Artykuł metodologiczny

iCLIP – Mapowanie oddziaływań białko-RNA w całym transkryptomie z rozdzielczością pojedynczych nukleotydów

59.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/2638

⸱

30 kwietnia 2011

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Molecular Biology, Medical Research Council - MRC, 2European Bioinformatics Institute, EMBL Heidelberg, 3Computer and Information Science, University of Ljubljana, 4Wellcome Trust Genome Campus, Wellcome Trust Sanger Institute

W tym artykule

Informacja o sprostowaniu

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Podsumowanie

Przestrzenne rozmieszczenie białek wiążących RNA na transkrypcie jest kluczowym czynnikiem regulacji potranskrypcyjnej. Opracowaliśmy zatem metodę sieciowania promieniami UV i immunoprecypitacji z rozdzielczością pojedynczego nukleotydu (iCLIP), która umożliwia precyzyjne mapowanie w całym genomie miejsc wiązania białka wiążącego RNA.

Streszczenie

Unikalny skład i rozmieszczenie przestrzenne białek wiążących RNA (RBPs) na transkrypcie kierują różnymi aspektami regulacji potranskrypcyjnej1. Dlatego też kluczowym krokiem w stronę zrozumienia regulacji transkryptu na poziomie molekularnym jest uzyskanie informacji o położeniu miejsc wiązania RBPs2.

Interakcje białko-RNA można badać za pomocą metod biochemicznych, jednak podejścia te nie uwzględniają wiązania RNA w jego natywnym kontekście komórkowym. Pierwsze próby badania kompleksów białko-RNA w ich środowisku komórkowym wykorzystywały oczyszczanie powinowactwem lub immunoprecypitację w połączeniu z analizą differential display lub mikromacierzy (RIP-CHIP)3-5. Metody te były podatne na identyfikację interakcji pośrednich lub niefizjologicznych6. W celu zwiększenia specyficzności i rozdzielczości pozycyjnej wprowadzono strategię zwaną CLIP (sieciowanie promieniami UV i immunoprecypitacja)7,8. Metoda CLIP łączy sieciowanie białek i cząsteczek RNA promieniami UV z rygorystycznymi schematami oczyszczania, w tym denaturującą elektroforezą w żelu poliakryloamidowym. W połączeniu z technologiami sekwencjonowania wysokoprzepustowego, CLIP okazał się potężnym narzędziem do badania interakcji białko-RNA w skali całego genomu (określanym jako HITS-CLIP lub CLIP-seq)9,10. Niedawno wprowadzono metodę PAR-CLIP, która do siecikowania wykorzystuje fotoreaktywne analogi rybonukleozydów11,12.

Mimo wysokiej swoistości uzyskanych danych, eksperymenty CLIP często generują biblioteki cDNA o ograniczonej złożoności sekwencji. Wynika to częściowo z niewielkiej ilości współoczyszczonego RNA oraz dwóch nieefektywnych reakcji ligacji RNA wymaganych do przygotowania biblioteki. Ponadto testy rozszerzania starterów wykazały, że wiele cząsteczek cDNA ulega przedwczesnemu skróceniu w miejscu nukleotydu poddanego sieciowaniu13. Takie skrócone cDNA są tracone podczas standardowego protokołu przygotowania biblioteki CLIP. Opracowaliśmy niedawno metodę iCLIP (CLIP o rozdzielczości pojedynczego nukleotydu), która pozwala na wychwycenie skróconych cDNA poprzez zastąpienie jednego z nieefektywnych etapów międzycząsteczkowej ligacji RNA bardziej efektywną wewnątrzcząsteczkową cyklizacją cDNA (Rycina 1)14. Co istotne, sekwencjonowanie skróconych cDNA pozwala na określenie pozycji miejsca sieciowania z rozdzielczością pojedynczego nukleotydu. Z sukcesem zastosowaliśmy iCLIP do badania organizacji cząsteczek hnRNP C w skali całego genomu oraz oceny ich roli w regulacji splicingu14.

