iCLIP - Mapowanie oddziaływań białko-RNA w całym transkryptomie z rozdzielczością poszczególnych nukleotydów

Podsumowanie

Przestrzenne rozmieszczenie białek wiążących RNA na transkryptach jest kluczowym wyznacznikiem regulacji potranskrypcyjnej. W związku z tym opracowaliśmy technologię sieciowania UV i immunoprecypitacji o rozdzielczości pojedynczego nukleotydu (iCLIP), która umożliwia precyzyjne mapowanie miejsc wiązania białka wiążącego RNA w całym genomie.

Streszczenie

Unikalny skład i przestrzenne rozmieszczenie białek wiążących RNA (RBP) na transkryptach kieruje różnorodnymi aspektami regulacji potranskrypcyjnej¹. Dlatego niezbędnym krokiem w kierunku zrozumienia regulacji transkryptu na poziomie molekularnym jest uzyskanie informacji o położeniu miejsc wiązania RBP².

Interakcje białko-RNA mogą być badane za pomocą metod biochemicznych, ale te podejścia nie dotyczą wiązania RNA w jego natywnym kontekście komórkowym. Początkowe próby badania kompleksów białko-RNA w ich środowisku komórkowym wykorzystywały oczyszczanie powinowactwa lub immunoprecypitację w połączeniu z wyświetlaniem różnicowym lub analizą mikromacierzy (RIP-CHIP)^3-5. Podejścia te były podatne na identyfikację interakcji pośrednich lub niefizjologicznych⁶. W celu zwiększenia swoistości i rozdzielczości pozycyjnej wprowadzono strategię określaną jako CLIP (UV cross-linking and immunoprecipitation)^7,8. CLIP łączy sieciowanie UV białek i cząsteczek RNA z rygorystycznymi schematami oczyszczania, w tym elektroforezą w żelu poliakrylamidowym z denaturacją. W połączeniu z wysokoprzepustowymi technologiami sekwencjonowania, CLIP okazał się potężnym narzędziem do badania interakcji białko-RNA w skali całego genomu (określanej jako HITS-CLIP lub CLIP-seq)^9,10. Niedawno wprowadzono PAR-CLIP, który wykorzystuje fotoreaktywne analogi rybonukleozydów do sieciowania^11,12.

Pomimo wysokiej szczegółowości uzyskanych danych, eksperymenty CLIP często generują biblioteki cDNA o ograniczonej złożoności sekwencji. Wynika to częściowo z ograniczonej ilości współoczyszczonego RNA i dwóch nieefektywnych reakcji ligacji RNA wymaganych do przygotowania biblioteki. Ponadto testy wydłużania starterów wykazały, że wiele cDNA przedwcześnie skraca się w usieciowanym nukleotydzie¹³. Tak obcięte cDNA są tracone podczas standardowego protokołu przygotowania biblioteki CLIP. Niedawno opracowaliśmy iCLIP (individual-nucleotide resolution CLIP), który wychwytuje skrócone cDNA, zastępując jeden z nieefektywnych etapów ligacji międzycząsteczkowego RNA bardziej wydajną wewnątrzcząsteczkową cyrkularyzacją cDNA (Figura 1)¹⁴. Co ważne, sekwencjonowanie skróconych cDNA zapewnia wgląd w położenie miejsca sieciowania w rozdzielczości nukleotydów. Z powodzeniem zastosowaliśmy iCLIP do badania organizacji cząstek hnRNP C w skali całego genomu i oceny jego roli w regulacji splicingu¹⁴.

