Izolacja i hodowla komórek ze strefy nefrogennej embrionalnej nerki myszy

Podsumowanie

W niniejszym raporcie opisujemy metodę izolacji i hodowli niszy komórek progenitorowych z embrionalnej nerki myszy, która może być wykorzystana do badania szlaków sygnalizacyjnych regulujących komórki macierzyste/progenitorowe rozwijającej się nerki. Hodowane komórki są bardzo podatne na traktowanie małymi cząsteczkami i białkami rekombinowanymi, a co istotne, również na transdukcję wirusową, co umożliwia efektywną manipulację badanymi szlakami.

Streszczenie

Rozwój zarodkowy nerki był przedmiotem szerokich badań, zarówno jako model oddziaływań nabłonkowo-mezenchymalnych w organogenezie, jak i w celu lepszego zrozumienia przyczyn wrodzonych chorób nerek. W ostatnim czasie, w rozwijającej się dziedzinie medycyny regeneracyjnej, badano możliwość kierowania naiwnych embrionalnych komórek macierzystych w stronę losów nefrogenezy. Badania genetyczne u myszy pozwoliły zidentyfikować kilka szlaków niezbędnych do rozwoju nerek, a niedawno opracowano ogólny katalog transkrypcji genów w tym narządzie. http://www.gudmap.org/dostarczając licznych potencjalnych regulatorów kluczowych funkcji rozwojowych. Organogenezę nerki gryzoni można badać w kulturze organów; w wielu raportach podejście to wykorzystywano do analizy skutków aplikacji kandydackich białek lub wyciszenia ekspresji kandydackich genów przy użyciu siRNA lub morfolino. Jednakże przydatność kultury organów w badaniu sygnalizacji regulującej różnicowanie w przeciwieństwie do odnawiania komórek macierzystych/progenitorowych w rozwijającej się nerce jest ograniczona, ponieważ hodowane organy zawierają zwartą macierz pozakomórkową, która ogranicza dyfuzję makrocząsteczek i cząsteczek wirusowych. Aby zbadać zdarzenia sygnalizacji komórkowej wpływające na niszę komórek macierzystych/progenitorowych w nerce, opracowaliśmy system pierwotnych komórek, który odtwarza strefę nefrogenną lub niszę komórek progenitorowych rozwijającej się nerki. ex vivo w izolacji od nabłonkowego induktora różnicowania. Dzięki ograniczonemu trawieniu enzymatycznemu komórki strefy nefrogenezy mogą zostać selektywnie uwolnione z rozwijających się nerek w stadium E17,5. Po filtracji komórki te mogą być hodowane w formie nieregularnej warstwy jednowarstwowej w zoptymalizowanych warunkach. Analiza genów markerowych wykazuje, że hodowle te zawierają rozkład typów komórek charakterystyczny dla strefy nefrogenezy. in vivooraz aby utrzymywały odpowiednią ekspresję genów markerowych podczas okresu hodowli. Komórki te są bardzo podatne na działanie małych cząsteczek i białek rekombinowanych, a co istotne, również na transdukcję wirusową, co znacznie ułatwia badanie efektów regulatorów kandydackich komórek macierzystych/progenitorowych. Podstawowe parametry biologii komórki, takie jak proliferacja i śmierć komórek, a także zmiany w ekspresji markerów molekularnych charakterystycznych dla komórek macierzystych/progenitorowych nefronów in vivo mogą zostać z sukcesem wykorzystane jako wyniki eksperymentalne. Trwająca w naszym laboratorium praca z wykorzystaniem tej nowej techniki hodowli komórek pierwotnych ma na celu odkrycie podstawowych mechanizmów rządzących regulacją odnawiania się w stosunku do różnicowania w komórkach macierzystych/progenitorowych nefronów.

