Niniejszy film prezentuje zastosowanie obrazowania bioluminescencyjnego in vivo do badania odpowiedzi immunologicznych po implantacji sztucznie wyhodowanej tkanki serca (EHT) u szczurów.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Obrazowanie bioluminescencyjne do oceny odpowiedzi immunologicznej po implantacji inżynieryjnej tkanki serca (EHT)
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
W ciągu ostatnich dziesięcioleci rozwijano różne techniki inżynierii tkanki serca, w tym strategie wykorzystujące materiały rusztowaniowe naturalne lub bioartystyczne, unieruchamianie miocytów serca w hydrożelach, takich jak fibryna lub kolagen, a także nakładanie warstw monowarstw miocytów 1. Koncepcje te mają na celu przywrócenie upośledżonej funkcji serca (np. po zawałe mięśnia sercowego) lub służą jako modele eksperymentalne (np. w toksykologii predykcyjnej, przesiewaniu substancji lub modelowaniu chorób). Dzięki zastosowaniu technik obrazowania bioluminescencyjnego in-vivo (BLI) możliwe stało się obecnie precyzyjne monitorowanie przeżywalności komórek po implantacji inżynieryjnej tkanki serca (EHT) 2. W niniejszej pracy opisujemy wytwarzanie EHT na bazie fibryny z transgenicznej linii szczurów z powszechną ekspresją lucyferazy świetlika (ROSA/luciferase-LEW Tg; 3). Implantację wykonuje się w sieci większą różnych szczepów szczurów, aby ocenić odpowiedzi immunologiczne organizmu biorcy po wszczepieniu EHT. Porównanie wyników uzyskanych za pomocą BLI oraz techniki Enzyme Linked Immuno Spot (ELISPOT) potwierdza przydatność BLI do oceny odpowiedzi immunologicznych.
Protokół
1. Generowanie EHT i warunki hodowli
Wytwarzanie EHT na bazie fibryny przeprowadzono zgodnie z opisem przedstawionym w innym opracowaniu 4. W skrócie, aby wytworzyć EHT na bazie fibryny do celów implantacji, przygotowano mieszaninę główną (master mix) zawierającą komórki izolowane z serc noworodkowych transgenicznych szczurów ROSA/luciferase-LEW, fibrynogen bydlęcy oraz Matrigel. Formy odlewnicze z agarozy przygotowano, używając teflonowych przekładek umieszczonych w 6-dołkowych naczyniach hodowlanych. Po zestaleniu agarozy przekładki usunięto, a na naczyniach hodowlanych umieszczono silikonowe stelaże z trzpieniami wnikającymi do form. Aby wytworzyć EHT, mieszaninę główną krótko zmieszano z obliczoną ilością trombiny i naniesiono pipetą do formy. Po polimeryzacji fibrynogenu silikonowe stelaże z przylegającymi do trzpieni EHT ostrożnie wyjęto z form odlewniczych z agarozy, przeniesiono do nowych 6-dołkowych naczyń do hodowli komórek i inkubowano w temperaturze 37°C i 7% CO2 w inkubatorze do hodowli komórek, stosując specjalnie przygotowaną pożywkę hodowlaną.
Tkanki sercowe inżynieryjnie wytworzone (EHT) utrzymywano w warunkach hodowli komórkowej do dziesiątego dnia. W tym czasie neonatalne komórki serca szczura zaczęły się wydłużać, łączyć i układać wzdłuż linii sił między silikonowymi słupkami. W momencie implantacji zaobserwowano spontaniczne, spójne skurcze, które powodowały odchylenie silikonowych słupków.
2. Implantacja EHT
Implantację EHT przeprowadzono u szczurów Brown Norway (BN) o zachowanej odporności lub u immunodeficientnych szczurów nagich w celu zbadania allogenicznej odpowiedzi immunologicznej. Szczury BN i nagie o masie 100 - 150 g zakupiono w Charles River Germany (Sandhofer Weg 7, D-97633 Sulzfeld) i utrzymywano w konwencjonalnych warunkach, podając standardową karmę dla szczurów oraz wodę ad libidum. Szczury immunodeficientne utrzymywano w sterylnej ściółce i klatkach, a do pojenia używano sterylnej wody. Procedury dotyczące zwierząt zostały przeanalizowane i zatwierdzone przez niemiecką komisję etyczną. Wszystkie instrumenty chirurgiczne poddano sterylizacji przed użyciem.