Protokół

1. Sieciowanie komórkami tkanek za pomocą promieniowania UV

1. Usuń pożywkę i dodaj 6 ml lodowatego PBS do komórek hodowanych na 10-centymetrowej płytce (wystarcza na trzy eksperymenty).
2. Zdejmij pokrywkę i umieść na lodzie. Napromieniować jednokrotnie 150 mJ/^cm2 przy długości fali 254 nm.
3. Zbierz komórki, zeskrobując je podnośnikiem do komórek.
4. Przenieść 2 ml zawiesiny komórek do każdej z trzech mikroprobówek. Wirować z maksymalną prędkością przez 10 sekund w temperaturze 4°C, aby osadzać komórki, a następnie usunąć supernatant.
5. Zatrzaskowo zamroź granulki komórek na suchym lodzie i przechowuj w temperaturze -80°C do momentu użycia.

2. Przygotowanie koralików

1. Dodaj 100 μl białka A Dynabeads (Dynal, 100.02) na eksperyment do świeżej mikroprobówki (Użyj białka G Dynabeads dla przeciwciał myszy lub kozy).
2. Kulki płuczące 2x z buforem do lizy (50 mM Tris-HCl, pH 7,4; 100 mM NaCl; 1% NP-40; 0,1% SDS; 0,5% deoksycholan sodu; 1/100 koktajl inhibitorów proteazy III, Calbiochem).
3. Ponownie zawiesić kulki w 100 μl buforze do lizy z przeciwciałem 2-10 μg.
4. Obracaj probówki w temperaturze pokojowej przez 30-60 minut.
5. Przemyć 3x buforem do lizy 900 μl i pozostawić w ostatnim praniu, aż będzie gotowy do przejścia do kroku 4.1.

3. Liza komórek i częściowe trawienie RNA

1. Zawiesić osad komórkowy w 1 ml buforze do lizy i przenieść do mikroprobówek o pojemności 1,5 ml.
2. Przygotować rozcieńczenie 1/500 RNazy I (Ambion, AM2295). Dodać 10 μl rozcieńczenia RNazy I, jak również 2 μl Turbo DNazy do lizatu komórkowego (do przygotowania biblioteki stosuje się rozcieńczenia 1/500 RNazy I [niska RNaza]; rozcieńczenia 1/50 [wysoka RNaza] są konieczne do kontroli swoistości przeciwciał).
3. Inkubować próbki dokładnie przez 3 minuty w temperaturze 37 °C, wytrząsając z prędkością 1 100 obr./min. Natychmiast przenieś na lód.
4. Wirować w temperaturze 4°C i 22 000 g przez 20 minut, aby usunąć lizat. Ostrożnie zebrać sklarowany osad (pozostawić około 50 μl lizatu z osadem).

4. Immunoprecypitacja

1. Usuń bufor do płukania z kulek (z kroku 2.5), a następnie dodaj lizat komórkowy (z kroku 3.4).
2. Obracać próbki przez 2 godziny w temperaturze 4°C.
3. Odrzucić supernatant i przemyć kulki 2x 900 μl buforu o wysokiej zawartości soli (50 mM Tris-HCl, pH 7,4; 1 M NaCl; 1 mM EDTA; 1% NP-40; 0,1% SDS; 0,5% deoksycholanu sodu).
4. Przemyć 2x 900 μl buforem do przemywania (20 mM Tris-HCl, pH 7,4; 10 mM MgCl₂; 0,2% Tween-20).

5. Defosforylacja końców RNA 3

1. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić kulki w 20 μl mieszanki PNK (15 μl wody; 4 μl 5x bufor PNK pH 6,5 [350mMTris-HCl, pH 6,5; 50mMMgCl₂ 25mMdithiothreitol]; 0,5 μl enzymu PNK; 0,5 μl RNasin [Promega]).
2. Inkubować przez 20 minut w temperaturze 37°C.
3. Dodaj 500 μl buforu do przemywania i przemyj 1x buforem o wysokiej zawartości soli.
4. Przemyć 2x buforem do płukania.