Protokół

1. Przygotowanie odczynników do trawienia nerki

1. Do ekstrakcji komórek strefy nefrogiennej (NZCs) z 8 nerek E17.5 potrzebne będzie 1,5 ml 0,25 % (w/v) roztworu kolagenazy A oraz 1 % (w/v) roztworu pankreatyny. Ponieważ pankreatyna rozpuszcza się w temperaturze pokojowej w ciągu około 2 godzin, przed eksperymentem należy przygotować ilość roztworu trawiącego wystarczającą dla przewidywanej maksymalnej liczby nerek embrionalnych. Roztwór trawiący przygotowuje się, dodając najpierw 25 mg kolagenazy A do 10 ml buforu solnego z fosforanami Dulbecco (DPBS) w przezroczystej, sterylnej probówce wirówkowej o pojemności 15 ml. Kluczowe jest, aby DPBS NIE zawierał wapnia ani magnezu, ponieważ interferowałoby to z trawieniem enzymatycznym. Roztwór należy mieszać na nutatorze przez 10 minut do rozpuszczenia kolagenazy A. Do roztworu rozpuszczonej kolagenazy A należy dodać 100 mg pankreatyny i mieszać na nutatorze przez co najmniej 2 godziny. Alternatywnie, roztwór trawiący kolagenaza A/pankreatyna może być mieszany na nutatorze przez noc w temperaturze 4° C. Zaleca się noszenie maski, ponieważ kolagenaza A i pankreatyna łatwo przedostają się do powietrza podczas ważenia i mogą podrażniać drogi nosowe.
2. Przygotować 5 % (v/v) roztwór płodowej surowicy bydlęcej (FBS) w zbuforowanym roztworze soli Hanksa (HBSS). Wymieszać przez odwracanie probówki. Konieczne będzie 1 ml na każdą probówkę zawierającą 8 nerek.
3. Przygotować pożywkę hodowlaną, uzupełniając bezzurową pożywkę dla keratynocytów 1 % (v/v) glutaminą i 1 % (v/v) penicyliną i streptomycyną (PenStrep).
4. Sterylne, polistyrenowe płytki hodowli tkankowej z płaskim dnem (96, 48, 24 lub 6 dołkowe) należy pokryć roztworem ludzkiej fibronektyny w stężeniu 5 mg na cm² powierzchni wzrostu. 5 mg proszku fibronektyny resuspenderuje się w 5 ml sterylnej wody H₂O. Roztwór ten rozcieńcza się 1:25 w sterylnym DPBS bez wapnia i magnezu, a następnie dodaje się po 250 µl do każdego dołka płytki 24-dołkowej. Płytki inkubuje się z roztworem fibronektyny w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę, a następnie przez 1 godzinę w temperaturze 4° C. Alternatywnie płytki można inkubować przez noc w temperaturze 4° C. Przed dodaniem pożywki/komórek roztwór należy odessać w komorze z laminarnym przepływem powietrza.

2. Disekcja nerek i usuwanie torebek (wykonywana w temperaturze pokojowej)

1. W dniu E17.5 uśmierć matkę zgodnie z procedurą zatwierdzoną przez miejscową komisję ds. etyki doświadczeń na zwierzętach (IACUC), wyjmij macicę i umieść ją w szalce Petri zawierającej DPBS z wapniem i magnezem. Pod mikroskopem stereoskopowym, używając pęset zegarmistrzowskich, wyjmij każdy embrion z macicy i odetnij mu głowę. Po wyjęciu całego miotu z macicy, przenieś embriony do czystej szalki Petri zawierającej ilość DPBS z wapniem i magnezem wystarczającą do całkowitego przykrycia embrionów, pozostawiając przy tym jak najwięcej krwi i resztek tkanek.
2. Używając pęsety, wykonaj nacięcie okalające ścianę brzuszną embrionu na wysokości pępka. Następnie połóż embrion na plecach, unieruchom go w okolicach barków jedną pęsetą i za pomocą drugiej pęsety usuń narządy wewnętrzne, od płuc aż po pęcherz moczowy. Przy odpowiedniej wprawie można to wykonać jednym ruchem. Nerki powinny pozostać przytwierdzone do tylnej części masy narządów. Jeśli nerki nie pozostaną przytwierdzone do usuniętych narządów, można je ostrożnie wypreparować z grzbietowej ściany ciała. Nerki uszkodzone podczas procesu sekcji należy odrzucić, ponieważ zanieczyszczą one końcową kulturę niepożądanymi typami komórek.
3. Ostrożnie oddziel nerki od pozostałych narządów, dbając o to, aby nerki pozostały ze sobą połączone. Przytrzymaj tkankę między nerkami jedną pęsetą, a drugą chwyć nadnercze przylegające do jednej z nerek. Nadnercze powinno być przytwierdzone do torebki nerki. Delikatnie odwarstw nadnercze i torebkę z zewnętrznej strony nerki, w sposób podobny do obierania banana. Należy uważać, aby nie rozdzielić nerki na pół podczas obierania i nie uszkodzić tkanki nerki znajdującej się pod torebką. Ostrożnie usuń pozostałości torebki oraz moczowód, jeśli jest nadal przytwierdzony. Powtórz czynność z drugą nerką.
4. Użyj uciętej pipety transferowej, aby przenieść nerki do probówki polistyrenowej o pojemności 5 ml z HBSS. Powtórz kroki 2.2–2.4 dla każdego embrionu. Nerki można łączyć po 8 sztuk na probówkę. Przy wprawie sekcja i usuwanie torebek zajmują 2–3 minuty na embrion.

