Analiza miomechaniczna izolowanych mięśni szkieletowych

Protokół jest wykonywany za zgodą UCSF Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).

1. Rozwarstwienie mięśnia mięśnia wydłużającego digitora, myszy (EDL)

1. Wykonuj wszystkie zabiegi na zwierzętach zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi.
2. Poddać zwierzę eutanazji za pomocą 200 mg/kg dootrzewnowego pentobarbitalu/zwichnięcia szyjki macicy tuż przed pobraniem mięśni ¹⁰. Preparacja powinna być dobrze przećwiczona, aby mięsień mógł zostać pobrany i zamontowany w przetworniku napięcia w ciągu 15 minut od eutanazji.
3. Ułóż tuszę na wznak na tacce sekcyjnej i przypnij nogę do tacy.
4. Pod mikroskopem preparacyjnym otwórz skórę, ostrożnie otwórz powięź (ryc. 1A) i złuszcz piszczel od kostki w górę, aby odsłonić EDL (ryc. 1B). Używaj kropli roztworu Ringera z mleczanami, aby mięśnie były wilgotne i buforowane podczas zbiorów.
5. Usuń EDL, zachowując jak najwięcej ścięgien na każdym końcu, i umieść na szalce Petriego zawierającej mleczanowy roztwór Ringera. Przywiąż szew do każdego ze ścięgien mięśniowych (ryc.1C). Istotne jest, aby włókna mięśniowe nie były dotykane ani naruszane podczas sekcji.

2. Montaż myszy EDL w miografie paska mięśniowego

1. Do tych badań potrzebna jest kąpiel tkankowa, która zabezpiecza mięsień, jednocześnie pozwalając mu kąpać się w roztworze fizjologicznym w stałej temperaturze z ciągłym natlenieniem. Kąpiel jest sprzężona z przetwornikiem siły do pomiaru napięcia mięśniowego. W tym celu stosujemy zintegrowaną kąpiel z miografem paskowym mięśni firmy Danish Myo Technology (DMT Model 820MS). Ponadto do wywoływania, rejestrowania i analizowania odpowiedzi miomechanicznych potrzebny jest stymulator elektryczny o impulsie kwadratowym (Grass Model S48) oraz platforma akwizycji danych (ADInstruments PowerLab Data Acquisition System i oprogramowanie LabChart). DMT 820MS ma platynowe elektrody zintegrowane z pokrywą komory, które są umieszczone po obu stronach mięśnia, w środkowej części paska mięśniowego. Inne miografy mogą wymagać szczególnej uwagi na umieszczenie elektrod.
2. Napełnij kąpiel miograficzną 5 ml roztworu Krebs Henseleit ¹¹. Podgrzać do 25°C. Bubble O₂/CO₂ (95%/5%) przez kąpiel przez 15 minut przed użyciem.
3. Użyj szwów, aby przedłużyć EDL między zaciskami miografu i zabezpieczyć ścięgna mięśnia EDL (ryc. 1D, E) między zaciskami. Uważaj, aby nie zacisnąć samego mięśnia.
4. Utrzymuj kąpiel miograficzną w temperaturze 25°C.

3. Analiza miomechaniczna

A. Napięcie w Twitchu

1. Ustaw początkową długość w wannie, aby nie było wiotkości mięśni.
2. Określ maksymalny bodziec (czas trwania 0,5 ms), dostosowując napięcie w celu uzyskania maksymalnego napięcia drgawkowego, a następnie ustaw bodziec na 20% powyżej maksymalnego (aby uzyskać bodziec supramaksymalny). W naszych badaniach bodziec supramaksymalny jest zwykle osiągany przy napięciu wyjściowym 40 woltów.
3. Sprawdź wyjście ze stymulatora za pomocą oscyloskopu.
4. Określ optymalną długość, stopniowo rozciągając mięsień, aż nie będzie dalszego wzrostu napięcia skurczowego.
5. Pozwól mięśniom zrównoważyć się przez 3 minuty.
6. Dostarcz supramaksymalny bodziec kwadratowy (0,5 ms) na optymalnej długości za pomocą elektronicznego stymulatora Grass S44 i rejestruj wyjście.
7. Zapis: krzywa napięcia drgań (P_t w funkcji czasu; Rys.2A).

B. Napięcie tężca

1. Pozwól mięśniom odpocząć przez 3 minuty.
2. Zastosuj ciąg bodźców supramaksymalnych przez 300 ms przy 150 Hz przy optymalnej długości za pomocą elektronicznego stymulatora Grass S44 i zarejestruj wyjście.
3. Zapis: krzywa napięcia tężca (P_o vs czas; Rys.2B).

C. Częstotliwość siły

1. Pozwól mięśniom odpocząć przez 3 minuty.
2. Siła-częstotliwość: zastosuj ciągi bodźców supramaksymalnych przy 30, 60, 100, 140 i 160 Hz z 3-minutowym odpoczynkiem między każdym bodźcem (rys. 3). Alternatywnie, pociągi mogą być stosowane z częstotliwościami 15, 25, 35, 45, 55, 65, 75, 100, 140 i 160 Hz w celu uzyskania lepszej rozdzielczości przy niższych częstotliwościach, gdzie siła zmienia się znacznie.
3. Wykres: zależność siła-częstotliwość (% maksymalna siła vs częstotliwość stymulacji).