6. Ligacja łącznika do RNA 3' kończy się

1. Ostrożnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić kulki w 20 μl mieszaniny do ligacji (9 μl wody; 4 μl 4x bufor do ligacji [200 mMTris-HCl; 40 m MM gCl₂; 40 mM ditiotreitol]; 1 μl ligazy RNA [NEB]; 0,5 μl RNasin [Promega]; 1,5 μl wstępnie adenylowany łącznik L3 [20 μM]; 4 μl PEG400 [81170, Sigma]).
2. Inkubować przez noc w temperaturze 16°C.
3. Dodać 500 μl buforu do płukania, a następnie przemyć 2x 1 ml buforu o wysokiej zawartości soli.
4. Przemyć 2x 1 ml buforu do płukania i pozostawić w 1 ml drugiego płukania.

7. Etykietowanie końca RNA 5'

1. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić kulki w 8 μl gorącej mieszanki PNK (0,4 μl PNK [NEB]; 0,8 μl ³²P-γ-ATP; 0,8 μl 10x bufor PNK [NEB]; 6 μl wody).
2. Inkubować przez 5 minut w temperaturze 37°C.
3. Usuń gorącą mieszankę PNK i ponownie zawieś kulki w 20 μl 1x bufor ładujący Nupage (Invitrogen).
4. Inkubować na termomikserze w temperaturze 70°C przez 10 minut.
5. Natychmiast umieść na magnesie, aby wytrącić puste kulki i załaduj supernatant na żel (patrz krok 8).

8. SDS-PAGE i transfer membranowy

1. Załaduj próbki na 4-12% żel NuPAGE Bis-Tris (Invitrogen) zgodnie z instrukcjami producenta. Użyj 0,5 l 1x bufora do biegania MOPS (Invitrogen). Załaduj również 5 μl wstępnie wybarwionego markera wielkości białka (na przykład linijka PAGE plus, Fermentas, SM1811).
2. Uruchom żel na 50 minut przy napięciu 180 V.
3. Usuń czoło żelu i wyrzuć jako odpad stały (zawiera wolne radioaktywne ATP).
4. Przenieść kompleksy białko-RNA z żelu do membrany nitrocelulozowej za pomocą aparatu do mokrego przenoszenia Novex zgodnie z instrukcjami producenta (Invitrogen, przenieść 1 godzinę przy 30 V).
5. Po transferze należy przepłukać membranę w buforze PBS, a następnie zawinąć ją w folię saran i naświetlić folią Fuji w temperaturze -80°C (obok membrany należy umieścić naklejkę fluorescencyjną, aby później wyrównać folię i membranę; wykonuj naświetlanie przez 30 minut, 1 godzinę i ponad noc).

9. Izolacja RNA

1. Wyizoluj kompleksy białko-RNA z eksperymentu o niskiej zawartości RNazy, używając autoradiogramu z kroku 8.5 jako maski. Pokrój ten kawałek błony na kilka małych plasterków i umieść je w mikroprobówce o pojemności 1,5 ml.
2. Dodać 200 μl buforu PK (100 mM Tris-HCl pH 7,4; 50 mM NaCl; 10 mM EDTA) i 10 μl proteinazy K (Roche, 03115828001) do kawałków błony. Inkubować wytrząsając z prędkością 1 100 obr./min przez 20 minut w temperaturze 37°C.
3. Dodać 200 μl buforu PKurea (100 mM Tris-HCl pH 7,4; 50 mM NaCl; 10 mM EDTA; 7 M mocznika) i inkubować przez 20 minut w temperaturze 37°C.
4. Zebrać roztwór i dodać go razem z 400 μl RNA fenolu/chloroformu (Ambion, 9722) do 2 ml ciężkiej probówki z żelem Phase Lock Gel (713-2536, VWR).
5. Inkubować przez 5 minut w temperaturze 30°C, wstrząsając z prędkością 1 100 obr./min. Rozdziel fazy, wirując przez 5 minut z prędkością 13 000 obr./min w temperaturze pokojowej.
6. Przenieś warstwę wodną do nowej probówki (należy uważać, aby nie dotknąć żelu pipetą). Dodać 0,5 μl glycoblue (Ambion, 9510) i 40 μl 3 M octanu sodu o pH 5,5 i wymieszać. Następnie dodać 1 ml 100% etanolu, ponownie wymieszać i wytrącić przez noc w temperaturze -20°C.