Protokół

1. Sieciowanie promieniami UV komórek hodowli tkankowych

  1. Usunąć medium i dodać 6 ml schłodzonego w lodzie PBS do komórek hodowanych na płytce 10 cm (ilość wystarczająca na trzy eksperymenty).
  2. Zdjąć pokrywkę i umieścić płytkę na lodzie. Naświetlić jednorazowo dawką 150 mJ/cm2 przy 254 nm.
  3. Zebrać komórki, zeskrobując je za pomocą cell liftera.
  4. Przenieść po 2 ml zawiesiny komórkowej do każdej z trzech probówek typu mikrotuba. Wirować z maksymalną prędkością przez 10 sec w 4°C w celu osadzenia komórek, a następnie usunąć nadsącz.
  5. Szybko zamrozić osady komórkowe w suchym lodzie i przechowywać w -80°C do momentu użycia.

2. Przygotowanie kulek

  1. Do nowej mikroprobówki dodać 10 μl kulek Dynabeads z białkiem A (Dynal, 10.02) na każdy eksperyment (w przypadku przeciwciał przeciwko mysim lub kozim należy użyć kulek Dynabeads z białkiem G).
  2. Kulki przemyć 2x buforem do lizy (50 mM Tris-HCl, pH 7.4; 100 mM NaCl; 1% NP-40; 0.1% SDS; 0.5% deoksycholan sodu; 1/100 koktajl inhibitorów proteaz III, Calbiochem).
  3. Kulki resuspender w 10 μl buforu do lizy z dodatkiem 2-10 μg przeciwciała.
  4. Probówki rotować w temperaturze pokojowej przez 30-60 min.
  5. Przemyć 3x 90 μl buforem do lizy i pozostawić w ostatnim przemyciu do momentu przejścia do kroku 4.1.

3. Lizacja komórek i częściowe trawienie RNA

  1. Resuspendować osad komórkowy w 1 ml buforu do lizy i przenieść do mikroprobówek o pojemności 1,5 ml.
  2. Przygotować rozcieńczenie RNazy I (Ambion, AM295) w stosunku 1/50. Do lizatu komórkowego dodać 10 μl rozcieńczenia RNazy I oraz 2 μl Turbo DNazy (rozcieńczenia RNazy I 1/50 [niska zawartość RNazy] stosuje się do przygotowania bibliotek; rozcieńczenia 1/50 [wysoka zawartość RNazy] są niezbędne do kontroli swoistości przeciwciał).
  3. Inkubować próbki przez dokładnie 3 min w temperaturze 37°C, wstrząsając z prędkością 1 10 rpm. Bezzwłocznie przenieść na lód.
  4. Wirować w temperaturze 4°C przy 2 0 g przez 20 min w celu oczyszczenia lizatu. Ostrożnie zebrać nadsącz (pozostawiając około 50 μl lizatu z osadem).

4. Immunoprecypitacja

  1. Usunąć bufor piorący z kulek (z kroku 2.5), a następnie dodać lizat komórkowy (z kroku 3.4).
  2. Inkubować próbki w rotatorze przez 2 h w temperaturze 4°C.
  3. Odlać supernatant i przemyć kulki 2x przy użyciu 90 μl buforu wysokosolnego (50 mM Tris-HCl, pH 7.4; 1 M NaCl; 1 mM EDTA; 1% NP-40; 0.1% SDS; 0.5% deoksycholanu sodu).
  4. Przemyć 2x przy użyciu 90 μl buforu piorącego (20 mM Tris-HCl, pH 7.4; 10 mM MgCl2; 0.2% Tween-20).

5. Defosforylacja końców 3' RNA

  1. Odlać supernatant i resuspender kuleczki w 20 μl mieszaniny PNK (15 μl wody; 4 μl buforu 5x PNK pH 6.5 [350mMTris-HCl, pH 6.5; 50mMMgCl2 25mM ditiotreitolu]; 0,5 μl enzymu PNK; 0,5 μl RNasin [Promega]).
  2. Inkubować przez 20 min w temperaturze 37°C.
  3. Dodać 50 μl buforu do przemywania i przemyć 1x buforem wysokosolnym.
  4. Przemyć 2x buforem do przemywania.