3. Trawienie enzymatyczne nerek (wszystkie etapy w temperaturze pokojowej, chyba że wskazano inaczej)

1. Za pomocą pipetora usunąć roztwór HBSS z probówek o pojemności 5 ml zawierających nerki, uważając, aby nie dotknąć nerek. Natychmiast dodać 1,5 ml roztworu trawiennego Collagenase A/Pancreatin do probówki 5 ml z nerkami, przed przejściem do kolejnej próbki. Powtórzyć czynność dla każdej probówki z nerkami.
2. Umieścić probówki z trawieniami enzymatycznymi nerek na nutatorze w podgrzanym do 37° C inkubatorze na 15 minut. Na 2 minuty przed zakończeniem trawienia dodać 3 μl DNazy (1 U/ml) do nowej probówki polistyrenowej o pojemności 5 ml dla każdego wykonywanego trawienia.
3. Szybko wyjąć trawienia z inkubatora, dodać 75 μl FBS i odwrócić probówki 3 razy w celu wymieszania. Pozostawić na stole laboratoryjnym na 2 minuty.
4. Przenieść 1,4 ml zawiesiny komórkowej do polistyrenowej probówki 5 ml zawierającej DNazę (1 U/ml), pozostawiając w pierwotnej probówce pozostałe 0,2 ml zawiesiny komórkowej i nerki. Pozostawione 0,2 mL roztworu będzie zawierać zanieczyszczenia, takie jak macierz pozakomórkowa.
5. Mieszać zawiesinę komórkową z DNazą na nutatorze w podgrzanym do 37° C inkubatorze przez 10 minut.
6. Szybko wyjąć zawiesiny komórkowe z inkubatora i przenieść każdą z nich do probówki Eppendorf 1,5 ml. Wirować zawiesiny komórkowe w mikrowirówce przy 325 g przez 5 minut.
7. Usunąć nadsącz z granulatu komórkowego i resuspendować granulat w 1 ml 5% FBS/HBSS, pipetując w górę i w dół od 5 do 6 razy. Zamknąć każdą probówkę przed przejściem do kolejnej próbki.
8. Wirować zawiesiny komórkowe w mikrocentryfudze przy 325 g przez 5 minut.
9. Usunąć nadsącz i dodać do każdej probówki 0,5 ml bezserumowej pożywki do keratynocytów (KSFM) z dodatkami, a następnie zamknąć probówkę przed przejściem do kolejnej próbki. Po dodaniu pożywki do wszystkich probówek, delikatnie resuspendować każdy granulat komórkowy, pipetując w górę i w dół od 5 do 6 razy za pomocą mikropipety 1 ml. Połączyć wszystkie zawiesiny komórkowe w nowej polistyrenowej probówce o pojemności 5 ml.
10. Wstępnie zwilżyć KSFM dwie nakrętki z sitkiem komórkowym 40 μm umieszczone na polistyrenowej probówce o okrągłym dnie 5 ml dla każdej próbki. Przenieść zawiesiny komórkowe przez jedną nakrętkę z sitkiem za pomocą mikropipety 1 ml. Unikać dotykania filtra końcówką pipety. Zebrać przefiltrowany płyn i powtórzyć filtrację przez drugą nakrętkę z sitkiem. Zdjąć nakrętkę z sitkiem i zastąpić ją nową nakrętką z nowej polistyrenowej probówki 5 ml.
11. Policzyć komórki za pomocą hemocytometru lub innego urządzenia do liczenia komórek i przenieść komórki do dołków płytki hodowlanej pokrytej fibronektyną w gęstości 100 000-200 000 komórek na cm², rozcieńczając w razie potrzeby pożywką KSFM z dodatkami. Zazwyczaj uzyskuje się około 4,5x10⁶ komórek z miotu 10 embrionów.
12. Inkubować komórki w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37° C przy 5% CO₂.
13. Pozwolić komórkom na regenerację i przytwierdzenie się w pożywce przez 2-4 godziny przed stymulacją dodatkowymi odczynnikami. Stymulować komórki wybranym związkiem przez okres od 1 do 48 godzin. Oczyścić RNA do analizy PCR za pomocą zestawu Qiagen RNeasy Micro Kit zgodnie z instrukcjami producenta lub postępować zgodnie z poniższymi instrukcjami, aby przeprowadzić fluorescencyjne barwienie immunocytochemiczne komórek.