10. Odwrotna transkrypcja

1. Wirować przez 20 minut przy 15 000 obr./min i temperaturze 4°C. Usunąć supernatant i umyć granulat 0,5 ml 80% etanolu.
2. Zawiesić osad w 7,25 μl mieszaniny RNA/startera (6,25 μl wody; 0,5 μl startera Rclip [0,5 pmol/μl]; 0,5 μl mieszanki dNTP [10mM]). Dla każdego eksperymentu lub powtórzenia należy użyć innego startera Rclip zawierającego indywidualne sekwencje kodów kreskowych (patrz 14).
3. Inkubować przez 5 minut w temperaturze 70°C, a następnie schłodzić do temperatury 25°C.
4. Dodać 2,75 μl mieszanki RT (2 μl 5x bufor RT; 0,5 μl 0,1M DTT; 0,25 μl indeksu górnego III odwrotnej transkryptazy [Invitrogen]).
5. Inkubować 5 minut w temperaturze 25°C, 20 minut w temperaturze 42°C, 40 minut w temperaturze 50°C i 5 minut w temperaturze 80°C, a następnie schłodzić do temperatury 4°C.
6. Dodać 90 μl buforu TE, 0,5 μl glycoblue i 10 μl octanu sodu o pH 5,5 i wymieszać. Następnie dodać 250 μl 100% etanolu, ponownie wymieszać i wytrącać przez noc w temperaturze -20°C.

11. Oczyszczanie cDNA w żelu

1. Odwirować i umyć próbki (patrz 10.1), a następnie ponownie zawiesić granulki w 6 μl wody.
2. Dodać 6 μl 2x TBE-mocznik bufor ładujący (Invitrogen). Podgrzewaj próbki do temperatury 80°C przez 3 minuty bezpośrednio przed załadunkiem.
3. Załadować próbki do prefabrykowanego 6% żelu TBE-mocznik (Invitrogen) i pracować przez 40 minut pod napięciem 180 V, zgodnie z opisem producenta. Załaduj również marker o niskiej masie cząsteczkowej do późniejszego cięcia (patrz poniżej).
4. Wytnij trzy pasma przy 120-200 nt (wysoki), 85-120 nt (średni) i 70-85 nt (niski). Użyj górnego barwnika i śladów na plastikowym wsporniku żelu, aby poprowadzić wycięcie (patrz rysunek 3). Zauważ, że starter Rclip i sekwencja L3 razem odpowiadają za 52 nt sekwencji CLIP.
5. Dodać 400 μl TE i rozdrobnić plasterek żelu na małe kawałki za pomocą tłoka strzykawki o pojemności 1 ml. Inkubować wytrząsając z prędkością 1 100 obr./min przez 2 godziny w temperaturze 37°C.
6. Umieść dwa szklane filtry wstępne o średnicy 1 cm (Whatman, 1823010) w kolumnie Costar SpinX (Corning Incorporated, 8161). Przenieść płynną część próbki do kolumny. Wirować przez 1 minutę z prędkością 13 000 obr./min do probówki o pojemności 1,5 ml.
7. Dodać 0,5 μl glycoblue i 40 μl octanu sodu o pH 5,5, a następnie wymieszać próbkę. Dodać 1 ml 100% etanolu, ponownie wymieszać i wytrącić przez noc w temperaturze -20°C.

