Aby ocenić efekty in vivo interwencji terapeutycznych w chorobach mięśni, konieczne są metody ilościowego pomiaru generowanej siły oraz podatności na zmęczenie w leczonych mięśniach. Szczegółowo opisujemy podejście do oceny właściwości miomechanicznych w wyizolowanym mięśniu kończyny tylnej myszy. Analiza ta stanowi solidną metodę ilościowego określania wpływu modyfikacji genetycznej na funkcję mięśni, a także porównywania terapii w modelach mysich chorób mięśni.
Artykuł metodologiczny
Analiza miomechaniczna wyizolowanego mięśnia szkieletowego
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Aby ocenić efekty in vivo interwencji terapeutycznych w leczeniu chorób mięśni 1,2,3, niezbędne są metody ilościowe pozwalające na pomiar generowanej siły oraz podatności na zmęczenie w leczonym mięśniu. Opisujemy szczegółowe podejście do oceny właściwości miomechanicznych w świeżo wyizolowanym mięśniu kończyny tylnej myszy. Opisujemy nieurazowy pobór mięśnia extensor digitorum longus u myszy, montaż mięśnia w myografie do pasków mięśniowych (Model 820MS; Danish Myo Technology) oraz pomiar maksymalnego napięcia drgającego i tężcowego, czasu skurczu i czasu połowy rozkurczu przy użyciu stymulatora impulsowego o przebiegu prostokątnym (Model S48; Grass Technologies). Wykorzystując te pomiary, demonstrujemy obliczanie specyficznego napięcia drgającego i tężcowego znormalizowanego do pola przekroju poprzecznego mięśnia, stosunku napięcia drgającego do tężcowego, krzywą zależności siły od częstotliwości oraz krzywą zmęczenia przy niskiej częstotliwości 4. Analiza ta dostarcza metody ilościowego porównania interwencji terapeutycznych w modelach mysich chorób mięśni 1,2,3,5, a także porównania wpływu modyfikacji genetycznych na funkcję mięśni 6,7,8,9.
Protokół
Protokół został wykonany za zgodą Instytucjonalnego Komitetu Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) UCSF.
1. Disekcja mięśnia prostownika długiego palców Extensor Digitorum Longus (EDL) myszy
- Wszystkie procedury z udziałem zwierząt należy przeprowadzać zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi.
- Zwierzę należy uśmiercić, podając 20 mg/kg pentobarbitalu drogą dosytroniczną lub stosując zwichnięcie szyi bezpośrednio przed pobraniem mięśnia 10. Technikę sekcji należy dobrze przećwiczyć, tak aby mięsień mógł zostać pobrany i zamocowany w przetworniku napięcia w ciągu 15 minut od uśmiercenia.
- Tułowiec należy ułożyć na plecach na tacy sekcyjnej i przytwierdzić nogę do tacy.
- Pod mikroskopem sekcyjnym należy rozciąć skórę, ostrożnie otworzyć powięź (Rys. 1A) i odsunąć mięsień piszczelowy przedni od strony kostki w górę, aby odsłonić EDL (Rys. 1B). Aby utrzymać wilgotność mięśnia i zapewnić odpowiedni bufor podczas pobierania, należy stosować krople roztworu Ringera z mleczanem.
- Należy usunąć EDL, zachowując jak największą część ścięgna na każdym z końców, i umieścić go w naczyniu Petrigo zawierającym roztwór Ringera z mleczanem. Do każdego ze ścięgien mięśnia należy przywiązać szew (Rys. 1C). Kluczowe jest, aby podczas sekcji nie dotykać ani nie naruszać włókien mięśniowych.
2. Montaż mięśnia EDL myszy w miografie do pasków mięśniowych
- Do tych badań wymagana jest kąpiel tkankowa, która unieruchamia mięsień, umożliwiając jednocześnie jego zanurzenie w roztworze fizjologicznym o stałej temperaturze i ciągłym dotlenieniu. Kąpiel jest połączona z przetwornikiem siły w celu pomiaru napięcia mięśniowego. W tym celu stosujemy zintegrowany myograf do pasków mięśniowych firmy Danish Myo Technology (DMT Model 820MS). Ponadto, do wywoływania, rejestrowania i analizy odpowiedzi myomechanicznych niezbędny jest stymulator elektryczny impulsów prostokątnych (Grass Model S48) oraz platforma akwizycji danych (system akwizycji danych ADInstruments PowerLab oraz oprogramowanie LabChart). Model DMT 820MS posiada wbudowane w pokrywę komory elektrody platynowe, które są rozmieszczone po obu stronach mięśnia, w jego środkowej części. W przypadku innych myografów należy zwrócić szczególną uwagę na rozmieszczenie elektrod.