6. Ligacja linkerów do końców 3' RNA

  1. Ostrożnie usunąć nadsącz i resuspendować kuleczki w 20 μl mieszaniny ligacyjnej (9 μl wody; 4 μl 4x buforu do ligacji [20 mMTris-HCl; 40m MM gCl2; 40 mM ditiotreitol]; 1 μl ligazy RNA [NEB]; 0,5 μl RNasin [Promega]; 1,5 μl preadenylowanego linkera L3 [20 μM]; 4 μl PEG400 [8170, Sigma]).
  2. Inkubować przez noc w temperaturze 16°C.
  3. Dodać 50 μl buforu do przemywania, a następnie przemyć 2x przy użyciu 1 ml buforu wysokosolnego.
  4. Przemyć 2x przy użyciu 1 ml buforu do przemywania i pozostawić w 1 ml buforu z drugiego przemycia.

7. Znakowanie końca 5' RNA

  1. Usunąć nadsącz i resuspendować kuleczki w 8 μl gorącej mieszaniny PNK (0,4 μl PNK [NEB]; 0,8 μl 32P-γ-ATP; 0,8 μl 10x buforu PNK [NEB]; 6 μl wody).
  2. Inkubować przez 5 min w temperaturze 37°C.
  3. Usunąć gorącą mieszaninę PNK i resuspendować kuleczki w 20 μl 1x buforu do ładowania Nupage (Invitrogen).
  4. Inkubować w termomikserze w temperaturze 70°C przez 10 min.
  5. Niezwłocznie umieścić na magnesie, aby wytrącić puste kuleczki, a nadsącz nałożyć na żel (patrz krok 8).

8. SDS-PAGE i transfer na membranę

  1. Nanieś próbki na żel NuPAGE Bis-Tris 4-12% (Invitrogen) zgodnie z instrukcją producenta. Użyj 0,5 l buforu do elektroforezy 1x MOPS (Invitrogen). Nanieś również 5 μl wstępnie zabarwionego markera wielkości białek (na przykład PAGE ruler plus, Fermentas, SM1811).
  2. Prowadź elektroforezę przez 50 min przy napięciu 180 V.
  3. Usuń front żelu i zutylizuj go jako odpad stały (zawiera wolny radioaktywny ATP).
  4. Przenieś kompleksy białko-RNA z żelu na membranę nitrocelulozową, korzystając z aparatury do transferu mokrego Novex zgodnie z instrukcją producenta (Invitrogen, transfer przez 1 h przy 30 V).
  5. Po transferze wypłucz membranę w buforze PBS, a następnie owiń ją folią spożywczą i naświetl na filmie Fuji w temperaturze -80°C (obok membrany umieść naklejkę fluorescencyjną, aby później wyrównać film i membranę; przeprowadź naświetlanie przez 30 min, 1 h oraz przez noc).

9. Izolacja RNA

  1. Wyizoluj kompleksy białko-RNA z eksperymentu z niską aktywnością RNazy, wykorzystując autoradiogram z kroku 8.5 jako maskę. Potnij ten fragment membrany na kilka małych pasków i umieść je w mikroprobowce o pojemności 1,5 ml.
  2. Dodaj do fragmentów membrany 20 μl buforu PK (10 mM Tris-HCl pH 7,4; 50 mM NaCl; 10 mM EDTA) oraz 10 μl proteinazy K (Roche, 031582801). Inkubuj z wytrząsaniem przy 10 rpm przez 20 min w temperaturze 37°C.
  3. Dodaj 20 μl buforu PKurea (100 mM Tris-HCl pH 7,4; 50 mM NaCl; 10 mM EDTA; 7 M mocznika) i inkubuj przez 20 min w temperaturze 37°C.
  4. Zbierz roztwór i przelej go wraz z 40 μl RNA phenol/chloroform (Ambion, 972) do probówki Phase Lock Gel Heavy o pojemności 2 ml (713-2536, VWR).
  5. Inkubuj przez 5 min w temperaturze 30°C, wytrząsając przy 110 rpm. Rozdziel fazy, wirując przez 5 min przy 13 0 rpm w temperaturze pokojowej.
  6. Przenieś warstwę wodną do nowej probówki (należy uważać, aby nie dotknąć pipetą żelu). Dodaj 0,5 μl glycoblue (Ambion, 9510) oraz 40 μl 3 M octanu sodu o pH 5,5 i wymieszaj. Następnie dodaj 1 ml 10% etanolu, ponownie wymieszaj i pozostaw do precypitacji przez noc w temperaturze -20°C.