12. Ligacja startera do końca 5' cDNA

1. Odwirować i przepłukać próbki (patrz 10.1), a następnie ponownie zawiesić granulki w 8 μl mieszaniny ligacyjnej (6,5 μl wody; 0,8 μl 10x bufor CircLigase II; 0,4 μl 50 mM MnCl₂; 0,3 μl; Circligaze II [Epicentrum]) i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 60°C.
2. Dodać 30 μl oligonudożynkowej mieszanki (26 μl wody; 3 μl buforu FastDigest [Fermentas]; 1 μl cut_oligo [10 μM]). Inkubować przez 1 minutę w temperaturze 95°C. Następnie zmniejszaj temperaturę co 20 sekund o 1°C, aż do osiągnięcia 25°C.
3. Dodać 2 μl BamHI (Fast Fermentas) i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37°C.
4. Dodaj 50 μl TE i 0,5 μl glycoblue i wymieszaj. Dodaj 10 μl octanu sodu o pH 5,5 i wymieszaj, a następnie dodaj 250 μl 100% etanolu. Wymieszaj ponownie i wytrącaj przez noc w temperaturze -20°C.

13. Amplifikacja PCR

1. Odwirować i umyć próbki (patrz 10.1), a następnie ponownie zawiesić osad w 19 μl wody.
2. Przygotować mieszaninę PCR (19 μl cDNA; 1 μl mieszaniny starterów P5/P3 solexa, po 10 μM; 20 μl enzymu Accuprime Supermix 1 [Invitrogen]).
3. Uruchom następujący program PCR: 94°C przez 2 minuty, [94°C przez 15 sekund, 65°C przez 30 sekund, 68°C przez 30 sekund]_{25-35 cykli}, 68°C przez 3 minuty, 4°C zawsze.
4. Wymieszaj 8 μl produktu PCR z 2 μl 5x bufora ładującego TBE i załaduj na prefabrykowany 6% żel TBE (Invitrogen). Wybarwić żel preparatem Sybrgreen I (Invitrogen) i przeanalizować za pomocą imagera żelowego.
5. Kod kreskowy w starterach Rclip umożliwia multipleksowanie różnych próbek przed przesłaniem w celu sekwencjonowania o wysokiej przepustowości. Prześlij 15 μl biblioteki do sekwencjonowania, a resztę przechowuj.

14. Sekwencje łączników i starterów

Pre-adenylowane DNA łącznika 3':

[Zamawiamy adapter DNA z IDT, a następnie robimy porcje 20μM.]

15. Reprezentatywne wyniki:

Przed sekwencjonowaniem biblioteki iCLIP, sukces eksperymentu może być monitorowany w dwóch etapach: autoradiogram kompleksu białko-RNA po transferze błony (krok 8.5) oraz obraz żelowy produktów PCR (krok 13.4). Na autoradiogramie próbek o niskiej zawartości RNazy radioaktywność rozproszona powinna być widoczna powyżej masy cząsteczkowej białka (ryc. 2, próbka 4). W przypadku próbek o wysokiej zawartości RNazy promieniotwórczość ta jest skoncentrowana bliżej masy cząsteczkowej białka (ryc. 2, próbka 3). Gdy w immunoprecypitacji nie stosuje się przeciwciała, nie należy wykrywać żadnego sygnału (ryc. 2, próbki 1 i 2). Kolejne ważne kontrole swoistości immunoprecypitacji albo pomijają promieniowanie UV, albo wykorzystują komórki, które nie wyrażają interesującego białka¹⁴.

Obraz żelu produktów PCR (krok 13.4) powinien pokazywać zakres rozmiarów, który odpowiada frakcji cDNA (wysokiej, średniej lub niskiej) oczyszczonej w kroku 11.4 (Rysunek 4, pasy 4-6). Należy zauważyć, że startery PCR P3Solexa i P5Solexa wprowadzają dodatkowe 76 nt do wielkości cDNA. Jeśli podczas immunoprecypitacji nie zostanie użyte żadne przeciwciało, nie należy wykrywać odpowiednich produktów PCR (ryc. 4, pasy 1-3). Produkt dimeru podkładowego może pojawić się po około 140 nt.