- Napełnić kąpiel myograficzną 5 mL roztworu Krebsa-Henseleita 1. Podgrzać do 25°C. Przez 15 minut przed użyciem przesycać kąpiel mieszaniną O2/CO2 (95%/5%).
- Za pomocą szwów rozciągnąć mięsień EDL między zaciskami myografu i unieruchomić ścięgna mięśnia EDL (Ryc.1D,E) w zaciskach. Należy uważać, aby nie ucisnąć samego mięśnia.
- Utrzymywać temperaturę kąpieli myograficznej na poziomie 25°C.
3. Analiza miomechaniczna
A. Napięcie drgawek
- Ustaw początkową długość w kąpieli w taki sposób, aby mięsień nie był wiotki.
- Wyznacz bodziec maksymalny (czas trwania 0,5 ms), regulując napięcie w celu uzyskania maksymalnego napięcia skurczu, a następnie ustaw bodziec na 20% powyżej wartości maksymalnej (aby uzyskać bodziec nadmaksymalny). W naszych badaniach bodziec nadmaksymalny jest zazwyczaj osiągany przy napięciu wyjściowym 40 V.
- Zweryfikuj sygnał wyjściowy ze stymulatora za pomocą oscyloskopu.
- Wyznacz długość optymalną, stopniowo rozciągając mięsień do momentu, aż nie nastąpi dalszy wzrost napięcia skurczu.
- Pozostaw mięsień na 3 min w celu stabilizacji.
- Zastosuj nadmaksymalny prostokątny bodziec (0,5 ms) przy długości optymalnej, używając elektronicznego stymulatora Grass S4, i zarejestruj wynik.
- Zarejestruj: krzywą napięcia skurczu (Pt w funkcji czasu; Rys. 2A).
B. Napięcie tężcowe
- Pozostawić mięsień w spoczynku przez 3 minuty.
- Zastosować serię stymulacji nadmaksymalnych przez 300ms z częstotliwością 150 Hz przy optymalnej długości, używając elektronicznego stymulatora Grass S4, a następnie zarejestrować wynik.
- Zarejestrować: krzywą napięcia tężcowego (Po w funkcji czasu; Rys. 2B).
C. Zależność siły od częstotliwości
- Pozostaw mięsień do odpoczynku na 3 minuty.
- Zależność siła-częstotliwość: zastosuj serie stymulacji nadmaksymalnych o częstotliwościach 30, 60, 10, 140 i 160 Hz, zachowując 3 minuty przerwy między każdą stymulacją (Rys.3). Alternatywnie, serie można aplikować przy 15, 25, 35, 45, 5, 65, 75, 10, 140 i 160 Hz w celu uzyskania lepszej rozdzielczości przy niższych częstotliwościach, gdzie siła ulega znaczącym zmianom.
- Wykres: zależność siły od częstotliwości (% maksymalnej siły w funkcji częstotliwości stymulacji).
D. Zmęczenie
- Zastosuj serię krótkich tężców: 60 Hz przez 30 ms (lub częstotliwość dostosowaną tak, aby uzyskać 50% siły szczytowej), co 3 sekundy przez 10 minut. Po 10 minutach siła tężcowa powinna spaść do poziomu plateau wynoszącego ok. 15% wartości początkowej (Ryc. 4).
- Wykreśl: zmęczenie niskoczęstotliwościowe (% maksymalnej siły w funkcji czasu).
E. Dodatkowe gromadzenie danych na koniec protokołu
- Przed zdjęciem mięśnia z miografu, ustaw go w optymalnej długości określonej w kroku III.A.4 i zmierz jego średnicę za pomocą mikrometrycznego okularu mikroskopu lub przymiaru suwmiarkowego. Oblicz pole przekroju poprzecznego (μm2).
- Zmierz masę mięśnia (mg), usuwając szwy i ważąc mięsień.
- Zważ mysz w celu oceny masy ciała (gm).