10. Odwrotna transkrypcja

  1. Wiruj przez 20 min przy 15 0 rpm i 4°C. Odlej supernatant i przemyj osad 0,5 ml 80% etanolu.
  2. Resuspenduj osad w 7,25 μl mieszaniny RNA/starter (6,25 μl wody; 0,5 μl startera Rclip [0,5pmol/μl]; 0,5 μl mieszaniny dNTP [10mM]). Dla każdego eksperymentu lub powtórzenia użyj innego startera Rclip zawierającego indywidualne sekwencje kodów kreskowych (patrz 14).
  3. Inkubuj przez 5 min w 70°C przed schłodzeniem do 25°C.
  4. Dodaj 2,75 μl mieszaniny RT (2 μl buforu RT 5x; 0,5 μl DTT 0,1M; 0,25 μl odwrotnej transkryptazy Superscript III [Invitrogen]).
  5. Inkubuj przez 5 min w 25°C, 20 min w 42°C, 40 min w 50°C i 5 min w 80°C przed schłodzeniem do 4°C.
  6. Dodaj 90 μl buforu TE, 0,5 μl glycoblue oraz 10 μl octanu sodu pH 5,5 i wymieszaj. Następnie dodaj 250 μl 10% etanolu, ponownie wymieszaj i wytrącaj przez noc w -20°C.

1. Oczyszczanie cDNA za pomocą elektroforezy żelowej

  1. Odwirować i przemyć próbki (patrz 10.1), a następnie resuspender osady w 6 μl wody.
  2. Dodać 6 μl 2x TBE-urea loading buffer (Invitrogen). Bezpośrednio przed nałożeniem podgrzać próbki do 80°C przez 3 min.
  3. Nałożyć próbki na gotowy żel 6% TBE-urea (Invitrogen) i prowadzić elektroforezę przez 40 min przy 180 V zgodnie z instrukcją producenta. Nałożyć również marker niskiej masy cząsteczkowej w celu późniejszego wycięcia prążków (patrz poniżej).
  4. Wyciąć trzy prążki w zakresach 120-20 nt (wysoki), 85-120 nt (średni) i 70-85 nt (niski). W celu precyzyjnego wycięcia posłużyć się górnym barwnikiem oraz oznaczeniami na plastikowej płytce wsporczej żelu (patrz Rysunek 3). Należy pamiętać, że primer Rclip oraz sekwencja L3 łącznie stanowią 52 nt sekwencji CLIP.
  5. Dodać 40 μl TE i rozdrobić fragment żelu na małe kawałki za pomocą tłoka strzykawki 1 ml. Inkubować przy wstrząsaniu z prędkością 1 10 rpm przez 2 h w 37°C.
  6. Włożyć dwa szklane prefiltry 1 cm (Whatman, 1823010) do kolumny Costar SpinX (Corning Incorporated, 8161). Przenieść ciekłą część próbki do kolumny. Wirować przez 1 min przy 13 0 rpm do probówki 1,5 ml.
  7. Dodać 0,5 μl glycoblue i 40 μl octanu sodu pH 5.5, a następnie wymieszać próbkę. Dodać 1 ml 10% etanolu, ponownie wymieszać i wytrącać przez noc w temperaturze -20°C.