Reprezentatywne wyniki wysokoprzepustowego sekwencjonowania i późniejszych analiz bioinformatycznych patrz¹⁴.

Rysunek 1. Schematyczne przedstawienie protokołu iCLIP. Kompleksy białko-RNA są sieciowane kowalencyjnie in vivo przy użyciu promieniowania UV (etap 1). Białko będące przedmiotem zainteresowania jest oczyszczane razem ze związanym RNA (kroki 2-5). Aby umożliwić specyficzne dla sekwencji zapoczątkowanie odwrotnej transkrypcji, adapter RNA jest ligowany do końca 3' RNA, podczas gdy koniec 5' jest znakowany radioaktywnie (kroki 6 i 7). Usieciowane kompleksy białko-RNA są oczyszczane z wolnego RNA za pomocą SDS-PAGE i transferu błonowego (krok 8). RNA jest odzyskiwane z błony przez trawienie białka proteinazą K, pozostawiając polipeptyd pozostający w nukleotydzie sieciującym (etap 9). Odwrotna transkrypcja (RT) obcina pozostały polipeptyd i wprowadza dwa rozszczepialne regiony adaptera i sekwencje kodów kreskowych (krok 10). Wybór rozmiaru usuwa wolny podkład RT przed cyrkularyzacją. Poniższa linearyzacja generuje odpowiednie szablony do amplifikacji PCR (kroki 11-15). Wreszcie, sekwencjonowanie o wysokiej przepustowości generuje odczyty, w których sekwencje kodów kreskowych są natychmiast poprzedzane ostatnim nukleotydem cDNA (krok 16). Ponieważ nukleotyd ten znajduje się w jednej pozycji przed usieciowanym nukleotydem, miejsce wiązania można wydedukować z wysoką rozdzielczością.

Rysunek 2. Autoradiogram usieciowanych kompleksów c-rna hnRNP z wykorzystaniem elektroforezy żelowej denaturującej i transferu błonowego. Kompleksy c-rna hnRNP oczyszczono immunologicznie z ekstraktów komórkowych przy użyciu przeciwciała przeciwko hnRNP C (α hnRNP C, próbki 3 i 4). RNA było częściowo trawione przy użyciu niskiego (+) lub wysokiego (++) stężenia RNazy. Można zaobserwować przemieszczanie się kompleksów w górę w stosunku do wielkości białka (40 kDa) (próbka 4). Przesunięcie jest mniej wyraźne, gdy zastosowano wysokie stężenia RNazy (próbka 3). Sygnał radioaktywny zanika, gdy w immunoprecypitacji nie użyto przeciwciała (próbki 1 i 2).

Rysunek 3. Schemat 6% żelu mocznikowego TBE (Invitrogen) do wspomagania wycinania produktów cDNA iCLIP. Żel jest uruchamiany przez 40 minut pod napięciem 180 V, co prowadzi do powtarzalnego wzorca migracji cDNA i barwników (jasnoniebieskiego i ciemnoniebieskiego) w żelu. Użyj żyletki, aby przeciąć (czerwona linia) wysokie (H), średnie (M) i niskie (L) frakcje cDNA. Zacznij od wycięcia w środku jasnoniebieskiego barwnika i bezpośrednio nad oznaczeniem na plastikowej kasecie żelowej. Podziel średnią i niską frakcję i przytnij wysoką frakcję około 1 cm powyżej jasnoniebieskiego barwnika. Użyj pionowych nacięć prowadzonych przez kieszenie i barwnik, aby oddzielić różne pasy (w tym przykładzie 1-4). Pas znacznika (m) można barwić i obrazować w celu kontrolowania rozmiarów po cięciu. Rozmiary fragmentów są wskazane po prawej stronie.