Procedurę implantacji przeprowadza się w następujący sposób:
Szczury są znieczulane izofluranem (2,5-3%) przy użyciu komory indukcyjnej. Ekspozycję ludzi na izofluran można ograniczyć, pracując przy stole z wyciągiem dolnym lub w dygestorium bez recyrkulacji. Podczas procedury chirurgicznej utrzymywana jest temperatura ciała.
- Wygolić obszar brzucha i nałożyć maść do oczu, aby zapobiec wysychaniu oczu podczas znieczulenia.
- Położyć szczura na plecach i założyć maskę na nos i pysk, aby podtrzymać znieczulenie.
- Zdezynfekować obszar brzucha, używając Betadinu, a następnie 80% etanolu. Przetrzeć od miejsca czystego do brudnego, od centrum wygolonego obszaru na zewnątrz, w kierunku obszaru owłosionego.
- Sprawdzić odruchy, uszczypiając tylne łapy, aby upewnić się, że szczur jest odpowiednio znieczulony.
- Założyć sterylne pole i wykonać cięcie w linii środkowej brzucha, oddzielając skórę i mięśnie w dwóch etapach w celu otwarcia jamy brzusznej. Pomiędzy otwarciem skóry a mięśni stosuje się sterylizację gorącym koralikiem.
- Umieścić jelita w ogrzanej soli fizjologicznej wewnątrz rękawiczki bezpudrowej. Zwinąć rękawiczkę wokół jelit, aby zapobiec utracie wilgoci.
- Usunąć tkankę tłuszczową i odsłonić śledzionę.
- Zlokalizować i rozsunąć siecią większą za pomocą pęsety.
- Ostrożnie odciąć EHT od podtrzymujących słupków silikonowych i przenieść na siecią większą.
- Owinąć siecią większą wokół EHT i przymocować za pomocą dwóch pojedynczych szwów z Prolene 7-0 (Ethicon, Norderstedt, Niemcy).
- Następnie przenieść jelita z powrotem do jamy brzusznej.
- Przepłukać jamę brzuszną uprzednio ogrzaną sterylną solą fizjologiczną.
- Zamknąć warstwę mięśniową ściany brzucha, używając ciągłych szwów z Prolene 6-0 (Ethicon, Norderstedt, Niemcy).
- Użyć ciągłych szwów z Prolene 5-0 (Ethicon, Norderstedt, Niemcy) do zamknięcia skóry.
- Gdy szczur nadal znajduje się pod wpływem znieczulenia, wstrzyknąć podskórnie 5 mg/kg Karprofenu.
- Aby zapewnić wystarczającą analgezję przy tego typu zabiegu, do wody pitnej dodaje się lek przeciwbólowy (taki jak Metamizol) (50 mg Metamizolu na 100 ml) w celu leczenia bólu przez 3 dni po transplantacji.
3. Obrazowanie bioluminescencyjne EHT po implantacji
Platforma obrazowania biologicznego IVIS (Xenogen, Alameda, CA, USA) jest wykorzystywana do nieinwazyjnego obrazowania bioluminescencyjnego in-vivo, a wyniki są analizowane przy użyciu pakietu oprogramowania IVIS Living Image (Xenogen). Obrazowanie jest przeprowadzane codziennie, zaczynając od 2 godzin po zabiegu operacyjnym.
Zanurz szczura w narkozie z użyciem izofluranu (2,5 - 3%) w komorze indukcyjnej.
- Szeroko zdezynfekuj obszar brzucha i klatki piersiowej za pomocą Provo-Iodine, następnie użyj 80% etanolu; powtórz ten krok trzy razy.
- Wstrzyknij d-lucyferynę (Xenogen; 375 mg/kg masy ciała) do opłucznej brzusznej (i.p.).
- Umieść znieczulone szczury w komorze obrazowania IVIS (jednocześnie można analizować do 4 szczurów).
- Oceń natężenie sygnału komórek luc+ wewnątrz EHT w jednostkach photons/sec/cm2/steridian w obszarze zainteresowania (ROI) w punkcie wyjściowym (120 minut po implantacji) oraz w dniach 1, 2, 3, 5, 7, 10 oraz w tygodniach 2, 3 i 4. Odnotuj sygnał szczytowy (pojawia się około 20 minut po wstrzyknięciu d-lucyferyny).