D. Zmęczenie

1. Zastosuj ciąg krótkich tężyc: 60 Hz przez 300 ms (lub częstotliwość dostosowaną do wytworzenia 50% siły szczytowej), co 3 sekundy przez 10 minut. Po 10 minutach siła tężcowa powinna spaść do poziomu plateau ~15% wartości początkowej (rys.4).
2. Wykres: zmęczenie o niskiej częstotliwości (% maksymalnej siły w funkcji czasu).

E. Dodatkowe zbieranie danych na końcu protokołu

1. Przed demontażem mięśnia z miografu należy ustawić mięsień na optymalną długość, jak określono w kroku III.A.4 i zmierzyć jego średnicę za pomocą okularu pod mikroskopem lub suwmiarki. Oblicz pole przekroju poprzecznego (μm²).
2. Zmierz masę mięśniową (mg), usuwając szwy i ważąc mięśnie.
3. Zważ mysz, aby ocenić masę ciała (gm).

4. Obliczenia

1. Stosunek mięśni:masy ciała =
   masa mięśniowa/masa ciała
2. Napięcie drgań, P_t (mN) =
   Maksymalne napięcie generowane podczas drgania
3. Właściwe napięcie drgań (N / cm²) =
   naprężenie drgań (mN)/pole przekroju poprzecznego (μm²) x 10⁵ N/mN•μm²/cm²
4. Czas do osiągnięcia szczytowego napięcia (ms) =
   czas od początku skurczu do maksymalnego napięcia
5. Czas półrelaksacji (ms) =
   czas od napięcia szczytowego do 50% napięcia szczytowego
6. Napięcie tężcowe, P_O (mN) =
   maksymalne napięcie generowane podczas tężca
7. Napięcie właściwe tężcowe (N/cm²) =
   naprężenie tężcowe (mN)/pole przekroju poprzecznego (μm²) x 10⁵ N/mN•μm²/cm²
8. Maksymalne tempo wzrostu tężca (N/s) =
   maksymalne tempo wzrostu napięcia podczas wzrostu napięcia w tężcu, tj. maksymalne nachylenie tężcowej krzywej napięcia (or, dP_O/dt)
9. Napięcie tężcowe półrelaksacyjne (ms) =
   czas od ustania stymulacji do 50% napięcia w momencie zakończenia stymulacji
10. Stosunek napięcia drgawkowego do tężcowego, P_t/P_O =
    maksymalne napięcie drgań/maksymalne napięcie tężcowe
11. Wskaźnik zmęczenia=
    stosunek napięcia po dwóch minutach zmęczenia niską częstotliwością do maksymalnego napięcia izometrycznego

5. Reprezentatywne wyniki

Rysunek 1. Rozwarstwienie mięśnia EDL. A, Odsłonięcie mięśni kończyn tylnych.TA, piszczel przedni. Ur, Odsłonięcie mięśnia EDL (prostownik palca długiego). C, Zakładanie szwów na ścięgna EDL. D, Kąpiel przetwornika napięcia (widok z boku). E, EDL zamontowany w wannie (widok z góry). Mięsień jest niecałkowicie zanurzony w buforze w celach ilustracyjnych; W praktyce mięsień powinien być całkowicie zanurzony, aby zapobiec wysuszeniu.

Rysunek 2. Przykład krzywych rozciągania. A, Przykład krzywej napięcia drgań ilustrującej maksymalne napięcie drgań (PT_), czas skurczu (CT) i czas połowicznego relaksu (HRT). Bar, 1s. B, Przykład krzywej napięcia tężcowego pokazującej maksymalne napięcie tężcowe (P_o) i napięcie tężcowe półrelaksacyjne (HRTT). Bar, 1s.

Rysunek 3. Przykład analizy zależności siła-częstotliwość. A, Napięcia generowane przez częstotliwości stymulacji przyrostowej. Ur, Przykład ciągu impulsów na częstotliwości 30MHz. Bar, 80ms. C, Przykład ciągu impulsów na 140MHz. Bar, 80ms. D, Przykład krzywej siła-częstotliwość uzyskana na podstawie danych pokazanych w A. Kształt krzywej siła-częstotliwość jest charakterystyczny dla siły mięśni i może być porównywany między mięśniami różnych zwierząt.

Rysunek 4. Przykład analizy zmęczenia niskiej częstotliwości. A, Napięcia dekreacyjne generowane w okresie stymulacji o niskiej częstotliwości. Przykłady ciągów impulsowych we wskazanych punktach czasowych (B,C,D) przedstawiono poniżej. E, Przykład krzywej zmęczenia niskiej częstotliwości uzyskanej na podstawie danych przedstawionych w A. Kształt krzywej zmęczenia o niskiej częstotliwości jest charakterystyczny dla siły mięśni i może być porównywany między mięśniami różnych zwierząt.

Nie stwierdzono konfliktu interesów.