBS z Ca, MgLonza Inc.17-513Fz Mg & Ca
Płodowa surowica bydlęca (FBS)BioWhittaker14-901E
HBSSGIBCO, by Life Technologies14175
KSFMGIBCO, by Life Technologies10724-011bez dodanych czynników wzrostu
L-Glutamina 200mMSigma-AldrichG7513stosować w stężeniu 1% v/v
PenStrep 10 000 U penicyliny / ml 10 mg streptomycyny / mlSigma-AldrichP4333stosować w stężeniu 1% v/v
FibronektynaBD Biosciences356008dostarczana w proszku
Płytka hodowlana 24-dołkowaThermo Fisher Scientific, Inc.142485Nunclon
DPBS bez Mg & CaLonza Inc.17-512F
Probówki polistyrenowe 5mLBD Biosciences352235
DNaza (1 U/μl)Invitrogen18068-0154 μl na 1.5 ml
Sito do komórek 40 mikronówBD Biosciences352235z nakrętką i probówką
ParaformaldehydSigma-AldrichP6148stosować w stężeniu 4% w/v
Triton X100VWR internationalVW3929-2stosować w stężeniu 0.3% v/v
PBSSigma-AldrichP3813dostarczany w proszku
Surowica osłaJackson ImmunoResearch017-000-121stosować w stężeniu 5% v/v
Królicze przeciwciało anty-PAX2Invitrogen71-6000rozcieńczyć 1:100
Królicze przeciwciało anty-β-galMP Biomedicals559762rozcieńczyć 1:200
Faloidyna Oregon Green 488InvitrogenO7466rozcieńczyć 1:200
Osie przeciwciało anty-królicze Alexa Fluor 568InvitrogenA10042rozcieńczyć 1:200
DAPIInvitrogenD1306rozcieńczyć 1:5000
VectashieldVector LaboratoriesH-1000
GlicerolEMD MilliporeGX0185-6wymieszać 50% z H2O
Zestaw RNeasy Micro KitQiagen74004stosować protokół "DNase on column"
Pipety transferowe, 3mlBD Biosciences357575

Bibliografia

  1. Blank, U., Brown, A., Adams, D. C., Karolak, M. J., Oxburgh, L. BMP7 promotes proliferation of nephron progenitor cells via a JNK-dependent mechanism. Development. 136, 3557-3566 (2009).
  2. Brunskill, E. W., Aronow, B. J., Georgas, K., Rumballe, B., Valerius, M. T., Aronow, J., Kaimal, V., Jegga, A. G., Grimmond, S., McMahon, A. P. Atlas of gene expression in the developing kidney at microanatomic resolution. Developmental Cell. 15, 781-791 (2008).
  3. Godin, R. E., Takaesu, N. T., Robertson, E. J., Dudley, A. T. Regulation of BMP7 expression during kidney development. Development. 125, 3473-3482 (1998).
  4. Grobstein, C. Inductive epitheliomesenchymal interaction in cultured organ rudiments of the mouse. Science. 118, 52-55 (1953).
  5. Grobstein, C. Morphogenetic interaction between embryonic mouse tissues separated by a membrane filter. Nature. 172, 869-870 (1953).
  6. Hatini, V., Huh, S. O., Herzlinger, D., Soares, V. C., Lai, E. Essential role of stromal mesenchyme in kidney morphogenesis revealed by targeted disruption of Winged Helix transcription factor BF-2. Genes and Development. 10, 1467-1478 (1996).
  7. Oxburgh, L., Chu, G. C., Michael, S. K., Robertson, E. J. TGFb superfamily signals are required for morphogenesis of the kidney mesenchyme progenitor population. Development. 131, 4593-4605 (2004).
  8. Srinivas, S., Watanabe, T., Lin, C. S., William, C. M., Tanabe, Y., Jessell, T. M., Costantini, F. Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus. BMC Developmental Biology. 1, 4-4 (2001).
  9. Yu, J., Carroll, T. J., McMahon, A. P. Sonic hedgehog regulates proliferation and differentiation of mesenchymal cells in the mouse metanephric kidney. Development. 129, 5301-5312 (2002).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Kom rki strefy nefrogennejtrawienie enzymatyczneizolacja kom rekpierwotna hodowla kom rkowapowlekanie fibronektynpo ywka bezsurowiczafiltracja przez sitko kom rkoweanaliza gen w markerowychbarwienie immunologiczne

Powiązane artykuły