12. Ligacja primera do końca 5' cDNA

  1. Odwiruj i przemyj próbki (patrz 10.1), a następnie resuspenduj osady w 8 μl mieszaniny do ligacji (6,5 μl wody; 0,8 μl 10x CircLigase Buffer II; 0,4 μl 50 mM MnCl2; 0,3 μl; Circligase II [Epicentre]) i inkubuj przez 1 h w temperaturze 60°C.
  2. Dodaj 30 μl mieszaniny do hybrydyzacji oligonukleotydów (26 μl wody; 3 μl FastDigest Buffer [Fermentas]; 1 μl cut_oligo [10 μM]). Inkubuj przez 1 min w temperaturze 95°C. Następnie obniżaj temperaturę co 20 s o 1°C, aż do osiągnięcia 25°C.
  3. Dodaj 2 μl BamHI (Fast Fermentas) i inkubuj przez 30 min w temperaturze 37°C.
  4. Dodaj 50 μl TE oraz 0,5 μl glycoblue i wymieszaj. Dodaj 10 μl octanu sodu pH 5,5 i wymieszaj, a następnie dodaj 250 μl 10% etanolu. Ponownie wymieszaj i pozostaw do precypitacji przez noc w temperaturze -20°C.

13. Amplifikacja PCR

  1. Odwirować i przemyć próbki (patrz 10.1), a następnie zawiesić osad w 19 μl wody.
  2. Przygotować mieszaninę do PCR (19 μl cDNA; 1 μl mieszaniny starterów P5/P3 solexa, każdy w stężeniu 10 μM; 20 μl Accuprime Supermix 1 enzyme [Invitrogen]).
  3. Przeprowadzić następujący program PCR: 94°C przez 2 min, [94°C przez 15 sec, 65°C przez 30 sec, 68°C przez 30 sec]25-35 cykli, 68°C przez 3 min, 4°C w nieskończoność.
  4. Zmieszać 8 μl produktu PCR z 2 μl 5x TBE buforu do nakładania próbek i nałożyć na gotowy żel TBE 6% (Invitrogen). Zbarwić żel barwnikiem Sybrgreen I (Invitrogen) i przeanalizować za pomocą systemu obrazowania żeli.
  5. Kody kreskowe w starterach Rclip umożliwiają multipleksowanie różnych próbek przed przekazaniem ich do sekwencjonowania wysokoprzepustowego. Przekazać 15 μl biblioteki do sekwencjonowania, a resztę przechowywać.

14. Sekwencje linkerów i starterów

Pre-adenylowany łącznik DNA 3':

[Zamawiamy adapter DNA z firmy IDT, a następnie przygotowujemy alikwoty o stężeniu 20μM.]

Równowaga statyczna: primery odwrotnej transkryptazy z kodami kreskowymi, metoda sekwencjonowania DNA, wykaz sekwencji.

15. Reprezentatywne wyniki:

Przed sekwencjonowaniem biblioteki iCLIP sukces eksperymentu można monitorować na dwóch etapach: za pomocą autoradiografii kompleksu białko-RNA po transferze na membranę (krok 8.5) oraz obrazu żelowego produktów PCR (krok 13.4). Na autoradiografii próbek z niskim stężeniem RNazy powinna być widoczna rozproszona radioaktywność powyżej masy cząsteczkowej białka (Rysunek 2, próbka 4). W przypadku próbek z wysokim stężeniem RNazy radioaktywność ta skupia się bliżej masy cząsteczkowej białka (Rysunek 2, próbka 3). Gdy w immunoprecypitacji nie zastosowano przeciwciała, nie powinno być wykryte żadnego sygnału (Rysunek 2, próbki 1 i 2). Dalsze istotne kontrole swoistości immunoprecypitacji polegają na pominięciu naświetlania UV lub zastosowaniu komórek, które nie wykazują ekspresji badanego białka14.

Obraz żelu z produktami PCR (krok 13.4) powinien wykazać zakres wielkości odpowiadający frakcji cDNA (wysokiej, średniej lub niskiej) oczyszczonej w kroku 11.4 (Rysunek 4, ścieżki 4-6). Należy pamiętać, że primery PCR P3Solexa i P5Solexa dodają dodatkowe 76 nt do wielkości cDNA. Jeśli podczas immunoprecypitacji nie zastosowano przeciwciał, nie powinny zostać wykryte odpowiadające im produkty PCR (Rysunek 4, ścieżki 1-3). Produkt dimerów primerów może pojawić się przy około 140 nt.

Reprezentatywne wyniki sekwencjonowania wysokoprzepustowego i późniejszych analiz bioinformatycznych przedstawiono w punkcie14.