4. Obliczenia
- Stosunek masy mięśnia do masy ciała =
masa mięśnia/masa ciała - Napięcie skurczowe, Pt (mN) =
maksymalne napięcie generowane podczas pojedynczego skurczu - Specyficzne napięcie skurczowe (N/cm2) =
napięcie skurczowe (mN)/pole przekroju poprzecznego (μm2) x 105 N/mN•μm2/cm2 - Czas do osiągnięcia maksymalnego napięcia (ms) =
czas od początku skurczu do momentu osiągnięcia maksymalnego napięcia - Czas połowy rozkurczu (ms) =
czas od maksymalnego napięcia do spadku napięcia o 50% wartości maksymalnej - Napięcie tężcowe, PO (mN) =
maksymalne napięcie generowane podczas tężca - Specyficzne napięcie tężcowe (N/cm2) =
napięcie tężcowe (mN)/pole przekroju poprzecznego (μm2) x 105 N/mN•μm2/cm2 - Maksymalna szybkość wzrostu napięcia tężcowego (N/s) =
maksymalna szybkość wzrostu napięcia podczas narastania napięcia w tężcu, tj. maksymalne nachylenie krzywej napięcia tężcowego (lub dPO/dt) - Czas połowy rozkurczu w tężcu (ms) =
czas od zaprzestania stymulacji do spadku napięcia do 50% wartości z chwili zakończenia stymulacji - Stosunek napięcia skurczowego do napięcia tężcowego, Pt/PO =
maksymalne napięcie skurczowe/maksymalne napięcie tężcowe - Wskaźnik zmęczenia =
stosunek napięcia po dwóch minutach zmęczenia o niskiej częstotliwości do maksymalnego napięcia izometrycznego
5. Reprezentatywne wyniki
Rysunek 1. Disekcja mięśnia EDL. A, Odsłonięcie mięśni kończyny tylnej. TA, mięsień piszczelowy przedni. B, odsłonięcie mięśnia prostownika długiego palców (EDL).C, Mocowanie szwów do ścięgien mięśnia prostownika długiego palców (EDL).D, Kąpiel z przetwornikiem napięcia (widok z boku). E, Mięsień EDL zamocowany w kąpieli (widok z góry). Mięsień jest zanurzony w buforze częściowo w celach ilustracyjnych; w praktyce mięsień powinien być całkowicie zanurzony, aby zapobiec jego wysychaniu.
Rysunek 2. Przykład krzywych napięcia. A, Przykład krzywej napięcia drżenia ilustrujący maksymalne napięcie drżenia (Pt), czas skurczu (CT) i połowa czasu relaksacji (HRT). Pasek skali, 1 s. B, Przykład krzywej napięcia tężcowego wykazujący maksymalne napięcie tężcowe (PProszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.) oraz połowiczne napięcie tetaniczne w fazie relaksacji (HRTT). Pasek: 1 s.
Rysunek 3. Przykład analizy zależności siły od częstotliwości. A, Napięcia generowane przez stopniowo zwiększane częstotliwości stymulacji.B, Przykład pociągu impulsów o częstotliwości 30 MHz. Pasek skali, 80 ms. C, Przykład pociągu impulsów przy 140 MHz. Odcinek skali, 80 ms. D, Przykład krzywej siła-częstotliwość opracowanej na podstawie danych przedstawionych w AKształt krzywej siła-częstotliwość jest charakterystyczny dla siły mięśnia i może być porównywany pomiędzy mięśniami pochodzącymi od różnych zwierząt.
Rysunek 4. Przykład analizy zmęczeniowej przy niskiej częstotliwości. A, Spadki napięcia generowane w okresie stymulacji o niskiej częstotliwości. Przykłady pociągów impulsów w zaznaczonych punktach czasowych (B,C,D) przedstawiono poniżej. E, Przykład krzywej zmęczeniowej dla niskich częstotliwości, opracowany na podstawie danych przedstawionych w AKształt krzywej zmęczenia niskoczęstotliwościowego jest charakterystyczny dla siły mięśni i może być porównywany pomiędzy mięśniami różnych zwierząt.
Dyskusja
Opisujemy szczegółowe podejście do oceny właściwości miomechanicznych wyizolowanego mięśnia kończyny tylnej myszy. Mięsień EDL, mimo że trudniejszy do wypreparowania ze względu na położenie za mięśniem tibialis anterior, jest łatwiejszy do oceny niż tibialis anterior dzięki wyraźnym przyczepom ścięgnistym do stawów kostki i kolana. Ścięgna te ułatwiają montaż w myografie pasków mięśniowych. W przeciwieństwie do niego, łatwiej dostępny mięsień tibialis anterior posiada szeroki, niemal pozbawiony ścięgien przyczep w stawie kolanowym, co sprawia, że jest on wyjątkowo trudny zarówno do wypreparowania bez uszkodzenia mięśnia, jak i do bezpiecznego zamocowania w myografie. Wskazujemy również, że szybkie umieszczenie mięśnia w natlenionej kąpieli w buforze fizjologicznym i odpowiedniej temperaturze jest niezbędne dla zachowania jego właściwości mechanicznych. Stwierdziliśmy, że w tych warunkach analiza ta może być powtarzana przez maksymalnie 30 minut bez istotnych zmian w odpowiedzi mięśnia. Wreszcie, kluczowe jest, aby nie dotykać włókien mięśniowych podczas procedur preparowania i montażu, ponieważ może to mieć niekorzystny wpływ na funkcję mięśnia i doprowadzić do niedoszacowania siły miomechanicznej. Stosując te procedury, analiza ta zapewnia solidne ilościowe podejście do oceny wpływu modyfikacji genetycznych na funkcję mięśni 6,7,8,9, a także do porównywania interwencji terapeutycznych w mysich modelach chorób mięśni 1,2,3,5.