4. Przygotowanie odczynników do fiksacji komórek i immunobarwienia

1. Przygotować 4% PFA: Rozpuścić 4% paraformaldehyd w PBS (v/v) w temperaturze 55° C przy regularnym mieszaniu. Przed użyciem schłodzić do temperatury pokojowej. Roztwór ten jest toksyczny i należy go utylizować w wyznaczonych pojemnikach na odpady.
2. Przygotować roztwór do permeabilizacji, dodając Triton X-100 do PBS w celu uzyskania roztworu o stężeniu 0,3% (v/v).
3. Przygotować 5% roztwór blokujący w PBS z surowicą pochodzącą od tego samego gatunku, u którego wytworzono przeciwciało wtórne. Na przykład, jeśli przeciwciało przeciwko antygenowi docelowemu pochodzi od królika i będzie wykrywane za pomocą przeciwciała donkey anti-Rabbit Alexa Fluor 568, należy przygotować roztwór blokujący zawierający 5% surowicy osła. Przechowywać w temperaturze 4° C.
4. Przygotować roztwór przeciwciała pierwszorzędowego, dodając odpowiednie stężenie przeciwciała do 5% roztworu blokującego.
5. Roztwór przeciwciała wtórnego przygotować bezpośrednio przed użyciem. Dodać przeciwciało sprzężone z fluorophorem w stężeniu zalecanym przez producenta wraz z barwnikiem jądrowym DAPI i innymi markerami organelli, takimi jak faloidyna, do 5% roztworu blokującego. W przypadku konieczności przechowywania, roztwór należy trzymać w ciemności w temperaturze 4° C do momentu użycia.
6. Przygotować 50% roztwór glicerolu/PBS (v/v) do przechowywania komórek poddanych immunobarwieniu. Alternatywnie można zastosować Vectashield.

5. Fiksacja komórek i immunobarwienie

1. Poniższy protokół został opracowany w celu utrwalenia i barwienia NZC na płytce 24-dołkowej. Podane objętości dotyczą pojedynczego dołka. Podczas wszystkich etapów odczynniki należy pipetować delikatnie, aby uniknąć odklejenia komórek; w etapach inkubacji nie zaleca się wstrząsania płytki.
2. Delikatnie usunąć medium za pomocą mikropipety 1 ml i dodać 0,5 ml 4% PFA do przytwierdzonych hodowli komórkowych. Inkubować przez 15 minut bez zakłócania w temperaturze pokojowej.
3. Usunąć 4% PFA i dodać 0,5 ml roztworu do permeabilizacji na dołek. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
4. Usunąć roztwór do permeabilizacji i delikatnie przemyć dwukrotnie 0,5 ml PBS przy każdym płukaniu.
5. Dodać 0,5 ml roztworu blokującego i inkubować w temperaturze pokojowej przez 60 minut.
6. Usunąć roztwór blokujący i dodać 0,225 ml roztworu przeciwciał pierwszorzędowych.
7. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 godziny lub przez noc w 4° C.
8. Usunąć roztwór przeciwciał pierwszorzędowych i delikatnie przemyć dwukrotnie 0,5 ml PBS przy każdym płukaniu.
9. Dodać 0,225 ml roztworu przeciwciał wtórnych. Inkubować płytkę w ciemności w temperaturze pokojowej przez 60 minut.
10. Usunąć roztwór przeciwciał wtórnych i delikatnie przemyć dwukrotnie 0,5 ml PBS przy każdym płukaniu.
11. Dodać 0,3 ml 50% roztworu glicerolu/PBS (v/v) lub odpowiednią ilość Vectashield, aby pokryć dno powierzchni dołka.
12. Wykonać obrazowanie komórek za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego lub przechowywać owiniętą w folię w 4° C.