Mapowanie oddziaływań RNA-białko; sieciowanie UV; schemat doświadczalny; sekwencjonowanie, elektroforeza żelowa.
Rysunek 1. Schematyczny przebieg protokołu iCLIP. Kompleksy białko-RNA są sieciowane kowalencyjnie in vivo z wykorzystaniem naświetlania promieniami UV (krok 1). Białko docelowe jest oczyszczane wraz z związanym RNA (kroki 2–5). Aby umożliwić specyficzne sekwencyjnie inicjowanie odwrotnej transkrypcji, do końca 3' RNA liguje się adapter RNA, natomiast koniec 5' jest znakowany radioaktywnie (kroki 6 i 7). Kompleksy białko-RNA powiązane sieciowo są oczyszczane z wolnego RNA przy użyciu elektroforezy SDS-PAGE i transferu na membranę (krok 8). RNA jest odzyskiwane z membrany poprzez trawienie białka proteinazą K, co pozostawia polipeptyd w miejscu nukleotydu powiązanego sieciowo (krok 9). Odwrotna transkrypcja (RT) zostaje przerwana na pozostałym polipeptydzie, co wprowadza dwa rozszczepialne regiony adapterowe oraz sekwencje kodów kreskowych (krok 10). Selekcja wielkością usuwa wolny starter RT przed cyrkularyzacją. Następująca linearyzacja generuje odpowiednie matryce do amplifikacji PCR (kroki 1–15). Na koniec sekwencjonowanie wysokoprzepustowe generuje odczyty, w których sekwencje kodów kreskowych są bezpośrednio poprzedzone ostatnim nukleotydem cDNA (krok 16). Ponieważ nukleotyd ten znajduje się jedną pozycję powyżej (upstream) nukleotydu powiązanego sieciowo, miejsce wiązania można wyznaczyć z wysoką rozdzielczością.

analiza kompleksu białko-RNA hnRNP C, wynik elektroforezy, marker kDa, zaznaczony fragment błony.
Rycina 2. Autoradiogram kompleksów hnRNP C-RNA powiązanych sieciowaniem z zastosowaniem denaturującej elektroforezy żelowej i transferu na membranę. Kompleksy hnRNP C-RNA zostały oczyszczone immunologicznie z ekstraktów komórkowych przy użyciu przeciwciała przeciwko hnRNP C (α hnRNP C, próbki 3 i 4). RNA poddano częściowej trawieniu przy użyciu niskiego (+) lub wysokiego (++) stężenia RNazy. Można zaobserwować kompleksy przesunięte w górę względem wielkości białka (40 kDa) (próbka 4). Przesunięcie jest mniej wyraźne w przypadku zastosowania wysokich stężeń RNazy (próbka 3). Sygnał radiacyjny zanika, gdy w immunoprecypitacji nie zastosowano przeciwciała (próbki 1 i 2).

Schemat elektroforezy żelowej przedstawiający rozdział DNA pod względem wielkości, markery ścieżek, jasne i ciemnoniebieskie barwniki.
Rycina 3. Schemat 6% żelu TBE-mocznik (Invitrogen), służący jako wskazówka przy wycinaniu produktów iCLIP cDNA. Żel jest prowadzony przez 40 min przy napięciu 180 V, co pozwala na uzyskanie powtarzalnego wzoru migracji cDNA i barwników (jasnoniebieski i ciemnoniebieski) w żelu. Za pomocą żyletki należy wyciąć (czerwona linia) frakcje cDNA: wysoką (H), średnią (M) i niską (L). Należy rozpocząć od cięcia w połowie jasnoniebieskiego barwnika, bezpośrednio nad oznaczeniem na plastikowej kasecie żelowej. Należy rozdzielić frakcje średnią i niską, a frakcję wysoką przyciąć około 1 cm powyżej jasnoniebieskiego barwnika. Aby oddzielić poszczególne ścieżki (w tym przykładzie 1-4), należy wykonać cięcia pionowe, kierując się kieszeniami i barwnikiem. Ścieżka markera (m) może zostać zabarwiona i zobrazowana w celu kontroli wielkości fragmentów po wycięciu. Wielkości fragmentów są wskazane po prawej stronie.