Rysunek 4. Analiza bibliotek cDNA iCLIP amplifikowanych PCR przy użyciu elektroforezy żelowej. RNA odzyskane z błony (ryc. 1) poddano odwrotnej transkrypcji i oczyszczono pod względem wielkości za pomocą elektroforezy żelowej denaturującej (ryc. 2). Trzy frakcje cDNA (wysoka [H]: 120-200 nt, średnia [M]: 85-120 nt i niska [L]: 70-85 nt) zostały odzyskane, okrężne, ponownie zlinearyzowane i amplifikowane PCR. Produkty PCR o różnym rozkładzie wielkości można zaobserwować w wyniku różnych rozmiarów frakcji wejściowych. Ponieważ starter PCR wprowadza 76 nt do cDNA, rozmiary powinny mieścić się w zakresie 196-276 nt dla frakcji wysokich, 161-196 nt dla średnich i 146-161 nt dla frakcji o niskiej wielkości. Produkty PCR są nieobecne, gdy do immunoprecypitacji nie użyto przeciwciał (pasy 1-3).

Dyskusja

Ponieważ protokół iCLIP obejmuje różnorodny zakres reakcji enzymatycznych i etapów oczyszczania, nie zawsze łatwo jest zidentyfikować problem, gdy eksperyment się nie powiedzie. W celu kontroli swoistości zidentyfikowanych miejsc usieciowania RNA, jedna lub więcej kontroli ujemnych powinna być utrzymana przez cały czas trwania całego eksperymentu i późniejszych analiz obliczeniowych. Te kontrole mogą być próbką bez przeciwciał, komórkami nieusieciowanymi lub immunoprecypitacją z komórek lub tkanek nokautowych. Idealnie byłoby, gdyby te eksperymenty kontrolne nie oczyszczały żadnych kompleksów białko-RNA, a zatem nie powinny dawać żadnego sygnału na żelu SDS-PAGE ani żadnych wykrywalnych produktów po amplifikacji PCR. Sekwencjonowanie o wysokiej przepustowości tych bibliotek kontrolnych powinno zwrócić bardzo niewiele unikatowych sekwencji. Knockdown cells nie jest zalecane jako kontrola sekwencjonowania, ponieważ powstałe sekwencje nadal odpowiadają miejscom usieciowania tego samego białka, które jest oczyszczane z komórek knockdown w mniejszych ilościach.

Należy również podjąć środki ostrożności w celu uniknięcia zanieczyszczenia produktami PCR z poprzednich eksperymentów. Najlepszym sposobem na zminimalizowanie tego problemu jest przestrzenne oddzielenie etapów przed i po PCR. Idealnie byłoby, gdyby analiza produktów PCR i wszystkie kolejne kroki były wykonywane w oddzielnym pomieszczeniu. Ponadto każdy członek laboratorium powinien korzystać z własnego zestawu i innych odczynników. W ten sposób można łatwiej zidentyfikować źródła zanieczyszczeń.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Do elektroforezy żelowej i transferu membranowego zalecamy użycie XCell SureLock® Mini-komórka i XCell IIâ Zestaw modułów Blot Znak CE (Invitrogen, EI0002), który jest kompatybilny z użyciem różnych prefabrykatów miniżelowych, które są określone w całym protokole. Marka i numer zamówienia wszystkich użytych materiałów jest wymieniony w protokole. Listę enzymów użytych w protokole przedstawia poniższa tabela.
Białko A Dynabeads	Invitrogen	10001D	użyj białka G dla myszy lub kozy przeciwciało
RNaza I	Ambion	AM2295	aktywność może się zmieniać z partii na partię
Ligaza T4 RNA I	New England Biolabs	M0204S
PNK	New England Biolabs	M0201S
proteinaza K	Roche Group	03115828001
Indeks górny III odwrotna transkryptaza	Invitrogen	18080044
Circligase II	Epicentre Biotechnologies	CL9021K
FastDigest® BamHI	Fermentas	FD0054
AccuPrime™ SuperMix I	Invitrogen	12342010	ta mieszanka PCR daje najlepsze efekty w naszych rękach