6. Reprezentatywne wyniki

Rysunek 1. Komórki NZC zostały oczyszczone z embrionów w stadium E17.5, wysiane w zagęszczeniu 200,000 komórek na cm² i inkubowane w temperaturze 37° C przez łącznie 24 godziny. Komórki obrazowano w kontraście fazowym przy użyciu odwróconego mikroskopu Leica DM IRB przed barwieniem immunofluorescencyjnym. (A) Widok w kontraście fazowym (20X) komórek NZC po 24 godzinach hodowli. (B) Komórki utrwalono i zabarwiono za pomocą króliczego przeciwciała anty-PAX2 specyficznego dla komórek progenitorowych nefronów (kolor czerwony) oraz wtórnego przeciwciała osiołczego anty-króliczego sprzężonego z Alexa Fluor 568. Zwróć uwagę na niebieskie jądra komórkowe zabarwione DAPI. (C) Widok w kontraście fazowym (40X) skupiska progenitorów nefronów (w centrum) po 24 godzinach hodowli. (D) Obraz (40X) komórek NZC izolowanych z embrionów LacZ+ szczepu Foxd1^LacZ, który wykazuje ekspresję β-galaktozydazy pod kontrolą promotora Foxd1. Foxd1 wykazuje ekspresję w populacji komórek zrębowych w strefie nefrogennej rozwijającej się nerki. Komórki zabarwiono markerem F-aktyny falloidyną (pierwotny koniugat Oregon green), barwnikiem jądrowym DAPI (kolor niebieski) oraz króliczym przeciwciałem anty-β-galaktozydazie (wtórne – osiołcze anty-królicze Alexa Fluor 568) w celu detekcji komórek zrębowych Foxd1+ (kolor czerwony).

Dyskusja

W niniejszym protokole opisujemy metodę izolacji i hodowli komórek ze strefy nefrogennej embrionalnej nerki. Jest to rozwinięcie metody opublikowanej pierwotnie w ramach badania wpływu leczenia BMP7 na komórki strefy nefrogennej (Blank et al., 2009). W początkowym badaniu przeprowadzono szereg eksperymentów w celu charakterystyki typów komórek reprezentowanych w populacji NZC. Krótko mówiąc, oczyszczanie NZC z wykorzystaniem reporterów genetycznych dla zrębu korowego (Foxd1^+/lacZ) (Hatini

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Pinceta zegarmistrzowska nr 5’	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-4905	wymagane 2 pary
Kolagenaza A	Roche Group	10 103 578 001	używać maski
Pankreatyna wieprzowa	Sigma-Aldrich	P8096	używać maski
DPBS z Ca, Mg	Lonza Inc.	17-513F	z Mg & Ca
Płodowa surowica bydlęca (FBS)	BioWhittaker	14-901E
HBSS	GIBCO, by Life Technologies	14175
KSFM	GIBCO, by Life Technologies	10724-011	bez dodanych czynników wzrostu
L-Glutamina 200mM	Sigma-Aldrich	G7513	stosować w stężeniu 1% v/v
PenStrep 10 000 U penicyliny / ml 10 mg streptomycyny / ml	Sigma-Aldrich	P4333	stosować w stężeniu 1% v/v
Fibronektyna	BD Biosciences	356008	dostarczana w proszku
Płytka hodowlana 24-dołkowa	Thermo Fisher Scientific, Inc.	142485	Nunclon
DPBS bez Mg & Ca	Lonza Inc.	17-512F
Probówki polistyrenowe 5mL	BD Biosciences	352235
DNaza (1 U/μl)	Invitrogen	18068-015	4 μl na 1.5 ml
Sito do komórek 40 mikronów	BD Biosciences	352235	z nakrętką i probówką
Paraformaldehyd	Sigma-Aldrich	P6148	stosować w stężeniu 4% w/v
Triton X100	VWR international	VW3929-2	stosować w stężeniu 0.3% v/v
PBS	Sigma-Aldrich	P3813	dostarczany w proszku
Surowica osła	Jackson ImmunoResearch	017-000-121	stosować w stężeniu 5% v/v
Królicze przeciwciało anty-PAX2	Invitrogen	71-6000	rozcieńczyć 1:100
Królicze przeciwciało anty-β-gal	MP Biomedicals	559762	rozcieńczyć 1:200
Faloidyna Oregon Green 488	Invitrogen	O7466	rozcieńczyć 1:200
Osie przeciwciało anty-królicze Alexa Fluor 568	Invitrogen	A10042	rozcieńczyć 1:200
DAPI	Invitrogen	D1306	rozcieńczyć 1:5000
Vectashield	Vector Laboratories	H-1000
Glicerol	EMD Millipore	GX0185-6	wymieszać 50% z H2O
Zestaw RNeasy Micro Kit	Qiagen	74004	stosować protokół "DNase on column"
Pipety transferowe, 3ml	BD Biosciences	357575