Elektroforeza żelowa cDNA, primery i amplifikowane prążki cDNA; porównanie analizy wiązania białek.
Rysunek 4. Analiza bibliotek cDNA iCLIP amplifikowanych metodą PCR za pomocą elektroforezy żelowej. RNA odzyskano z błony (Rycina 1), następnie poddano odwrotnej transkrypcji oraz oczyszczaniu pod względem wielkości za pomocą denaturującej elektroforezy żelowej (Rycina 2). Odzyskano trzy frakcje cDNA o różnej wielkości: wysoką [H]: 120–200 nt, średnią [M]: 85–120 nt oraz niską [L]: 70–85 nt; następnie poddano je cyrkularyzacji, relinearyzacji i amplifikacji PCR. W wyniku zastosowania frakcji wejściowych o różnych rozmiarach można zaobserwować produkty PCR o różnym rozkładzie wielkości. Ponieważ starter PCR wprowadza 76 nt do cDNA, wielkości powinny mieścić się w zakresie 196–276 nt dla frakcji wysokiej, 161–196 nt dla średniej i 146–161 nt dla frakcji niskiej. Produkty PCR nie występują w próbkach, w których do immunoprecypitacji nie użyto przeciwciał (ścieżki 1–3).

Dyskusja

Ponieważ protokół iCLIP obejmuje szeroki zakres reakcji enzymatycznych i etapów oczyszczania, w przypadku niepowodzenia eksperymentu nie zawsze łatwo jest zidentyfikować problem. Aby kontrolować specyficzność zidentyfikowanych miejsc sieciowania RNA, przez cały przebieg eksperymentu oraz w późniejszych analizach obliczeniowych należy utrzymać jedną lub więcej kontroli negatywnych. Kontrolami tymi mogą być próbki bez przeciwciał, komórki niepoddane sieciowaniu lub immunoprecypitacja z tkanek bądź komórek z knockoutem. W idealnych warunkach eksperymenty kontrolne te nie powinny prowadzić do oczyszczenia żadnych kompleksów białko-RNA, a w konsekwencji nie powinny dawać sygnału na żelu SDS-PAGE ani wykazywać mierzalnych produktów po amplifikacji PCR. Sekwencjonowanie wysokoprzepustowe bibliotek kontrolnych powinno przynieść bardzo mało unikalnych sekwencji. Komórki z knockdownem nie są zalecane jako kontrola sekwencjonowania, ponieważ uzyskane sekwencje nadal odpowiadają miejscom sieciowania tego samego białka, które jest oczyszczane z komórek z knockdownem w mniejszych ilościach.

Należy również podjąć środki ostrożności, aby uniknąć kontaminacji produktami PCR z poprzednich eksperymentów. Najlepszym sposobem na zminimalizowanie tego problemu jest przestrzenne oddzielenie etapów przed- i po-PCR. Idealnie byłoby, gdyby analiza produktów PCR i wszystkie kolejne kroki były przeprowadzane w osobnym pomieszczeniu. Ponadto każdy członek laboratorium powinien używać własnego zestawu buforów i innych odczynników. W ten sposób łatwiej będzie zidentyfikować źródła kontaminacji.