Utwórz wykres (Excel) przedstawiający intensywność sygnału w czasie.
4. Korelacja wyników BLI i ELISPOT
Komórkowe odpowiedzi immunologiczne in-vivo u szczurów BN immunokompetentnych oraz szczurów nago immunodeficientnych badano po transplantacji EHT. Śledziony zwierząt biorców pobrano 5 dni po transplantacji EHT w celu izolacji splenocytów biorcy. Testy Elispot, w których jako stymulator wykorzystano EHT zahamowane mitycyną (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA), a jako komórki odpowiadające 5 x106 splenocytów biorcy, przeprowadzono zgodnie z protokołem producenta (BD Biosciences), używając płytek pokrytych IFN-γ oraz IL-4 w celu zbadania odpowiednio odpowiedzi TH1 oraz TH2. Liczba plamek IFN-γ oraz IL-4 była znacząco wyższa w modelu immunokompetentnym w porównaniu z modelem immunodeficientnym (IFN-γ: p= 0.001; IL-4: p=0.023; test t Studenta).
5. Reprezentatywne wyniki:
Rycina 1. Korelacja wyników BLI i ELISPOT a) Badano komórkowe odpowiedzi immunologiczne in vivo u immunokompetentnych szczurów rasy Brown Norway oraz niedoborowych szczurów nago po implantacji EHT. Splenocyty biorców pobrano 5 dni po implantacji EHT. Ekspresję IFNγ oraz IL-4 oceniono za pomocą testów ELISpot, stosując EHT zahamowane mitycyną jako stymulatory oraz 5x106 splenocytów biorcy jako komórki odpowiadające. Odpowiedzi Th1 i Th2 były znacznie wyższe w modelu immunokompetentnym w porównaniu z modelem niedoborowym, co potwierdzono odpowiednio poprzez produkcję IFNγ i IL-4. b) Luc+ EHT przeszczepiono do sieci większej sieci u immunokompetentnych szczurów BN lub niedoborowych szczurów nago. Przeżywalność komórek monitorowano podłużnie za pomocą BLI. Przedstawiono odsetek zwierząt, które odrzuciły przeszczepione EHT. Wszystkie szczury BN szybko odrzuciły przeszczepy EHT, podczas gdy komórki przeżyły u szczurów z niedoborem limfocytów T.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Przed wdrożeniem klinicznym technologii EHT w celu naprawy serca, w modelach eksperymentalnych należy ocenić fundamentalne kwestie, takie jak immunogenność zarówno komponentów komórkowych, jak i macierzy, oraz przeżywalność przeszczepu po implantacji. Obrazowanie bioluminescencyjne in-vivo stanowi przydatną, nową technikę monitorowania przeżywalności komórek po transplantacji. Poprzez adaptację uznanego protokołu 4 pomyślnie wytworzyliśmy EHT na bazie fibryny zawierające komórki serca dodatnie pod kąt...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano konfliktów interesów.
Podziękowania
Sonja Schrepfer, Lenard Conradi oraz Arne Hansen otrzymali finansowanie z Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG; SCHR992/3-1, SCHR992/4-1, CO 858/1-1, HA 3423/3-1). Praca była również wspierana przez granty z Unii Europejskiej przyznane Thomasowi Eschenhagenowi (EUGeneHeart oraz Angioscaff).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
|
Bibliografia
- Eschenhagen, T., Zimmermann, W. H. Engineering myocardial tissue. Circ Res. 97, 1220-1231 (2005).
- van der Bogt, K. E., Schrepfer, S., Yu, J. Comparison of transplantation of adipose tissue- and bone marrow-derived mesenchymal stem cells in the infarcted heart. Transplantation. 87, 642-652 (2009).
- Hakamata, Y., Murakami, T., Kobayashi, E. "Firefly rats" as an organ/cellular source for long-term in vivo bioluminescent imaging. Transplantation. 81, 1179-1184 (2006).
- Hansen, A., Eder, A. Development of a Drug Screening Platform Based on Engineered Heart Tissue. Circ Res. , (2010).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