Oświadczenia
Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Niniejsza praca została sfinansowana z grantu Public Health Service (HL086513) z NHLBI dla P.E.O, kompleksowego grantu badawczego z California Institute for Regenerative Medicine (RC1-00104), grantu Public Health Service (HL085377) z NHLBI oraz darowizny z Pollin Foundation dla H.S.B.
S.C. otrzymał wsparcie w ramach grantu California Institute for Regenerative Medicine Bridges to Stem Cell Research Award (TB1-01194) przyznanego San Francisco State University.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| szwy jedwabne 5-0 | Oasis | MV682 | Chirurgia ogólna |
| pinceta Dupont #5 | WPI | 500233 | Chirurgia ogólna |
| Kleszczyki hemostatyczne, proste | WPI | 501241 | Chirurgia ogólna |
| Pinceta irydowa | WPI | 15914 | Chirurgia ogólna |
| Oprogramowanie Lab Chart | ADInstruments | Wersja 7 | Analiza danych |
| Miograf do pasków mięśniowych | DMT | 820MS | Przetwarzanie napięcia |
| Nożyczki operacyjne | WPI | 501754 | Chirurgia ogólna |
| Oscyloskop | EZ | OS-5020 | Stymulacja napięciowa |
| Pentobarbital, sól sodowa | Sigma | P3761 | Eutanazja |
| PowerLab | ADInstruments | 8/30 | Pozyskiwanie danych |
| Stymulator impulsów prostokątnych | Technologia traw | S48 | Stymulacja napięciem |
| Nożyczki sprężynowe Vannasa | WPI | 14003 | Chirurgia ogólna |
Roztwory i pożywki | |||
roztwór Ringera z mleczanem | |||
<µl>
| |||
roztwór Krebsa-Henseleita | |||
| |||
Pentobarbital | |||
|
Bibliografia
- Harcourt, L. J., Schertzer, J. D., Ryall, J. G., Lynch, G. S. Low dose formoterol administration improves muscle function in dystrophic mdx mice without increasing fatigue. Neuromuscul Disord. 17, 47-55 (2007).
- Messina, S. VEGF overexpression via adeno-associated virus gene transfer promotes skeletal muscle regeneration and enhances muscle function in mdx mice. FASEB J. 21, 3737-3746 (2007).
- Danieli-Betto, D. Sphingosine 1-phosphate protects mouse extensor digitorum longus skeletal muscle during fatigue. Am J Physiol Cell Physiol. 288, C1367-C1373 (2005).
- MacIntosh, B. R., Willis, J. C. Force-frequency relationship and potentiation in mammalian skeletal muscle. J Appl Physiol. 88, 2088-2096 (2000).
- Hayes, A., Williams, D. A. Contractile properties of clenbuterol-treated mdx muscle are enhanced by low-intensity swimming. J Appl Physiol. 82, 435-439 (1997).
- Coulton, G. R., Curtin, N. A., Morgan, J. E., Partridge, T. A. The mdx mouse skeletal muscle myopathy: II. Contractile properties. Neuropathol Appl Neurobiol. 14, 299-314 (1988).
- Danieli-Betto, D. Deficiency of alpha-sarcoglycan differently affects fast- and slow-twitch skeletal muscles. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 289, R1328-R1337 (2005).
- Chan, S. A gene for speed: contractile properties of isolated whole EDL muscle from an alpha-actinin-3 knockout mouse. Am J Physiol Cell Physiol. 295, C897-C904 (2008).
- Personius, K. E. Grip force, EDL contractile properties, and voluntary wheel running after postdevelopmental myostatin depletion in mice. J Appl. , Forthcoming (2010).
- Donovan, J., Brown, P. Euthanasia. Curr Protoc Immunol. Chap 1, (2006).
- Beekley, M. D., Wetzel, P., Kubis, P., Gros, G. Contractile properties of skeletal muscle fibre bundles from mice deficient in carbonic anhydrase II. Pflugers Arch. 452, 453-463 (2006).
Przedruki i uprawnienia
Przeglądaj więcej artykułów