Oświadczenia

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Autorzy dziękują wszystkim członkom laboratoriów Ule, Luscombe i Zupana za dyskusje oraz pomoc eksperymentalną. Dziękujemy Jamesowi Hadfieldowi i Nikowi Matthewsowi za sekwencjonowanie wysokoprzepustowe. Chcielibyśmy zaznaczyć, że opisana tutaj metoda iCLIP obejmuje kilka etapów wspólnych z oryginalnym protokołem CLIP, opracowanym przez Kirka Jensena i J.U. w laboratorium Roberta Darnella. Praca ta była finansowana z grantu Europejskiej Rady ds. Badań 206726-CLIP przyznanego J.U. oraz stypendium w ramach długoterminowego programu Human Frontiers Science Program przyznanego J.K.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Do elektroforezy żelowej i transferu na membranę zalecamy stosowanie zestawu XCell SureLock® Mini-Cell oraz XCell IIâ Blot Module Kit CE Mark (Invitrogen, EI0002), który jest kompatybilny z różnymi gotowymi minigelami określonymi w protokole. Marka i numer katalogowy wszystkich użytych materiałów są wymienione w trakcie opisu protokołu. Lista enzymów użytych w protokole znajduje się w poniższej tabeli.
Dynabeads z białkiem AInvitrogen10001Ddo przeciwciał mysich lub kozich należy użyć białka G
RNaza IAmbionAM2295aktywność może różnić się między partiami
Ligaza RNA T4 INew England BiolabsM0204S
PNKNew England BiolabsM0201S
proteinaza KRoche Group03115828001
odwrotna transkryptaza Superscript IIIInvitrogen18080044
Circligase IIEpicentre BiotechnologiesCL9021K
FastDigest® BamHIFermentasFD0054
AccuPrime™ SuperMix IInvitrogen12342010ta mieszanina PCR daje w naszych doświadczeniach najlepsze wyniki

Bibliografia

  1. Keene, J. D. RNA regulons: coordination of post-transcriptional events. Nat Rev Genet. 8, 533-543 (2007).
  2. Wang, Z., Burge, C. B. Splicing regulation: from a parts list of regulatory elements to an integrated splicing code. RNA. 14, 802-813 (2008).
  3. Trifillis, P., Day, N., Kiledjian, M. Finding the right RNA: identification of cellular mRNA substrates for RNA-binding proteins. RNA. 5, 1071-1082 (1999).
  4. Brooks, S. A., Rigby, W. F. Characterization of the mRNA ligands bound by the RNA binding protein hnRNP A2 utilizing a novel in vivo technique. Nucleic Acids Res. 28, E49-E49 (2000).
  5. Tenenbaum, S. A., Carson, C. C., Lager, P. J., Keene, J. D. Identifying mRNA subsets in messenger ribonucleoprotein complexes by using cDNA arrays. Proc Natl Acad Sci. 97, 14085-14090 (2000).
  6. Mili, S., Steitz, J. A. Evidence for reassociation of RNA-binding proteins after cell lysis: implications for the interpretation of immunoprecipitation analyses. RNA. 10, 1692-1694 (2004).
  7. Ule, J. CLIP identifies Nova-regulated RNA networks in the brain. Science. 302, 1212-1215 (2003).
  8. Ule, J., Jensen, K., Mele, A., Darnell, R. B. CLIP: A method for identifying protein-RNA interaction sites in living cells. Methods. 37, 376-386 (2005).
  9. Licatalosi, D. D. HITS-CLIP yields genome-wide insights into brain alternative RNA processing. Nature. 456, 464-469 (2008).
  10. Yeo, G. W. An RNA code for the FOX2 splicing regulator revealed by mapping RNA-protein interactions in stem cells. Nat Struct Mol Biol. 16, 130-137 (2009).
  11. Urlaub, H., Hartmuth, K., Lührmann, R. A two-tracked approach to analyze RNA-protein crosslinking sites in native, nonlabeled small nuclear ribonucleoprotein particles. Methods. 26, 170-181 (2002).
  12. König, J. iCLIP reveals the function of hnRNP particles in splicing at individual nucleotide resolution. Nat Struct Mol Biol. 17, 909-915 (2010).

Przedruki i uprawnienia

Sprostowanie


Formal Correction: Erratum: iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution
Posted by JoVE Editors on 7/14/2011. Citeable Link.

A correction was made to iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution. There was an error in part 2 of step 3. One of the characters had the incorrect symbol and was corrected to:

"...as well as 2 μl Turbo DNase..."

instead of:

"...as well as 2 ml Turbo DNase..."

Tagi

Sieciowanie UVimmunoprecypitacjabia ka wi ce RNAcyrkularyzacja cDNAelektroforeza elowasekwencjonowanie wysokoprzepustowe
iCLIP – Mapowanie oddziaływań białko-RNA w całym transkryptomie z rozdzielczością pojedynczych nukleotydów
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.